Summary
该协议描述了使用笼子分子胶标签的光触发核移位的客人在活细胞中的位置。该方法对现场选择性核靶向药物的输送具有广阔的应用前景。
Abstract
细胞核是作为亚细胞药物传递靶点的最重要的细胞器之一, 因为基因复制和表达的调节对治疗各种疾病是有效的。在这里, 我们展示了光触发核移位的客人使用笼分子胶 (笼胶 r) 标签, 其多个鸟苷离子 (gu+) 挂件是由一个阴离子光裂解组 (丁酸酯取代硝基甲氧基酯;文学学士nvoc)。贴有笼状胶 r 标记的客人通过内吞进入活细胞, 并留在内质体中。然而, 在光辐射下,笼胶-r 被转化为不带多个 gu+吊坠的未分类分子胶 (Uncaged-r), 便于客人的内部逃逸和随后的核移位。这种方法对于现场选择性核靶向药物输送很有希望, 因为标记的客人只有在光辐照时才能迁移到细胞质中, 然后是细胞核。笼中胶粘剂 r 标签可以提供大分子客人, 如量子点 (qd) 以及小分子客人。笼中胶-r 标签不仅可以用紫外光照射, 还可以用双光子近红外 (nir) 光进行解锁, 从而深入组织。
Introduction
携带遗传信息的细胞核是作为亚细胞药物传递靶点最重要的细胞器之一, 因为基因复制和表达的调节对治疗包括癌症和基因在内的各种疾病是有效的疾病1,2,3。对于核输送药物, 核定位信号 (nls)4、5、6 等肽标记的共轭已被广泛研究。然而, 为了减少不想要的副作用, 对核转移进行时空控制是必要的。
以前, 利用笼子 nls7、8、9实现了蛋白质在细胞核中的光触发移位。nls 通过与细胞质转运蛋白结合而迁移到细胞核中.在所报道的方法中, 采用遗传密码扩展技术 9, 通过微注射8将带有冠状 nls 的客人蛋白直接整合到细胞质中, 或在目标细胞中表达。因此, 一种既能实现细胞吸收又能实现光致核转移的方法, 有利于实际应用。
在此, 我们描述了光触发核移位的客人在活细胞使用树突状胶-r,图 1)标签活细胞。水溶性分子胶10,11,12,13, 14, 15,16, 17,18,19,20,21,22,23轴承多个 gu+吊坠以前已经开发, 其中紧密粘附蛋白质11,12,13,14,15, 16,17,核酸18,19,20, 磷脂膜21, 和粘土纳米板22,23通过在目标上的 gu+挂件和氧阴离子基团之间形成多个盐桥。笼胶 r的 gu +吊坠受阴离子光裂解组丁酸取代的硝基氮氧基 (banvoc) 的保护。贴有笼状胶 r 标记的客人通过内吞进入活细胞, 并留在内染色体中 (图 2)。在光照射下, c形胶-r 的banvoc 基团分离出一种不带多个 gu+吊坠的未分类分子胶 (解链胶 r), 从而促进了标记客人的迁移进入细胞质, 然后是细胞核 (图 2)。通过暴露在 uv 或双光子近红外 (nir) 光下, 可以在不产生严重光毒性的情况下, 取消笼子胶-r 标记。我们用量子点 (qd) 和荧光染料 (硝基苯并二恶唑), 用胶格 r 标记演示了高分子嘉宾和小分子嘉宾的时空控制核输送;(nbd), 分别作为例子。
图 1:笼胶-r 的原理图结构.环胶 r 的9个鸟离子 (gu+) 吊坠受丁酸取代的硝基硝基氧氧氧烷基 (banvoc) 保护。banvoc 基团通过紫外或双光子近红外光的照射进行切割。用硝基苯二唑 (nbd) 或二苯环磷酰胺 (dbco) 对环胶-r 的焦核进行了功能化处理。在引用20的允许下重新打印。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 与带笼子胶粘剂 r 标记共轭的来宾的光触发核移位示意图.通过内吞将客魔/笼胶-r 共轭带入活细胞。在光照射下,笼子胶质 r 标签被取消, 以产生一个取消胶-r 标签, 这可以促进标记的客人的内部染色体逃逸。随后, 贴有标记的客人迁移到细胞核中。在引用20的允许下重新打印。请点击这里查看此图的较大版本.
