Summary
SINEUPs は、合成アンチセンス非コード Rna 結合ドメイン (BD) とエフェクター ドメイン (ED) 含みの翻訳を調整するターゲット mRNA。ここでは、培養細胞、西部のしみ方と半自動化されたハイスループット イメージング システムによって翻訳推進活動の分析の SINEUPs の検出方法について述べる.
Abstract
ターゲット蛋白質の強化は重要な生物学的プロセスの研究のみならず治療、バイオ テクノロジーのアプリケーションです。ここでは、選択的に、培養細胞に必要な遺伝子の蛋白質発現のアップを非コード Rna SINEUPs として知られている合成のアンチセンスによる規制する手法を提案します。この肯定的な遺伝子発現制御は、転写後のレベルと反転短い散在させていて核要素 (正弦波) SINEUPs の 3ʹ の端に繰り返しによって出されるで構成そのエフェクター ドメイン (ED)。SINEUPs 具体的には、その結合ドメイン (BD) 5ʹ 非翻訳領域 (UTR 5ʹ) 内および mRNA の開始コドン周辺のシーケンスを補完するために設計された地域を選択の任意の蛋白質のコーディングの mRNA にバインドできます。この方法で設計された特定のターゲット SINEUPs は培養細胞にトランスフェクションし、下流解析では、一般的に 24-48 時間後トランスフェクションのタンパク質と RNA を抽出します。西部のしみの分析によって SINEUP 誘起タンパク質発現が検出され、リアルタイムの定量的逆転写 PCR を用いて RNA 発現。我々 は、BD 設計最適 SINEUP 活動とさまざまな BD サイズと mRNA の推奨ターゲットの開始コドン位置のテストを達成するため重要であることを観察しました。したがって、我々 はここで緑色蛍光タンパク質 (GFP) と融合した mRNA ターゲットに実装することができます蛍光検出に基づく半自動化されたハイスループット イメージング法を記述します。SINEUPs 具体的にターゲットの転写レベルを変更することがなく、セルの通常の生理的な範囲内での翻訳を強化します。このメソッドは、さまざまな人間、マウス、および生体内のシステムと一緒に昆虫培養細胞で、内因性と外因性の目標の範囲に対して正常に採用されています。また、抗体産生を高め、RNA 遺伝子のハプロ不全に対する治療として動作する SINEUPs が報告されています。SINEUPs の汎用性とモジュラー性質は遺伝子特異的並進制御のための適切なツールをさせます。
Introduction
ポストゲノム時代の多くの洞察力は、次世代シーケンシング技術1,2,3の開発によりアンチセンス転写産物を非コーディングの遺伝子の調節的役割に得たされていると遺伝子編集ツール。「転写ゴミ箱」だった以前と考えられ、成績証明書、このカテゴリが遺伝的調節の重要なプレーヤーとして確立されます。アンチセンス転写産物は、クロマチンと制御の安定性とその同種蛋白質のコーディング意味 mRNA4,の5式調節するのに報告されます。ほとんどの場合、規制のこのモードは負とアンチセンス転写産物から RNA 相互作用6,7意味相手を黙らせます。合成低分子干渉 RNA (siRNA)、マイクロ Rna (miRNA) およびアンチセンス oligos (阿蘇)8,9,10 の形で必要なレセプター遺伝子を自然のアンチセンス転写産物のこの特性が利用されています ,11の技術ボイドを残してターゲット遺伝子発現。
1 つの興味をそそる研究の長い非コード Rna そのアンチセンスを示すことによってアンチセンス RNA フィールドの視点を変更 (lncRNAs) としてUchl1 (ユビキチンの C 末端加水分解酵素 L1) Uxt (普遍的表現ノート) の遺伝子のその同系の翻訳を正に制御するマウス12の転写レベルでの mRNA の意味します。これらの 5ʹ エンド lncRNAs は彼らの対応する感覚の転写産物の 5ʹ 非翻訳領域 (UTR 5ʹ) に複数拠点と重複し、非重複 3ʹ 端がショートに属するレトロトランスポゾンの逆にされた繰り返しを含む散在核要素 (正弦波) 家族。興味深いことに、この翻訳を制御の背後にある主要な原動力である埋め込みサインを繰り返し、正弦を繰り返すだけのマウスに限定されるわけでわかった人間 Alu の繰り返しを含む lncRNAs はまたターゲット意味 Mrna の翻訳を強化、非コード Rna、正弦波駆動規制アンチセンスの新規クラスの考えを補強適切に名前 SINEUPs13。最近の研究は、様々 な内因性と外因性の遺伝子、特にターゲットに設計された合成 SINEUPs で自然な SINEUPs の可能性が保持されることを示した14,15。SINEUPs は、2 つの重要な機能を持っている: 最初の「結合ドメイン」(BD) プライマリを包括的なシーケンスに補足 5ʹ エンド部は一般的に蛋白質のコーディングの mRNA のコドンを起動し、2 番目の「エフェクター ドメイン」(ED) が組み込まれていますので、SINEUP 関数14 (図 1) のための前提条件である正弦波の繰り返しを反転します。SINEUPs は、具体的ターゲット遺伝子選択の BD をデザインにカスタマイズできます。従来 mRNA 発現戦略へのより良い代替手段として生物学的経路に関与する特定の遺伝子の機能を分析するために利用できます。抗体の生産を後押しするこの多目的なツールを適用ことができますまた、タンパク質16,17,18、不十分な投与量に起因するハプロ不全疾患の治療薬として 19,20,21。
