Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58631
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Dit protocol beschrijft licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten in levende cellen met behulp van gekooide moleculaire lijm tags. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug delivery.

Abstract

De celkern is een van de belangrijkste organellen als subcellular drug-levering doel, sinds modulatie van gene replicatie en expressie is effectief voor de behandeling van verschillende ziekten. Hier tonen we licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten met behulp van moleculaire lijm (GlueCaged-R) tags, waarvan meerdere guanidinium ion (Gu+) Hangers worden beschermd door een groep van de anionactieve photocleavable (butyraat-gesubstitueerde gekooide nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gasten gelabeld met Cagedlijm-R worden overgenomen in levende cellen via endocytose en blijven Endosomen. Echter, op photoirradiation, Cagedlijm-R wordt omgezet in uncaged moleculaire lijm (Glue-RUncaged) uitvoering van meerdere Gu+ Hangers, dat de endosomal vlucht en de daaropvolgende nucleaire translocatie van de gasten vergemakkelijkt. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug levering, aangezien de tagged gasten naar het cytoplasma gevolgd door de celkern migreren kunnen alleen als photoirradiated. Caged Lijm-R tags kunnen leveren macromoleculaire gasten zoals quantumdots (QDs) evenals kleine-molecuul gasten. Caged Lijm-R tags kunnen uncaged met niet alleen UV-licht, maar ook twee-foton nabij-infrarood (NIR) licht, dat diep in weefsel kan binnendringen.

Introduction

De celkern, die genetische informatie draagt, is een van de belangrijkste organellen als subcellular drug-levering doel, sinds modulatie van gene replicatie en expressie is effectief voor de behandeling van verschillende ziekten waaronder kanker en genetische stoornissen van1,2,3. Voor nucleaire levering van drugs, vervoeging van peptide tags zoals nucleaire localisatie signalen (NLS)4,5,6 grote schaal is onderzocht. Ter beperking van ongewenste bijwerkingen hebben, is echter de spatio controle van de nucleaire translocatie nodig.

Eerder, licht-geactiveerd translocatie van eiwitten in de celkern heeft bereikt met behulp van gekooide NLS-7,-8,9. NLS worden naar de celkern door binding aan cytoplasmatische vervoer eiwitten6gemigreerd. In de gerapporteerde methoden, zijn gast eiwitten dragen gekooide NLS direct ingelijfd bij het cytoplasma van microinjection8 of uitgedrukt in de doelcellen met behulp van een genetische code uitbreiding techniek9. Een methode die zowel cellulaire opname- en foto-geïnduceerde nucleaire translocatie kan bereiken is dus voordelig voor praktische toepassingen.

Hierin beschrijven we licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten in levende cellen met behulp van dendritische gekooide moleculaire lijm (Cagedlijm-R, Figuur 1) tags. In water oplosbare moleculaire lijm10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , rekening houdend met meerdere Gu+ Hangers zijn eerder ontwikkeld, die strak houden aan eiwitten11,12,13,14,15, 16,17, nucleïnezuren18,19,20, fosfolipide membranen21en klei nanosheets22,23 via de vorming van meerdere zout bruggen tussen hun Gu+ hangers en oxyanionic groepen op de doelen. De hangers Gu+ van Cagedlijm-R worden beschermd door een anionogene photocleavable groep, butyraat-gesubstitueerde nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gasten gelabeld met Cagedlijm-R worden overgenomen in levende cellen via endocytose en verblijf in Endosomen (Figuur 2). Op photoirradiation, zijn de BANVOC groepen Cagedlijm-R zodanig dat deze een uncaged moleculaire lijm (Glue-RUncaged) uitvoering van meerdere Gu+ Hangers, die vervolgens de migratie van de tagged gast vergemakkelijkt vrijstaand in het cytoplasma gevolgd door de celkern (Figuur 2). De Cagedlijm-R tag kan worden uncaged door blootstelling aan UV- of twee-foton nabij-infrarood (NIR) licht zonder ernstige fototoxiciteit. We tonen de spatiotemporally gecontroleerde nucleaire levering van macromoleculaire gasten evenals gasten van de kleine-molecuul met Cagedlijm-R tags, met behulp van quantumdots (QDs) en een fluorescente kleurstof (nitrobenzoxadiazole; NBD), respectievelijk, als voorbeelden.