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Protocol
1. 使用笼子胶粘剂 r 标签的客人的准备
- 准备笼子里的 glu-nbd 解决方案。
- 按照前面描述的过程合成笼子 gnbd (图 1) 20。
- 制备干二甲基亚硫酸盐 (dmso) 中的环胶-nbd (10 mm) 的库存溶液。
注意: 将库存解决方案存储在黑暗中。该溶液可在使用时用水缓冲液或细胞培养介质稀释。
- 准备笼式胶-qd 解决方案。
- 按照前面描述的程序合成笼胶-二苯并呋喃 (cypye-dbco) (图 1).
- 在干燥的 dmso 中制备了笼式 gbco (10mm) 的库存解决方案。
- 为制备笼式胶粘剂 qd, 首先制备氮化物功能化 qd (azide-functionalized;图 3)。将偶氮素-peg4-nhs 酯的二甲基甲酰 (dmf, 125μm) 溶液 (图 3) 添加到含有氨基功能化 peg (ai-qd) 的量子点 (qd) 的 dmf (500 nm) 溶液的400μl 中;图 3)。在室温下搅拌混合物1小时。
- 利用 3, 500 分子量截止 (mwco) 的再生纤维素膜, 将生成的溶液透析24小时对800毫升的 dmf。
- 用 dmf 将笼式 gbco 的库存溶液稀释至50μm。在透析后溶液中加入200μl 溶液 (图 3), 并在室温下搅拌混合物3小时。
- 利用再生纤维素膜 (25, 000 mwco) 将生成的溶液透析 24小时, 对800毫升的 dmf 进行分析。
- 使用 dmf 将生成的解决方案稀释到 200 nm。
图 3:笼式胶-qd 制备示意图.请点击这里查看此图的较大版本.
2. 为显微观察制备 hep3b 细胞样本
- 在 5% co 2 以下37°c 维持在鹰的最低必要培养基 (emem) 中含有10% 胎儿牛血清 (fbs) 的人肝癌 Hep3B 细胞.
- 在实验前一天给细胞播种。种子 5.0x10 3 hep3b 细胞每井在 emem (10% fbs, 200μl), 并在37°c 孵育细胞样品在 5% co2 下 24小时.
- 取出培养基, 用100μl 的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐 (d-pbs) 冲洗细胞样品两次。
3. 紫外光触发的小分子宾客核转移观测
- 向细胞样品 (在步骤2.3 中制备) 提供200μl 的无 fbs emem, 其中含有cim葡萄-nbd (10μm), 并在25°c 下孵育产生的细胞样品在 5% co2 下, 为3小时。
注意: 在无 fbs emem 中培养细胞样本超过4小时会导致严重的细胞损伤。 - 取出培养基, 用100μl 的 d-pbs 冲洗细胞样品两次。
- 为显示内窥镜, 向细胞样本提供含有红色荧光染料 (例如, lysotracker red, 100 nm) 的 200μl emem (10%fbs), 并在 5% co 2 下孵育所产生的细胞样本 20分钟.用100μl 的 d-pbs 冲洗细胞样品两次。为电池样品提供200μl 的 emem (10% fbs)。
- 对于c蒂gog-nbd 的核转位, 使用配备365纳米带通滤波器的100-w 氙气光源,通过光纤将电池样品暴露在紫外光下2分钟。对于不受紫外线照射的参考细胞样本, 请将细胞样本保持在黑暗中。
注意: 玻璃基板的盖子可以取下, 以便有效地进行紫外线照射。长时间暴露在紫外线下可能会导致细胞对细胞的毒性。 - 为了显示细胞核, 在培养基中加入 1μl hoechst 33342 (1mg/ml), 并在 5% co2 下37°c 孵育所产生的细胞样本 10分钟.