SINEUP 技術の利点は多様です。転写レベルでターゲットの表現は変更されません。長い BDs はない15dsRNA に依存した応答を誘導しながら SINEUPs により特異性を提供します。タンパク質誘導は異常または過剰な蛋白質の表現のための任意の有害な影響を防止する、細胞の正常な生理学的範囲内に維持されます。さまざまなマウス、人間と互換性のある SINEUPs とハムスター培養細胞、例えば、HEK293T/17、hepg2 細胞、hela 細胞、町、MN9D、および多くより12,13,14,15,18 ,19。内因性遺伝子、一過性発現遺伝子、およびタグ付きのフラグまたはルシフェラーゼ融合遺伝子、遺伝子特異的抗体14,18の必要性を排除 SINEUPs 効率的にターゲットにできます。SINEUP の基礎的解析ルーチンの培養、トランスフェクション、ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)、リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) 機器および設定が必要ですし、短時間で専門知識を得ることができます。
ここでは、合成 SINEUPs 翻訳、RNA 干渉9阿蘇 gapmers11,22,23など他の技術とは異なり効果を調節する遺伝子をターゲットする方法をについて説明します。RNA 誘導遺伝子の活性化のための広く使われているメソッドはクラスター化された空間定期的に短い回文繰り返しベースのアクティブ化 (CRISPRa) 遺伝子の発現が転写レベル24でトリガーされる場所。シンプルかつ高速で、このメソッドでは、複数単一ガイド Rna (sgRNAs)、高効率の同じ遺伝子をターゲットとターゲットをバインディング25の可能性が高まる必要があります。なお、CRISPRa システムの鍵酵素、触媒死んで CRISPR 関連タンパク質 9 (dCas9) は、低結合特異性と sgRNAs ターゲット双方向性プロモーター領域が非具体的を調整遺伝子25近くです。逆に、SINEUPs は高い特異性を単一結合領域での mRNA のターゲットをバインドし、近くの遺伝子の発現には影響を与えません。SINEUP デザイン、トランスフェクション、タンパク質、RNA 発現解析の基本的な手順をについて説明します。さらに、システムを提案、半自動、高スループット イメージング複数 SINEUPs を一度に画面に最適な SINEUPs の発見に有用であります。
Protocol
1. ターゲット Mrna の構成 SINEUP の BDs のデザイン
- 転写開始サイト (TSS) とターゲット興味のセルの Mrna の翻訳開始サイトをチェックしてください。エンコードとファントムの両方のプロジェクト (遺伝子発現、ケージのキャップ分析) から TSS データ集録 (ぜんぶ: http://fantom.gsc.riken.jp/zenbu/)。
- ブラウザーを開き、興味のある遺伝子の検索やケージのピークで TSS をチェックします。
- セルおよびティッシュ特定 TSS のパーキンソン病タンパク質 7 (PARK7) の分析の例を参照してください図 2に示す mRNA。
- デザイン 40 に対応するいくつかの異なる長さの BD シーケンス拠点最初のメチオニン (8 月)、72 の下流の上流と 32 拠点合計で nt。
- カスタム注文設計の BDs SINEUP 発現ベクター (材料の表を参照してください)。
注:オフターゲット効果26を避けるために基本的なローカル配列検索ツール (ブラスト) によって配列特異性をチェックします。
2. 細胞培養とトランスフェクション SINEUP
- シード 6 ウェル プレートや SINEUPs の前に 24 時間 24 ウェル プレートに興味のセルです。人間の萌芽期の腎臓の細胞株 (HEK293T/17) の場合 (材料の表を参照)、種子 0.5 x 106セルよく、ポリ-D-リジン コーティング 24 ウェル プレートのウェルあたり 6 ウェル プレートまたは 1.5 x 10 の5セルのあたり (材料の表を参照してください)。それは 24 h 後 70% 合流になります。
- 24 h 後媒体を 1.5 mL 6 ウェル プレートの新鮮な媒体または 24 ウェル プレートに新鮮な媒体の 0.4 mL に変更します。SINEUP GFP の場合 transfect pEGFP C2 の 0.6 μ g (材料の表を参照してください)、3.4 μ g pEGFP C2 の 6 ウェル プレートまたは 130 ng と 670 の 1 つの井戸の SINEUP GFP のトランスフェクション試薬 (6 ウェル プレートと 3 μ で 10 μ L と 24 ウェル プレートの 1 つの井戸の SINEUP GFP の ng24 ウェル プレート L) 製造元の指示に従って (材料の表を参照)、し、37 ° c 24 時間 5 %co2 インキュベーターで孵化させなさい。
- リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) (37 mM の NaCl、8 mM Na2HPO4、2.6 mM 1.5 mM の KCl KH2PO4) 6 ウェル プレートの各ウェルに 2 mL または 0.5 mL の PBS 24 ウェル プレートの各ウェルに、細胞を洗浄します。ポリ-D-リジン コーティング 24 ウェル プレートは体積トリプシンあたり 0.05% の重量の 25 μ L 5 分 5% CO2インキュベーターで孵化し、275 μ L/ウェル細胞用培地を追加します。6 ウェル プレートの場合に、各ウェルに 2 mL の PBS を追加します。収穫 (6 ウェル プレート用 1.5 mL) または 24 ウェル プレートの 225 μ L 細胞蛋白質の抽出 (蛋白質の抽出のためのプロトコル 3 に行く)、1 の 3/4、1/4 のセル (6 ウェル プレート用 0.5 mL) または 24 ウェル プレート用 75 μ L の上下にピペットで移しなさいRNA の抽出および 6,000 x g で 4 ° C (RNA の抽出のステップ 5 に進む) で 5 分間遠心します。
注:イメージングによって、ポリ-D-リジン コーティング 24 ウェル プレートの SINEUP GFP の影響を分析します。手順 7 (画像解析) に進みます。
3. 蛋白質の抽出
- 慎重に 1.5 mL の PBS を吸引、溶解液 (20 mM トリス-HCl (pH 7.5) 150 mM の NaCl、ナ2EDTA、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1% (w/v) トリトン、ピロりん酸ナトリウム 2.5 mM、1 mM β-グリセロリン酸、1 mM Na3VO4 1 mM の 140 μ L を追加、1 μ g/mL leupeptin と 0.005% (w/v) 特異フッ化物 (PMSF)) (材料表参照) 細胞ペレットに 24 ウェル プレートの 6 ウェル プレートまたは 60 μ L の。
- ピペッティングして混合し、4 ° C で 1 時間遅い速度で回転させることにより徹底的にミックス4 ° C で 10 分間 14,000 × gで遠心して上清を収集します。
-
比色定量法による蛋白質の集中を確認 (材料の表を参照してください)。室温でのすべての反応を準備します。
- 準備純水標準ウシ血清アルブミン (BSA) 蛋白質の 5-6 倍希釈濃度 0.2 1.5 に至る mg/mL タンパク質。毎回新鮮な基準を準備します。
- 試薬 S の 20 μ L (界面活性剤) で試薬 (アルカリ銅酒石酸溶液) の 1 mL を混合することによって作業試薬 Aʹ を準備します。
- 水 (マイナス コントロール)、BSA の標準 (タンパク質標準および肯定的な制御) または 96 ウェル プレートの各ウェルに蛋白質のサンプルの 5 μ L をロードします。
- 各ウェルに試薬 Aʹ の 25 μ L を追加します。慎重によく任意の気泡を避けるあたり試薬 (Folin 試薬) B の 200 μ L を追加します。アルミ箔と板をカバーし、5-10 分待ちます。
- 750 でタンパク質の吸光度を測定分光光度計の nm。吸光度は、少なくとも 1 時間のため安定しています。
- X 軸と y 軸にそれぞれの吸光度をプロットの BSA 標準タンパク質濃度 (mg/mL) 標準曲線を準備します。標準曲線の方程式を適用することによってサンプルの蛋白質の集中を計算します。
注:必要な場合は、この手順でプロトコルを一時停止または手順 4 に進みます。長期保存のためスナップは液体窒素、-80 ° C の店で蛋白質のサンプルを凍結します。
4. SDS のページおよび抗体 (ウエスタン ・ ブロット分析) とターゲット蛋白質の検出で蛋白質の分離
- ローディングの染料 × 2 の 1 つのボリュームを追加 (0.1 M は 4 %sds、20% グリセロール、1.42 %2-mercaptethanol、0.2% ブロモフェノール ブルー (pH 6.8) をトリス-HCl) ステップ 3.3 からの蛋白質のサンプルの各ボリュームに。5 分間 90 ° C で加熱し、1 分間氷の上すぐにクールします。
- 10 %sds ポリアクリルアミドゲルに蛋白質のサンプルの 10-20 μ g を読み込み、別の 100-150 v) (材料の表を参照してください)。
- 0.45 μ m ニトロセルロース膜にゲルからタンパク質を転送 (材料表参照) 30 分の転送バッファー (25 mM トリス、グリシン 192 mM と 20% メタノール) 25 V とセミドライの転送装置によって。
- ブロッキング液を追加 (1 x TBST バッファーで 5% 脱脂乾燥したミルク (137 mM の NaCl、20 mM トリス-HCl (pH 7.6) 0.1% Tween 20)) 膜までコンテナーが完全に浸漬、30 分間室温でインキュベート (材料の表を参照してください)。