Figure 1
Figuur 1: Schematische structuren van Cagedlijm-R. De 9 guanidinium ion (Gu+) Hangers van Cagedlijm-R worden beschermd door een groep butyraat-gesubstitueerde nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). De BANVOC groepen zijn gekloofd door bestraling met UV- of twee-foton NIR licht. De focal kern van Cagedlijm-R is matiemaatschappij met nitrobenzoxadiazole (NBD) of dibenzocylooctyne (DBCO). Overgenomen met toestemming van referentie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Schematische afbeelding van licht-geactiveerd nucleaire translocatie van gasten geconjugeerd met een Cagedlijm-R tag. De gast /Cagedlijm-R conjugaat wordt in beslag genomen in levende cellen via endocytosis. Op photoirradiation is de Cagedlijm-R tag uncaged een Uncagedlijm-R tag, die endosomal ontsnappen van de tagged gast vergemakkelijken kan opleveren. Vervolgens worden de tagged gast naar de celkern gemigreerd. Overgenomen met toestemming van referentie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van gasten met gekooidelijm-R Tags

  1. Bereid Cagedlijm-NBD-oplossing.
    1. Synthetiseren Cagedlijm-NBD (Figuur 1) na de procedures eerder beschreven20.
    2. Voorbereiden van een stamoplossing van Cagedlijm-NBD (10 mM) in droge dimethylsulfoxide (DMSO).
      Opmerking: Bewaar de stockoplossing in donker. De oplossing kan worden verdund met waterige buffers of cel-cultuur-media bij gebruik.
  2. Bereid Cagedlijm-QD-oplossing.
    1. Synthetiseren Cagedlijm-dibenzocylooctyne (Cagedlijm-DBCO) (Figuur 1) volgens de procedures eerder beschreven20.
    2. Voorbereiden van een stamoplossing van Cagedlijm-DBCO (10 mM) in droge DMSO.
    3. Voor de bereiding van Cagedlijm-QD, eerst voorbereiden azide-matiemaatschappij QDs (Azide-QD; Figuur 3). Voeg 100 µL van een dimethyl formamide (DMF, 125 µM) oplossing van azide-PEG4-NHS ester (Figuur 3) aan 400 µL van een DMF (500 nM) oplossing van quantumdots (QDs) bekleed met amine-matiemaatschappij PEG (Amine-QD; Figuur 3). Roer het mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    4. Dialyze van de resulterende oplossing gedurende 24 uur tegen 800 mL DMF gebruik van een folie van geregenereerde cellulose membraan met 3.500 molecuulgewicht cut-off (MWCO).
    5. Verdun de stockoplossing van Cagedlijm-DBCO tot 50 µM met DMF. Voeg 200 µL van de oplossing aan de oplossing na dialyse (Figuur 3) en roer het mengsel gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
    6. Dialyze van de resulterende oplossing gedurende 24 uur tegen 800 mL DMF gebruik van een folie van geregenereerde cellulose membraan (25.000 MWCO).
    7. Verdun de resulterende oplossing tot 200 nM met DMF.

Figure 3
Figuur 3: Schematische afbeelding van de voorbereiding van Cagedlijm-QD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. bereiding van Hep3B cel monster voor microscopische waarnemingen

  1. Handhaven van menselijke hepatocellulaire carcinoom Hep3B cellen in Eagle's minimale essentiële medium (EMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) bij 37 ° C minder dan 5% CO2.
  2. Beënt de cellen, de dag voor het experiment. Zaad 5.0 × 103 Hep3B cellen per putje van een 8-chambered glas-substraat in EMEM (10% FBS, 200 µL), en Incubeer het monster van de cel bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 gedurende 24 uur.
  3. Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL Dulbecco van fosfaat buffer zoutoplossing (D-PBS).

3. waarneming van nucleaire translocatie van gasten van de kleine-molecuul veroorzaakt door UV-licht