- 将细胞样本置于共聚焦激光扫描显微镜下, 并在 488 nm (obs = 550-530 nm)、543 nm (ob = 565-620 nm) 和 710 nm (双光子) 的激发下记录显微图像; bbd、红色荧光染料和 hoechst 33342 分别为 390-465 nm)。
4. 双光子近红外光触发的小分子宾客核转移观测
- 向细胞样品 (在步骤2.3 中制备) 提供200μl 的无 fbs emem, 其中含有cim葡萄-nbd (10μm), 并在25°c 下孵育产生的细胞样品在 5% co2 下, 为3小时。
- 取出培养基, 用100μl 的 d-pbs 冲洗细胞样品两次。为电池样品提供200μl 的 emem (10% fbs)。
- 对细胞样本进行共聚焦激光扫描显微镜检查, 并在 488 nm (obs = 500-530 nm) 时记录显微镜。
- 对于圣极 glu-nbd 的核移位, 用双光子激发激光 (710 nm) 照射该区域, 作为光源安装在显微镜下, 持续 2分钟 (30 sx4)。观察步骤4.3 中所述的移位。
5. 紫外光触发的大分子宾客核转移观测
- 向细胞样品 (在步骤2.3 中制备) 提供含有 cim g有害 gqd (10nm ) 的200μl 无 fbs emem, 并在25°c 下将生成的细胞样品孵育3小时.
- 取出培养基, 用100μl 的 d-pbs 冲洗细胞样品两次。为电池样品提供200μl 的 emem (10% fbs)。
- 对于c蒂胶粘剂 qd 的核转位, 使用配备365纳米带通滤波器的 100 w 氙气光源,通过光纤将电池样品暴露在紫外光下2分钟。对于不受紫外线照射的参考细胞样本, 请将细胞样本保持在黑暗中。
- 为了显示细胞核, 在培养基中加入 1μl hoechst 33342 (1mg/ml), 并在 5% co2 下37°c 孵育所产生的细胞样本 10分钟.
- 对细胞样本进行共聚焦激光扫描显微镜检查, 并分别记录在 405 nm (obs = 430-520 nm) 和 405 nm (obs = 625-680 nm) 下的显微镜下, 分别用于 hoechst 33342 和 qds。
6. 细胞活力检测
- 在 5% co 2 以下37°c 维持人肝癌肝细胞 Hep3B 细胞在 emem (10% fbs) 中的作用。
- 在实验前一天给细胞播种。种子 5.0x10 96 孔培养板每孔 3 hep3b 细胞在 emem (10% fbs, 200μl) 中, 在37°c 下孵育细胞样本在 5% co2 下 24小时.
- 取出培养基, 用100μl 的 d-pbs 冲洗细胞样品两次。
- 为细胞样品提供200μl 的不含 cim 葡萄-nbd (0.1-100μm) 的无 fbs emem, 并在37°c 下孵育所产生的细胞样品在 5% co2 下, 为 3小时.