- SINEUP GFP の場合抗 GFP 抗体 (ソリューションをブロックで希釈配分) をもつタンパク質を交配させなさい (材料の表を参照してください) 室温で揺れと 30 分のため膜の孵化によって。内部制御タンパク質として抗 β-アクチン抗体 (ソリューションをブロックで希釈配分) を交配させることによって β-アクチン タンパク質を検出 (材料表参照) 室温で揺れと 30 分のため。
- 膜が完全に浸漬との洗い 5 分間室温になるまで、1 x TBST バッファーをコンテナーに追加します。(3 つの洗浄の合計) 複数回洗浄手順 2 を繰り返します。
- 希釈 (ソリューションをブロックで 1: 1000) に GFP タンパク質を交配させる抗家兎抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) の共役し、する β-アクチン タンパク質を交配させる希釈膜に HRP に共役 (ソリューションをブロックで 1: 1000) 抗マウス抗体部屋の温度で振とうしながら 30 分。
- 室温で 5 分の 1 の x TBST のバッファーを持つ膜を洗浄します。(3 つの洗浄の合計) 複数回洗浄手順 2 を繰り返します。
- HRP が強化された化学発光 (ECL) 検出試薬 1 と 2 (材料の表を参照してください) の等量をミックスします。2 mL ECL 試薬ミックスに膜を転送、アルミ箔でボックスを蓋をして室温で 1-2 分間インキュベートせてください。慎重に ECL 試薬ミックスから膜を削除し、発光の計測器をイメージングを使用して公開します。
5. RNA の抽出と DNase 処理
- 抽出総 RNA 次標準的な単分子膜27で育った細胞からの RNA 抽出のためのプロトコルか代わりに市販の RNA 抽出キット (材料の表を参照してください)。状態に簡単に言うと、イソチオ シアン酸グアニジンの任意の単相性溶解試薬 (MLR) を追加し、フェノールで収穫された細胞にステップ 2.3 (500 万セルあたり 1 mL MLR)27。
注:手袋を頻繁に変更します。RNase フリー試薬とジエチルピロカーボネート (DEPC) を使用して-プラスティック用品や RNA の劣化を防ぐためにガラス製品を扱います。必要な場合は、この手順でプロトコルを一時停止します。ストアは-80 ° C で RNA を抽出 - ステップ (材料表参照) 5.1 から浄化された RNA に DNase バッファー x 10 と DNase の 2 U の 0.1 のボリュームを追加します。
- ヌクレアーゼ フリー水 50 μ L 反応ボリュームを設定、軽く混ぜます。37 ° c 30 分間インキュベートします。
- 再懸濁の DNase 不活化試薬の 0.1 のボリュームを追加し、よく混ぜる (材料の表を参照してください)。穏やかな揺れで室温で 5 分間インキュベートします。
- 90 s. 転送の 10,000 × gで遠心分離機、新鮮な RNase フリー 1.5 mL チューブに上清 (無料の DNA RNA)。これは後工程のために面倒である DNase のキャリー オーバーを引き起こすので、ペレットに触れないように注意してください。
- 260 、260/A280の比率を測定することにより RNA 量的に表わす (純粋な RNA 範囲は 1.8 2.0) 紫外線分光光度計で。
6. 最初繊維の cDNA 合成と qRT PCR 解析
-
CDNA の統合 (材料の表を参照) 以下として標準的な cDNA の統合のプロトコル、次を実行します。
- 全反応量 10 μ L で 200-500 ng のトータル RNA (手順 5-8) からの 0.75 μ M オリゴ dT プライマー、4.3 μ M 任意プライマー、dNTPs (10 mM) をミックスします。65 ° C で 5 分間加温、氷の上をすぐに置きます。
- 1 x 逆転写酵素バッファー、1 U の RNase 阻害、逆転写酵素の 10 U をミックスし、10 μ L RNA プライマー ミックス 6.1.1 から追加します。
- 必要な場合は、全反応ボリュームをヌクレアーゼ フリー水 20 μ L に設定します。穏やかに混合および 30 ° c、10 分、60 分、42 ° C で反応混合物を孵化させなさいそして酵素を不活化する 5 分の 95 ° c。氷の上の管を冷却します。
注:RNA のサンプルおよび氷の上のすべての試薬を解凍し、氷に反応混合物を準備します。ターゲット Rna はポリア Rna のみである場合は、oligo dT プライマーのみ (2.5 μ M) を使用します。必要な場合は、プロトコルを一時停止します。-20 ° C で合成した cDNA を格納します。
- 技術をトリプリケートで qRT PCR を実行 (n = 3、Cт 標準偏差 > 0.2) と生物学的複製 (n ≥ 3) 内 10 ng cDNA の 1 μ L、逆プライマー (10 μ M)、前方のプライマー (10 μ M)、DNA ポリメラーゼの混合液の 10 μ L の 0.4 μ L の 0.4 μ L を使用して、二重鎖 DNA 染色色素、ヌクレアーゼ フリー水の 10 μ L の 0.4 μ L (反応量は 20 μ L) 以下の条件を使用して PCR の製品を検出するには30 段階 (1 サイクル) を保持する 95 ° C、5 段階 (40 サイクル) をサイクリングで s s 95 ° c、30 の 60 ° c、s 曲線のステージを溶かします。人間の Gapdh_Fw のプライマーの例を示します: TCTCTGCTCCTCCTGTTC、人間 Gapdh_Rv: GCCCAATACGACCAAATCC、EGFP_Fw: GCCCGACAACCACTACCTGAG、EGFP_Rv: CGGCGGTCACGAACTCCAG、SINEUP GFP_Fw: CTGGTGTGTATTATCTCTTATG と SINEUP GFP_Rv: CTCCCGAGTCTCTGTAGC。材料の表を参照してください。2- ∆∆Ct ± SD 法28RNA 発現を定量化を分析します。
7. イメージングによる半自動化された検出法による SINEUPs の解析
- 0.5 ml の PBS の 24 ウェル プレートのウェル 1 個の細胞を洗浄します。
- 2.0 μ g のヘキスト 33342 (材料の表を参照) を追加 (500 μ L の PBS で溶解) 各 24 ウェル プレートの細胞核を染色する 20 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- メジャー ヘキスト染色 461 nm の青色発光の最大値と緑色発光最大 510 の GFP 陽性細胞の数をカウントする緑の蛍光性の強度のセルの合計数をカウントするセルによるハイスループット マイクロもイメージの cytometer (nm材料のテーブルを見なさい)。29イメージング ソフトウェアを使用して、各チャネルの計算分割オブジェクトに信号を表示するすべてのピクセル強度の合計をである GFP 統合の強さを計算することによって、SINEUPs の蛋白質を規制効果を分析します。
- (手順 5 と 6) に RNA の発現を確認する細胞を収穫します。
Representative Results
SINEUP GFP は両方最適な BD を含む合成 SINEUP (-28 GFP mRNA に重なっている +4/) と ED (AS-Uchl1からサイン B2 反転) することができますを調整 GFP mRNA 翻訳 (図 3 a と 3 b) GFP 発現を変更せずmRNA (図 3 および 3 D)。画面の最適の BDs と SINEUPs は、EDs、検出時間を改善しを従来の西部のしみ方分析15と比較して上映されて同時にサンプル数を増加する半自動画像解析プロトコルを開発しました。図 4に示すように、この高速イメージング システムは (西部のしみの分析は、48 SINEUPs に 2 週間を要した) 3 日を取った。SINEUP GFP が GFP 翻訳を増加させることを実証した、イメージの cytometer による GFP 統合された強度を検出した.SINEUP-GFP の最適な BD は、GFP タンパク質発現の死因増加を誘発します。2.6-fold からの信号の圧縮を見ましたが (西部のしみの分析、図 3 aを参照してください) に死因 (脳画像解析には図 5を参照)、イメージング ソフトウェアで計測器の校正が違いがあります。それにもかかわらず、我々 は GFP 蛍光コントロール (図 5 a および 5 b) と比較して有意に高いレベルを検出しました。
図 1: 合成 SINEUPs の基本設計.BD mRNA、エドをターゲットに結合ドメインを = = エフェクター ドメイン反転サイン シーケンスを含みます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 転写人間パーキンソン病タンパク質 7 (PARK7) サイト (TSSs) を開始特定のティッシュおよび細胞ケージ分析によって検出された mRNA 。(A) A スナップショット オミックス データ統合とインタラクティブな可視化システム30を使用して人間のPARK7 mRNA の TSS の検索結果を表示します。Entrez の遺伝子 hg19 トラックの横の緑色の矢印は、ゲノムの位置を示す参照の人間PARK7 mRNA と FANTOM5 ケージ 1 と 2 トラックの緑色の縦線を示す TSSs の合計 (単位成績証明書として測定百万 (tpm)) から組織・細胞 1,829 の種類。(B) パネルで TSS の印の付いた領域のズームイン (1/354 スケール: 35.4 kb の 100 bp)。グレーは、1 と 2 のトラックを示します 6 特定のセル、図の下部に記載されている合計 1,829 から TSS FANTOM5 ケージの段階でエリアを影しました。ごとの成績を示す (11.369、4.998、4.304、3.509、3.477、および 3.055) これらの表示されているセルに対応する番号百万灰色でそれぞれの特定のセルの影、TSS の位置。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 訳 SINEUP GFP の発現を確認するウエスタン ・ ブロット分析します。(A) SINEUP GFP をウエスタン ・ ブロットで抗 GFP 抗体を調べた。(B) の結果は、β-アクチン蛋白質バンドの強さに正規化されました。(C) GFP mRNA および (D) SINEUP Rna 発現が qRT PCR で検出されました。p < 0.0005、n = 3、2 スチューデントの両側 t 検定、エラーバーは標準偏差。この図は、高橋から変更されているら15。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: SINEUP 半自動画像解析スケマティック。1 日目: シード 24 ウェル プレートに興味のセルです。2 日目: Transfect GFP と SINEUP GFP。3 日目: 統合された GFP の強度を測定することによって SINEUPs の効果を分析します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: SINEUP GFP による翻訳アップ制御の高スループット解析します。(A) 制御と SINEUP GFP transfected セル15GFP 蛍光の比較。スケール バー = 2 mm。 (B) GFP 強度とヘキスト 33342 の核染色によるカウント総細胞数正常化しました。p < 0.0005、n = 3、2 スチューデントの両側 t 検定、エラーバーは標準偏差。FOV: 視野。この図は、高橋から変更されているら15。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
我々 はここで具体的には蛋白質の生産を強化するプロトコルを記述した mRNA は、正弦波を含む、によってターゲットの非コーディングの RNA、SINEUPs と呼ばれます。代表的な例としてアップ規制の西部のしみの分析によって測定される 2.6-fold GFP mRNA の翻訳に最適な合成 SINEUP GFP が表示されます。
最適な BD を設計 SINEUP 特異性と効力 (タンパク質発現の程度) を確保することが重要です。以前、ウエスタン ・ ブロット分析15 17 BDs SINEUP GFP を上映し、他の Mrna の場合とできない場合があり、ケースごとに確認する必要があります最適な BD が GFP mRNA の 8 月コザック シーケンスを重なっていることを発見します。別の独立したグループはまた別の方法31を使用して BD を上映しました。かなり時間がかかり、面倒にすることができます多くの BDs をスクリーニング、高スループット SINEUP 検出方法ここを紹介しました。このメソッドは、統合 GFP 密度制御ベクトルのトランスフェクション細胞に比べて SINEUP transfected セルの相対的な変化を計測します。細胞培養プレートの特定も、均等に導入した GFP シグナルは井戸の特定の領域のみに集中していないことを確認、手順 2.1 で井戸に均等に細胞を配布する非常に重要です。この目的のため優しくクリーン ベンチ内細胞を播種後プレート 10 回前後 (↑ ↓) を振るし、5% CO2インキュベーターで孵化を開始する前に繰り返します。
もう一つの重要なステップは、ステップ 3.3 の蛋白質の集中の計算です。ここで誤算ウエスタン ・ ブロット分析、その結果弱い SINEUPs の蛋白質の表現の小さな変化の検出を防止またはオーバー ロードからの偽陽性を生成する時にタンパク質の誤った量の読み込み可能性があります。3.3.3 の手順で標準および蛋白質のサンプルの等しい量を測定することを確かめるたびにタンパク質標準曲線をたて準備する勧めします。プロトコルは SINEUP GFP に焦点を当ててここで説明が、西部のしみの分析はいずれかを使用ことができます興味の mRNA のターゲットします。インキュベーション時間と抗体の濃度は、最良の結果を取得するターゲットごとに最適化必要があります。
SINEUPs のユニークな特徴の 1 つは、ターゲット mRNA 発現レベルの影響を受けないままです。QRT PCR によるゲノム DNA と transfected SINEUPs の検出を避けるための RNA を治療することが重要です。SINEUP Rna およびターゲット mRNA の発現は、トランスフェクションと SINEUP 活動の成功を確認する qRT PCR で測定ください。SINEUPs が両方人間を通して豊かな正弦波シーケンスを含めるとマウスのゲノム。正弦波シーケンスの非特異的検出を避けるためには、勧めできません正弦シーケンスに qRT PCR プライマーを設計します。
このプロトコルではひと細胞を用いて、SINEUPs からいくつかの異なる種12,13,14,18,19細胞数に効果があります。限り、これらは SINEUP ベクトルのトランスフェクション効率を維持、細胞培養とトランスフェクション条件は異なる細胞によると変更できます。また、RNA の抽出、cDNA 合成とタンパク質濃度チェックの代替方法を利用できる qRT PCR および西部のしみの分析のため必要な RNA および蛋白質の品質を維持することを考える。全体だけに GFP の蛍光性の検出を有効に、特定のハイスループット マイクロよく cytometer を用いて同様の検出範囲で他の cytometers 使用31ことができます。それは、細胞と遺伝子の分布がよく全体に等しい場合、必要はありません全体よく GFP 蛍光のためにスキャンする注意されるべき: 半分または井戸の領域の 4 分の 1 は実験によって SINEUP 効果を識別する十分かもしれないアルのスキル。
培養細胞の特定の mRNA をターゲットと複数の BDs の同時検診高スループット SINEUP 検出プロトコルを確立することができます。これは BD で最適なターゲットに適用される規則がまだ明確ではないので重要です。このような多重化スクリーニング システムに対して異なる遺伝子、例えば特定のシグナル伝達経路に関与する複数の遺伝子をターゲットに有用な多くの SINEUPs の大規模なテストことができます。さらに、それは効果的な SINEUPs いくつかの Mrna のターゲット 8 月コザック地域別 SINEUP BDs の設計の検索を拡張する利用できる (図 1参照)、共同株全長ターゲット Mrna (5ʹ UTR CD 3ʹ UTR) GFP mRNA と融合細胞培養細胞と生体内でのモデル動物、人間および他の動物および植物種にマウスから最適な SINEUPs と内在性 mRNA に対するその後テスト BD 候補を見つけることです。
このスクリーニングのプロトコルは、非常に高速です。修正と細胞を収集だけ、リビングを配置する必要がある必要はありませんイメージング計測器で培養プレートを携帯します。SINEUPs 最適 BDs を選択し、西部のしみの分析により潜在的な候補を評価するこの高スループットス クリーニングのプロトコルの使用を提案します。したがって、最適な BDs で選ばれた候補者は、抗体生産18,19、21の増加に適用できます。現在、RNA の治療フィールドが劇的に高まっています。例えば、siRNA、麻生、mRNA や CRISPR RNA 療法が、それぞれターゲット9,32の mRNA の発現を制御する採用します。この文脈では、SINEUPs は、その乳児期がターゲット Mrna の発現を変更研究 SINEUPs のどれもこれまでのところ。さらに、SINEUPs は編集しないでくださいターゲット mRNA しますが、mRNA の翻訳をアップ-調整するだけ。さらに、SINEUP 治療、欠損蛋白質17,33の 2 倍誘導を達成するための対象にハプロから生じる損失の機能疾患をできます。オフターゲット効果は、さらに検討する必要があります、SINEUPs 潜在的、具体的対象 BD のように相補的なシーケンスを持つ単一の mRNA。
この高スループット プロトコルの制限はプロトコル対策、GFP は強度のみを統合されているので体内マウス モデルで SINEUPs の画面 BDs に適したはありません。SINEUPs は post-transcriptionally の役割を果たす天然のアンチセンス lncRNAs、ターゲット mRNA が細胞または組織サンプルでない場合は適用できません。
それにもかかわらず、SINEUPs は、1.5 〜 3.0 倍の範囲内で欠損蛋白質の発現を調整する RNA 療法と抗体の生産を高めるために、利得関数の研究に適用できます。ここで説明する方法は、ターゲット、目的の mRNA の翻訳の SINEUP 誘導強化を検出し、転写後遺伝子調節のための新しいツールを提供する便利なガイドを提示します。
Disclosures
ピエロ ・ Carninci の対応する著者は、知的財産権に提出特許 (EP2691522A4 と JP2017169573A) の SINEUP 技術の付与された特許 (US9353370B2) を保持する TransSINE テクノロジ株式会社の創設者の 1 つです。
Acknowledgments
本研究は革新的な生物医学の基礎科学とプラットフォーム技術プログラムによって公開されている、第 17 医療研究開発 (アメッド)、生活のための理化学研究所センターに文部科学省から研究助成金機構からの 0301014科学技術と理研 IMS に文部科学省から研究助成金。示唆に富む議論ありがとう PC ラボの SINEUP ネットワーク (シッサ, 東ピエモンテ大学と理化学研究所) のメンバー。博士マシュー バレンタインにありがとう校正します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthetic SINEUP | Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan | https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320 | Step 1.5 |
| HEK293T/17 | ATCC | ATCC CRL-11268 | Step 2.1 |
| Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate | Corning | 6902A01 | Step 2.1 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate | Corning | 08-774-124 | Step 2.1 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Step 2.2 |
| pEGFP-C2 | Clontech | #6083-1 | Step 2.2 |
| Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling Technology | #9803S | Step 3.1 This is pre-mixed cell lysis solution. |
| PMSF | Cell Signaling Technology | #8553S | Step 3.1 To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1x cell lysis buffer. |
| DC protein assay kit II | BIO RAD | #5000112JA | Step 3.3 |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 µL | BIO RAD | #4561035 | Step 4.2 |
| Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm×4 m) | Amasham | 10600013 | Step 4.3, This is a 0.45 µm nitrocellulose membrane. |
| Nonfat Dry Milk | Cell Signaling Technology | #9999S | Step 4.4 A component of the blocking solution. |
| GFP Tag Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-6455 | Step 4.5 Lot number: 1495850, RRID: AB_221570 |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | SIGMA | A5441 | Step 4.5 Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744 |
| Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins | Dako | P0448 | Step 4.5 This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138 |
| Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins | Dako | P0447 | Step 4.5 This is secondary antibody conjugating with HRP for anti β-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137 |
| ECL Western Blotting Detection Reagents | Amersham | RPN2109 | Step 4.9 |
| Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument | Promega | AS4500 | Step 5.1 This is commercially available RNA exreaction instrument. |
| Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit | Promega | AS1390 | Step 5.1 This is commercially available RNA exreaction kit. |
| TURBO DNA-free Kit | ambion | AM1907 | Step 5.2 and 5.4 The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent. |
| PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6110A | Step 6.1 The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis. |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | Step 6.2 |
| Hoechst3342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Step 7.2 |
| Celigo S | Nexcelom Bioscience | 200-BFFL-S | Step 7.3 This is a high throughput micro-well image cytometer. |
References
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