  1. Leveren van het monster van de cel (bereid in stap 2.3) met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-NBD (10 µM) en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.
    Opmerking: Incubatie van het monster van de cel in FBS-vrije EMEM langer dan 4U veroorzaakt ernstige celbeschadiging.
  2. Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS.
  3. Voor de visualisatie van de Endosomen, leveren de cel monster met 200 µL van EMEM (10% FBS) met een rood-fluorescerende kleurstof (bvLysoTracker rood, 100 nM), en het resulterende cel monster bij 37 ° C te incuberen minder dan 5% CO,2 voor 20 min. Verwijder de cultuur medium, en spoel het monster van de cel met 100 µL van D-PBS tweemaal. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van EMEM (10% FBS).
  4. Voor nucleaire translocatie van Cagedlijm-NBD, blootstellen aan het UV-licht voor 2 min via een optische vezel met behulp van een lichtbron van 100-W xenon, voorzien van een 365 nm bandfilter filter monster cel. Voor de cel van een referentiemonster is zonder UV-blootstelling, het monster van de cel in donker te houden.
    Opmerking: Het deksel van de glazen substraten kan afgenomen worden voor efficiënte UV-blootstelling. Lange-termijn blootstelling aan UV-licht kan het veroorzaken van cytotoxiciteit op de cellen.
  5. Voor de visualisatie van de kernen, voeg 1 µL van Hoechst 33342 (1 mg/mL) toe aan het kweekmedium en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 10 min.
  6. Het monster van de cel onverminderd confocale laser scanning microscopie en opnemen van de microfoto na excitatie op 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm), en 710 nm (twee-foton; Λ Obs = 390-465 nm) voor NBD, rood-fluorescerende kleurstof en Hoechst 33342, respectievelijk.

4. waarneming van nucleaire translocatie van gasten van de kleine-molecuul veroorzaakt door twee-foton NIR licht

  1. Leveren van het monster van de cel (bereid in stap 2.3) met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-NBD (10 µM) en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.
  2. Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van EMEM (10% FBS).
  3. Het monster van de cel onverminderd confocale laser scanning microscopie en opnemen van de microfoto na excitatie op 488 nm (λobs = 500-530 nm).
  4. Bestralen voor nucleaire translocatie van Cagedlijm-NBD, de regio, met inbegrip van de cel van belang met een twee-foton excitatie-laser (710 nm), geïnstalleerd als een lichtbron in de Microscoop, gedurende 2 minuten (30 s × 4). Observeer de translocatie zoals beschreven in stap 4.3.

5. waarneming van nucleaire translocatie van macromoleculaire gasten veroorzaakt door UV-licht

  1. Het monster van de cel (bereid in stap 2.3) met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-QD leveren (10 nM), en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.
  2. Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van EMEM (10% FBS).
  3. Voor nucleaire translocatie van Cagedlijm-QD, blootstellen aan het UV-licht voor 2 min via een optische vezel met behulp van een lichtbron van 100-W xenon, voorzien van een 365 nm bandfilter filter monster cel. Voor de cel van een referentiemonster is zonder UV-blootstelling, het monster van de cel in donker te houden.
  4. Voor de visualisatie van de kernen, voeg 1 µL van Hoechst 33342 (1 mg/mL) toe aan het kweekmedium en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 10 min.
  5. Het monster van de cel onverminderd confocale laser scanning microscopie en opnemen van de microfoto na excitatie op 405 nm (λobs = 430-520 nm) en 488 nm (λobs = 625-680 nm) voor Hoechst 33342 en QDs, respectievelijk.

6. cel levensvatbaarheid Assay

  1. Handhaven van menselijke hepatocellulaire carcinoom Hep3B cellen in EMEM (10% FBS) bij 37 ° C minder dan 5% CO2.
  2. Beënt de cellen, de dag voor het experiment. Zaad 5.0 × 103 Hep3B cellen per putje van een cultuur van de 96-wells-plaat in EMEM (10% FBS, 200 µL), en Incubeer het monster van de cel bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 gedurende 24 uur.
  3. Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS.
  4. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-NBD (0.1-100 µM) en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.
  5. Blootstellen aan het UV-licht voor 2 min via monster cel een optische vezel met behulp van een lichtbron van 100-W xenon, voorzien van een 365 nm bandfilter filter. Houd de cel monster in donker voor een monster analoog cel zonder UV-blootstelling.
  6. 10 µL van cel tellen Kit-8 reagens (10 µL) toevoegen aan het cultuurmedium en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 gedurende 2 uur.
  7. Het monster van de cel onverminderd Absorptie spectroscopie (λ = 450 nm) met behulp van een microplate-lezer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor photoirradiation, Hep3B cellen geïncubeerd met Cagedlijm-NBD tentoongesteld punctate fluorescentie emissie van hun interieur (λext = 488 nm; Cijfers 4A en 4 C, groen). Een analoge opname werd verkregen na excitatie bij 543 nm voor rood-fluorescerende kleurstof (cijfers 4B en 4 C, rode), die aangeeft dat Cagedlijm-NBD gelokaliseerd in de Endosomen. Dienovereenkomstig, de fluorescentie emissie toewijsbaar aan Cagedlijm-NBD (Figuur 4 d, groen) werd waargenomen buiten de celkern, die werd gevisualiseerd met Hoechst 33342 (λext 710 = nm, twee-foton; Figuur 4 d, blauw). Na UV bestraling, de cellen uitgestoten fluorescentie als gevolg van NBD (figuur 4E, groene) ook van de kern (4E van de figuur, blauw), wat suggereert dat Cagedlijm-NBD uncaged rendement Uncagedlijm-NBD, die gemigreerd was naar het cytoplasma gevolgd door de celkern. Nucleaire translocatie van Cagedlijm-NBD kan site-selectief worden opgewekt door twee-foton NIR licht (figuur 5A en film 1, witte gestippelde cirkel). Zoals blijkt uit figuur 5B en film 1, Cagedlijm-NBD in nonirradiated gebieden niet ontsnapten uit de Endosomen en bleef als punctate fluorescentie. Geen merkbare cytotoxiciteit werd waargenomen voor de cellen die zijn behandeld met Cagedlijm-NBD voor en zelfs na de UV-blootstelling (Figuur 6).