- 使用配备 365 nm 带通滤波器的 100 w 氙气光源,通过光纤将电池样品暴露在紫外光中2分钟。对于不受紫外线照射的类似细胞样本, 请将细胞样本保持在黑暗中。
- 在培养基中加入10μl 细胞计数 kit-8 试剂 (10μl), 并在37°c 下孵育所产生的细胞样本在 5% co 2 以下 2小时。
- 使用微板读取器对细胞样品进行吸收光谱 ( = 450 nm)。
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Representative Results
在光照射前, 用笼状葡萄-nbd 培养的 hep3b 细胞从其内部显示出点状荧光发射 (ext = 488 nm;图 4 a 和4A, 绿色)。在543纳米的激发下, 红荧光染料 (图 4b和4B, 红色) 得到了类似的显微图像, 表明笼子葡萄-nbd 在内质体中局部化。因此, 在细胞核外观察到可分配给cagedglar-nbd (图 4d, 绿色) 的荧光发射, 并使用 hoechst 3342 ( ext = 710 nm, 双光子) 进行可视化;图 4d, 蓝色)。紫外线照射后, 由于 nbd (图 4e, 绿色), 细胞也从细胞核发出荧光 (图 4e, 蓝色), 这表明c程grare nbd 被取消产生不笼子的 gnbd, 而这些 gnbd 迁移到细胞质后跟细胞核。这种环凝胶 nbd 的核移位可以通过双光子近红外光选择性地诱导 (图 5a和电影 1, 白色虚线圆圈)。如图 5b和电影 1所示,非辐照区域的笼子葡萄-nbd 没有从内质体中逃逸, 并保持为点状荧光。在紫外线照射之前和之后, 使用笼状葡萄-nbd 处理的细胞没有观察到明显的细胞毒性 (图 6)。
笼子的胶-r 标签也可以提供大分子客人, 如 qd 进入细胞核。qd/c情不自禁-r 共轭 (笼胶-qd,图 3) 可进入肝素 b 细胞 (图 7a)。hoechst 33342 显示细胞核的可视化表明, 在光照射之前, c解放军胶粘剂qd 仍在细胞核之外 (图 7a)。紫外线照射2分钟后, 核中出现了 qd 的荧光发射 (图 7b和7B)。细胞的横截面图像表明, 可分配给 qds 的荧光发射确实是从细胞核内部发出的 (图 7d)。
图 4: 紫外线触发的笼型葡萄-nbd 的内质逃逸和核移位.在含有嵌笔葡萄-nbd (10μm) 的 emem 中, 在37°c 孵育3小时后, 共聚焦激光扫描 Hep3B 细胞的显微图像, 然后用 d-pbs 冲洗。(A、B)在含有红色荧光染料 ( 100 nm ) 的 emem (10% fbs) 中, 在 emem (10%fbs ) 中孵育20分钟后, 在 (a) 488 nm (obs = 550-530 nm, 绿色)和(b) 543 nm (obs = 565-620 nm, 红色) 时进行了显微镜记录.(c) ( a)及(b)的合并图像。(D, E)在 488 nm (obs = 500-530 nm, green) 和 710 nm (双光子) 下记录的显微镜;= 390-465 纳米, 蓝色)。用圣凝胶-nbd 处理的 hepbb 细胞在 emem (10% fbs) 中, 在 ( d)和(e)在365纳米的2分钟紫外线照射之前和之后, 在37°c 的温度下孵育, 其中含有 hoechst 33342 (5μg/ml)。刻度条 = 20μm. 经参考20 许可转载。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 由双光子近红外光触发的嵌箱 glu-nbd 的核移位.在含有嵌笔葡萄-nbd (10μm) 的 emem 中, 在37°c 孵育3小时后, 共聚焦激光扫描 Hep3B 细胞的显微图像, 然后用 d-pbs 冲洗。在 ( a)之前和(b)在 710 nm 处进行 2分钟 (30sx4 ) 的双光子照射时, 在 488 nm (obs = 500-530 nm) 的激发下记录了显微的显微图像。(a) 中的白色虚线圆圈表示辐照区域。刻度条 = 20μm. 经参考20 许可转载。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 细胞活力检测.在(a)和(b) 365个纳米的2分钟紫外线照射之前和之后, 在含有笼子胶质-nbd (0.1-100μm) 的 emem 中培养后, hep3b 细胞的活力。在引用20的允许下重新打印。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 由紫外光触发的箱式胶-qd 的核移位.在 405 nm (obs = 430-520 nm) 和 405 nm (obs = 625-680 nm) 激发时, 共聚焦激光扫描 hh3b 细胞的显微图像。在含有c猴g溶液的 emem 中, hep3b 细胞在37°c 孵育 3小时 (10nm), 用 d-pbs 冲洗, 然后在37°c 孵育10分钟的 emem (10% fbs) 中含有 hoechst 33342 (5μg/ml) 之前 ( a) 和之后 (b, c) 2分钟暴露于紫外线在365纳米的光。(d)沿(c)中的黄线的横截面图像。刻度条 = 20μm. 经参考20 许可转载。请点击这里查看此图的较大版本.
电影1。 双光子近红外光触发的箱式 gell-nbd 核转位.在含有嵌箱葡萄-nbd (10μm) 的 emem 中, 在37°c 孵育3小时后对 hep3b 细胞进行延时共聚焦激光扫描显微镜检查, 然后用 d-pbs 冲洗。在 488 nm (obs = 500-530 nm) 的激发下, 以3秒的间隔记录了显微图像。在710纳米的情况下, 用双光子近红外光照射位于白色虚线圈的细胞 2分钟 (30sx4)。在引用20的允许下重新打印。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
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Discussion
以前使用 cagednls 7、8、9实现了对光触发蛋白质转移到细胞核中的研究。如前所述, 这些方法需要额外的技术, 以纳入 nls 标记的蛋白质到细胞质。相反, 我们的 c蒂胶粘剂-r 标签不仅可以实现光致核的移位, 还可以让客人的手机吸收。笼胶- r标记的这一特性有利于在体内应用。
笼子的胶-r 标签可以将 qd 等大分子客人传送到细胞核中。这里使用的 qds 直径 (dh = 15-20 nm) 大于核孔 (~ 5 nm)24, 这表明有可能提供其他不能被动扩散到细胞核的大分子。建立了偶氮基团生物大分子表面功能化的协议, 建立了25个;此外, 合成带有其他功能基团的c亚历山大glu-r 标记, 如马来酰亚胺、 n-羟基琥珀酰亚胺酯等, 作为锚固单元, 将扩大笼胶 r 标记对各种生物 大分子。
不用说, 这种方法的关键步骤是通过内吞将被标记为笼状胶 r 的客人结合起来。标记的客人的细胞吸收效率取决于他们的浓度和孵化时间。如果有兴趣的客人, 当被标记为笼子胶 r, 内细胞内循环效率低下, 孵育细胞更长的浓度标记的客人。一个可能的替代方法是增加加入客人的笼胶 r 的数量。
此协议中使用的来宾与圣环胶-r 标记共价共轭。这是一个潜在的缺点, 特别是在小分子配体的传递, 因为他们的结合与目标生物分子可能会被抑制笨重的树突标记。在cagedgle-r 标记和来宾分子之间安装一个刺激响应链接器26 , 可以允许在核移位后释放客人。
总之, 我们演示了光触发核移位的客人使用光活笼分子胶 (笼胶-r) 标签。被标记为笼子胶 r 的客人通过内吞进入活细胞, 并留在内质体中。在光辐射下,笼子胶质 r 被转换为取消胶-r, 这有利于客人的子宫内膜逃逸和随后的核移位。进一步的长期观察可能是重要的调查的客人的命运, 留在内生瘤, 以及那些交付到细胞核。利用笼胶-r 标记进行时空控制的基因表达是一个值得进一步研究的有趣课题。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢东京大学纳米生物集成中心。这项工作得到了青年科学家补助金 (b) (26810046) 至 k. o. 的支持, 并得到了对 t. a. r. m. 的特别促进研究补助金 (25000005) 的部分支持, 感谢日本促进科学协会研究研究研究研究研究研究研究研究研究研究研究金 (jps)。), 为青年科学家和主要研究生院 (gplli) 计划。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azide-PEG4-NHS ester | Click Chemistry Tools | AZ103 | |
| Q-dot 655 ITK | Invitrogen | Q21521MP | |
| Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) | NIPPON Genetics | TOR-3K | |
| Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) | Harvard Apparatus | 7425-RC25K | |
| Hep3B Cells | ATCC | HB-8064 | |
| 8-chambered glass substrate | Nunc | 155411JP | |
| 96-well culture plate | Nunc | 167008 | |
| Eagle's minimal essential medium (EMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10370-021 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare | SH30406.02 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) | Wako Pure Chemical Industries | 045-29795 | |
| LysoTracker Red | Lonza Walkersville | PA-3015 | |
| Hoechst 33342 | Dojindo | H342 | |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl-Zeiss | LSM 510 | Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Xenon light source | Asahi Spectra | LAX-102 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax Paradigm |
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