De Cagedlijm-R tags kunnen ook leveren macromoleculaire gasten zoals QDs in de celkern. De QD /Cagedlijm-R geconjugeerde (Cagedlijm-QD, Figuur 3) kan worden overgenomen in de Hep3B cellen (figuur 7A). Visualisatie van de celkern met Hoechst 33342 geeft aan dat Cagedlijm-QD buiten de kern alvorens photoirradiation (figuur 7A blijft). Na UV blootstelling gedurende 2 minuten ontstaan de uitstoot van de fluorescentie van QDs in de kern (cijfers 7B en 7 C). Een transversale beeld van de cellen wordt aangetoond dat de fluorescentie emissie toewijsbaar aan QDs inderdaad wordt uitgezonden van binnen de kern (figuur 7D).

Figure 4
Figuur 4: Endosomal ontsnappen en nucleaire translocatie van Cagedlijm-NBD veroorzaakt door UV-licht. Confocale laser scanning microfoto van Hep3B cellen na 3 uur incubatie bij 37 ° C in EMEM met Cagedlijm-NBD (10 µM) gevolgd door spoelen met D-PBS. (A, B) Microfoto werden opgenomen na excitatie bij (A) 488 nm (λobs = 500-530 nm, groen) en (B) 543 nm (λobs 565-620 nm, rood =) na een incubatieperiode van 20 min in EMEM (10% FBS) met rood-fluorescerende kleurstof (100 nM) . (C) samengevoegde afbeelding van (A) en (B). (D, E) Microfoto opgenomen na excitatie op 488 nm (λobs = 500-530 nm, groen) en 710 nm (twee-foton; Λ Obs = 390-465 nm, blauw). De Hep3B cellen, behandeld met Cagedlijm-NBD, werden geïncubeerd bij 37 ° C in EMEM (10% FBS) met Hoechst 33342 (5 µg/mL) voor (D) en na (E) 2-min UV blootstelling bij 365 nm. Schaal bars = 20 µm. herdrukt met toestemming van referentie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Nucleaire translocatie van Cagedlijm-NBD veroorzaakt door twee-foton NIR licht. Confocale laser scanning microfoto van Hep3B cellen na 3 uur incubatie bij 37 ° C in EMEM met Cagedlijm-NBD (10 µM) gevolgd door spoelen met D-PBS. Microfoto werden opgenomen na excitatie op 488 nm (λobs = 500-530 nm) voor (A) en na (B) twee-foton bestraling bij 710 nm gedurende 2 minuten (30 s × 4). De witte onderbroken cirkel in (A) vertegenwoordigt het bestraalde gebied. Schaal bars = 20 µm. herdrukt met toestemming van referentie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: cel levensvatbaarheid assay. Viabilities van Hep3B cellen na een incubatieperiode in EMEM met Cagedlijm-NBD (0.1-100 µM) voor (A) en na (B) 2-min UV blootstelling bij 365 nm. Overgenomen met toestemming van referentie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: Nucleaire translocatie van Cagedlijm-QD veroorzaakt door UV-licht. Confocale laser scanning microfoto van Hep3B cellen na excitatie op 405 nm (λobs = 430-520 nm) en 488 nm (λobs = 625-680 nm). Hep3B cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 uur in EMEM met Cagedlijm-QD (10 nM), gespoeld met D-PBS en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 minuten in EMEM (10% FBS) met Hoechst 33342 (5 µg/mL) voor (A) en na (B, C) 2-minuten blootstelling aan UV licht aan 365 nm. (D) transversale afbeelding langs de gele lijn in (C). Schaal bars = 20 µm. herdrukt met toestemming van referentie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Movie
Film 1. Nucleaire translocatie van Cagedlijm-NBD veroorzaakt door twee-foton NIR licht. Time-lapse confocale laser scanning microscopie van Hep3B cellen na 3 uur incubatie bij 37 ° C in EMEM met Cagedlijm-NBD (10 µM) gevolgd door spoelen met D-PBS. Microfoto werden opgenomen met 3-s intervallen op excitatie op 488 nm (λobs = 500-530 nm). De cellen die zich in de witte onderbroken cirkel waren bestraald met twee-foton NIR licht aan 710 nm gedurende 2 minuten (30 s × 4). Overgenomen met toestemming van referentie20. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vorige onderzoeken van licht-geactiveerd translocatie van eiwitten in de celkern hebben bereikt met behulp van gekooide NLS-7,-8,9. Zoals eerder vermeld, vereisen deze methoden additionele technieken te nemen de NLS-gelabelde proteïnen in het cytoplasma. Onze Cagedlijm-R tag kan daarentegen niet alleen foto-geïnduceerde nucleaire translocatie, maar ook cellulaire opname van de gasten. Deze functie van de Cagedlijm-R tag is voordelig voor in vivo toepassingen.

De Cagedlijm-R tag kan leveren macromoleculaire gasten zoals QDs in de celkern. Het QDs hier werkzaam zijn groter in diameter (D-H = 15-20 nm) dan de nucleaire poriën (~ 5 nm)24, suggereren de mogelijkheid te bieden andere macromoleculen die kunnen niet passief diffuus in de kern. Protocollen voor functionalization van biomacromoleculaire oppervlakken met azide groepen zijn gevestigde25; Bovendien, tags synthese van Cagedlijm-R tags rekening houdend met andere functionele groepen zoals maleimides, N- hydroxysuccinimide (NHS) esters, enzovoort, zoals een verankerende eenheid zal het verbreden van de toepasselijkheid van Cagedlijm-R aan diverse biomacromoleculen.

Onnodig te zeggen, is de kritische stap van deze methode de opneming van de gasten gelabeld met Cagedlijm-R via endocytosis. De efficiëntie van de cellulaire opname van de tagged gasten, is afhankelijk van de concentratie en de incubatietijd. Als gasten van belang, wanneer gelabeld met Cagedlijm-R, endocytosed inefficiënt, Incubeer de cellen langer met hogere concentratie van de tagged gasten. Een mogelijk alternatief is het vergroten van het aantal Cagedlijm-R opgenomen in de gast.

De gasten in dit protocol gebruikt zijn covalent geconjugeerd met de Cagedlijm-R tag. Dit is een potentieel nadeel vooral voor de levering van kleine-molecuul liganden, aangezien hun binding met het doel biomoleculen kan worden geremd door de omvangrijke dendritische tag. Opneming van een prikkels-responsieve linker26 tussen de Cagedlijm-R-tag en de gast-molecuul kan release van de gasten toestaan na nucleaire translocatie.

Kortom toonden we licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten met behulp van photoactivatable caged moleculaire lijm (Glue-RCaged) tags. De gasten gelabeld met Cagedlijm-R worden overgenomen in levende cellen via endocytose en blijven in de Endosomen. Op photoirradiation, wordt Cagedlijm-R geconverteerd naar Uncagedlijm-R, die de endosomal vlucht en de daaropvolgende nucleaire translocatie van de gasten vergemakkelijkt. Verder lange tijd opmerkingen te onderzoeken van het lot van de gasten die in het Endosomen, alsmede die blijven van belang kunnen zijn afgeleverd in de celkern. Spatiotemporally gecontroleerde genexpressie Cagedlijm-R tags te gebruiken is een interessant onderwerp waardig voor verder onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij erkennen het centrum voor NanoBio integratie, de Universiteit van Tokio. Dit werk was ondersteund door de Grant-in-Aid voor de wetenschappers (B) (26810046) van de jonge aan K.O. en slechts gedeeltelijk ondersteund door Grant-in-Aid speciaal bevorderd onderzoek (25000005) naar T.A. R.M. bedankt de Research Fellowships van Japan Society voor de promotie van wetenschap (JSPS ) voor jonge wetenschappers en het programma voor toonaangevende gediplomeerde scholen (GPLLI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
  13. Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Tags

Chemie kwestie 143 moleculaire lijm photoactivation celkern endosomal nucleaire translocatie twee-foton excitatie ontsnapping quantumdots
Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A.,… More

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter