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Chemistry

Spatiotemporally नियंत्रित परमाणु Photoactivatable टैग के रूप में बंदी आणविक गोंद का उपयोग कर कोशिकाओं में रहने वाले मेहमानों के Translocation

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58631
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन प्रकाश में मेहमानों के जीवित ट्रिगर परमाणु translocation का उपयोग कर कोशिकाओं को बंदी आणविक गोंद टैग । इस विधि साइट के लिए वादा कर रहा है-चयनात्मक परमाणु लक्ष्यीकरण दवा वितरण ।

Abstract

कोशिका नाभिक एक उपसेलुलर दवा वितरण लक्ष्य के रूप में सबसे महत्वपूर्ण organelles में से एक है, जीन प्रतिकृति और अभिव्यक्ति के मॉडुलन के बाद से विभिन्न रोगों के इलाज के लिए प्रभावी है । यहां, हम प्रदर्शन प्रकाश का उपयोग कर मेहमानों के परमाणु translocation को बंदी बनाकर आणविक गोंद (पिंजरागोंद-आर) टैग, जिसका एकाधिक guanidinium आयन (गुजरात+) पेंडेंट एक anionic photocleavable समूह द्वारा संरक्षित है (butyrate-प्रतिस्थापित nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC) । मेहमानों के साथ टैग की गईं पिंजरा गोंद आर endocytosis के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में ले रहे है और endosomes में रहते हैं । हालांकि, photoirradiation पर, पिंजरागोंद आर uncage आणविक गोंद में परिवर्तित (पिंजरा गोंद-आर) एकाधिक गुजरात+ पेंडेंट, जो endosomal भागने और मेहमानों के बाद परमाणु translocation की सुविधा ले जा रहा है । इस विधि साइट चयनात्मक परमाणु लक्ष्यीकरण दवा वितरण के लिए वादा किया है, क्योंकि टैग मेहमानों कोशिका द्रव्य में सेल नाभिक द्वारा पीछा किया ही जब photoirradiated में स्थानांतरित कर सकते हैं । पिंजरा लगाया गोंद-R टैग macromolecular मेहमानों जैसे क्वांटम डॉट्स (QDs) और साथ ही छोटे अणु मेहमानों को वितरित कर सकते हैं । पिंजरा लगाया गोंद आर टैग न केवल यूवी प्रकाश, लेकिन यह भी दो फोटॉन के पास अवरक्त (NIR) प्रकाश है, जो गहराई से ऊतक में घुसना कर सकते है के साथ अनबंदी किया जा सकता है ।

Introduction

कोशिका नाभिक, जो आनुवंशिक जानकारी वहन करती है, एक सेलुलर दवा वितरण लक्ष्य के रूप में सबसे महत्वपूर्ण organelles में से एक है, जीन प्रतिकृति और अभिव्यक्ति के मॉडुलन के बाद से कैंसर और आनुवंशिक सहित विभिन्न रोगों के इलाज के लिए प्रभावी है विकारों1,2,3. दवाओं के परमाणु वितरण के लिए, परमाणु स्थानीयकरण संकेतों (एनएलएस)4,5,6 के रूप में पेप्टाइड टैग की विकार व्यापक रूप से जांच की गई है । हालांकि, अवांछित दुष्प्रभावों को कम करने के लिए, परमाणु translocation के spatiotemporal नियंत्रण आवश्यक है ।

पहले, सेल नाभिक में प्रोटीन के प्रकाश ट्रिगर translocation एनएलएस7,8,9बंदी का उपयोग कर प्राप्त किया गया है । एनएलएस सेल नाभिक में cytoplasmic परिवहन प्रोटीन6के लिए बाध्य द्वारा विस्थापित । रिपोर्ट के तरीके में, अतिथि प्रोटीन असर बंदी एनएलएस सीधे microinjection द्वारा कोशिका द्रव्य में शामिल कर रहे है8 या लक्ष्य कोशिकाओं में व्यक्त की एक आनुवंशिक कोड विस्तार तकनीक9का उपयोग कर । इसलिए, एक तरीका है कि दोनों सेलुलर और फोटो प्रेरित परमाणु translocation प्राप्त कर सकते है व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए लाभप्रद है ।

इस के साथ साथ, हम प्रकाश का वर्णन वृक्ष बंदी आणविक गोंद (पिंजरेमें गोंद-R, चित्रा 1) टैग का उपयोग कर कोशिकाओं में रहने वाले मेहमानों के परमाणु translocation ट्रिगर । पानी में घुलनशील आणविक गोंद10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 असर एकाधिक गुजरात+ पेंडेंट पहले विकसित किया गया है, जो कसकर प्रोटीन का पालन11,12,13,14,15, 16,17, न्यूक्लिक एसिड18,19,20, फॉस्फोलिपिड झिल्ली21, और क्ले nanosheets22,23 के माध्यम से लक्ष्य पर अपने गुजरात+ पेंडेंट और oxyanionic समूहों के बीच कई नमक पुलों का गठन । गुजरात+ पिंजरा गोंद के पेंडेंट-R एक anionic photocleavable समूह, butyrate-प्रतिस्थापित nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) द्वारा संरक्षित कर रहे हैं । मेहमानों के साथ टैग की गईं पिंजरा गोंद आर endocytosis के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में ले रहे है और endosomes (चित्रा 2) में रहते हैं । photoirradiation पर, बापिंजरा गोंद के NVOC समूहों-r एक uncage में आणविक गोंद (पिंजरा गोंद-आर)एकाधिक गुजरात+ पेंडेंट, जो तो टैग अतिथि के प्रवास की सुविधा को लेकर उपज को अलग कर रहे है सेल नाभिक (चित्रा 2) द्वारा पीछा कोशिका द्रव्य में । पिंजरागोंद आर टैग यूवी या दो गंभीर phototoxicity के बिना अवरक्त (NIR) प्रकाश के लिए जोखिम से uncageed जा सकता है । हम macromolecular मेहमानों के spatiotemporally नियंत्रित परमाणु वितरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में पिंजरा गोंद आर टैग के साथ छोटे अणु मेहमानों का प्रदर्शन, क्वांटम डॉट्स (QDs) और एक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग कर (nitrobenzoxadiazole; NBD), क्रमशः उदाहरण के रूप में ।

Figure 1
चित्रा 1: पिंजरा गोंद के योजनाबद्ध संरचनाओं आर । पिंजरा गोंद के 9 guanidinium आयन (गुजरात+) पेंडेंट-R एक butyrate-स्थानापन्न nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) समूह द्वारा संरक्षित हैं. बीएNVOC समूहों यूवी या दो फोटॉन NIR प्रकाश के साथ विकिरण से सट रहे हैं । बंदीगोंद के फोकल कोर-R या तो nitrobenzoxadiazole (NBD) या dibenzocylooctyne (DBCO) के साथ कार्यात्मक है । संदर्भ20से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रकाश के योजनाबद्ध चित्रण-मेहमानों संयुग्मित के एक पिंजरा गोंद आर टैग के साथ परमाणु translocation ट्रिगर । अतिथि/पिंजरागोंद-R संयुग्मी endocytosis के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में ले लिया है । photoirradiation पर, पिंजरागोंद आर टैग के लिए एक uncage में गोंद-r टैग, जो टैग अतिथि के endosomal भागने की सुविधा कर सकते है uncage में है । इसके बाद, टैग किए गए अतिथि कक्ष नाभिक में माइग्रेट होता है । संदर्भ20से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Protocol

1. पिंजरा गोंद के साथ मेहमानों की तैयारी-R टैग

  1. पिंजरागोंद-NBD समाधान तैयार करें ।
    1. संश्लेषित गोंद-NBD (चित्रा 1) पहले20वर्णित प्रक्रियाओं के बाद ।
    2. सूखी dimethyl sulfoxide (DMSO ) में पिंजरा गोंद-NBD (10 मिमी) का एक शेयर समाधान तैयार करें ।
      नोट: अंधेरे में स्टॉक समाधान संग्रहीत करें । समाधान जलीय बफ़र्स या उपयोग पर सेल संस्कृति मीडिया के साथ पतला किया जा सकता है ।
  2. पिंजरागोंद-QD समाधान तैयार करें ।
    1. संश्लेषित गोंद-dibenzocylooctyne (पिंजरागोंद-DBCO) (चित्रा 1) पहले20वर्णित प्रक्रियाओं के बाद ।
    2. सूखी DMSO में पिंजरा गोंद-DBCO (10 मिमी) के एक शेयर समाधान तैयार करें ।
    3. पिंजरा गोंद की तैयारी के लिए-QD, पहले तैयार azide-कार्यात्मक QDs (azide-QD; चित्रा 3) । जोड़ें १०० एक dimethyl formamide के µ एल (DMF, १२५ µ एम) azide के समाधान-PEG4-एन एच एस एस्टर (चित्रा 3) एक µ के ४०० DMF एल (५०० एनएम) क्वांटम डॉट्स के समाधान (QDs) अमीन के साथ लेपित-कार्यात्मक खूंटी (अमीन-QD; चित्रा 3) । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मिश्रण हिलाओ ।
    4. Dialyze DMF के ८०० मिलीलीटर के खिलाफ 24 एच के लिए परिणामस्वरूप समाधान ३,५०० आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) के साथ एक पुनर्जीवित फाइबर झिल्ली का उपयोग कर ।
    5. DMF के साथ ५० µ मीटर के लिए पिंजरा गोंद-DBCO के शेयर समाधान पतला । पोस्ट-डायलिसिस समाधान (चित्रा 3) के समाधान के २०० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए मिश्रण हलचल ।
    6. Dialyze एक पुनर्जीवित फाइबर झिल्ली (२५,००० MWCO) का उपयोग कर DMF के ८०० मिलीलीटर के खिलाफ 24 एच के लिए परिणामी समाधान है ।
    7. DMF के साथ २०० एनएम के परिणामस्वरूप समाधान पतला ।

Figure 3
चित्रा 3: बंदीगोंद की तैयारी का योजनाबद्ध चित्रण-QD । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

2. सूक्ष्म टिप्पणियों के लिए Hep3B सेल नमूना तैयार करना

  1. ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम में मानव hepatocellular कार्सिनोमा Hep3B कोशिकाओं को बनाए रखने (EMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 5% CO2के तहत ३७ ° c में युक्त.
  2. प्रयोग के पहले दिन कोशिकाओं को सीड कर दीजिये । बीज ५.० × 103 Hep3B EMEM में एक 8-चैंबर्ड ग्लास सब्सट्रेट के प्रति अच्छी कोशिकाओं (10% FBS, २०० µ एल), और ३७ ° c के तहत 5% सह2 के लिए सेल नमूना गर्मी 24 ज के लिए ।
  3. संस्कृति माध्यम निकालें और Dulbecco के फॉस्फेट बफर खारा (डी-पंजाब) दो बार के १०० µ एल के साथ सेल नमूना कुल्ला ।

3. यूवी प्रकाश द्वारा ट्रिगर छोटे अणु मेहमानों के परमाणु Translocation का अवलोकन

  1. सेल नमूना आपूर्ति (२.३ चरण में तैयार) के २०० µ एल के साथ FBS मुक्त EMEM युक्त पिंजरागोंद-NBD (10 µ मीटर) और मशीन के परिणामस्वरूप सेल नमूना ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% सह2 के लिए 3 एच ।
    नोट: FBS में सेल नमूने की मशीन-मुक्त EMEM से अधिक 4 ज के लिए गंभीर कोशिका क्षति का कारण बनता है ।
  2. संस्कृति माध्यम निकालें और दो बार डी-पंजाबियों के १०० µ एल के साथ सेल नमूना कुल्ला ।
  3. endosomes के दृश्य के लिए, EMEM के २०० µ एल के साथ सेल नमूना आपूर्ति (10% FBS) एक लाल फ्लोरोसेंट डाई युक्त (जैसे, LysoTracker लाल, १०० एनएम), और के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर परिणामी सेल नमूना मशीन 5% CO2 के लिए 20 मिनट । संस्कृति को हटाएं मध्यम, और दो बार डी-पंजाबियों के १०० µ एल के साथ सेल नमूना कुल्ला । EMEM (10% FBS) के २०० µ l के साथ सेल नमूने की आपूर्ति ।
  4. बंदीगोंद के परमाणु translocation के लिए NBD, एक ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से 2 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के लिए सेल नमूना बेनकाब एक १००-W क्सीनन प्रकाश एक ३६५ एनएम bandpass फिल्टर के साथ सुसज्जित स्रोत का उपयोग कर । यूवी एक्सपोजर के बिना एक संदर्भ सेल नमूना के लिए, अंधेरे में सेल नमूना रखें ।
    नोट: ग्लास सब्सट्रेट्स के ढक्कन कुशल यूवी एक्सपोजर के लिए रवाना किए जा सकते हैं । लंबे समय से यूवी प्रकाश के लिए जोखिम कोशिकाओं को cytotoxicity कारण हो सकता है ।
  5. नाभिक के दृश्य के लिए, संस्कृति माध्यम करने के लिए Hoechst ३३३४२ (1 मिलीग्राम/एमएल) के 1 µ l जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 5% सह2 के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर परिणामी सेल नमूना मशीन ।
  6. फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग और ४८८ एनएम पर उत्तेजना पर माइक्रोग्राफ रिकॉर्ड करने के लिए सेल नमूना विषय (λobs = 500-530 एनएम), ५४३ एनएम (λobs = 565-620 एनएम), और ७१० एनएम (दो फोटॉन; λ obs = 390-465 एनएम) के लिए NBD, लाल फ्लोरोसेंट डाई, और Hoechst ३३३४२, क्रमशः ।

४. दो-फोटॉन NIR प्रकाश द्वारा उत्प्रेरित छोटे-अणु अतिथियों के नाभिकीय Translocation का अवलोकन

  1. सेल नमूना आपूर्ति (२.३ चरण में तैयार) के २०० µ एल के साथ FBS मुक्त EMEM युक्त पिंजरागोंद-NBD (10 µ मीटर) और मशीन के परिणामस्वरूप सेल नमूना ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% सह2 के लिए 3 एच ।
  2. संस्कृति माध्यम निकालें और दो बार डी-पंजाबियों के १०० µ एल के साथ सेल नमूना कुल्ला । EMEM (10% FBS) के २०० µ l के साथ सेल नमूने की आपूर्ति ।
  3. फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग और ४८८ एनएम पर उत्तेजना पर माइक्रोग्राफ रिकॉर्ड करने के लिए इस सेल नमूना विषय (λobs = 500-530 एनएम) ।
  4. पिंजरा गोंद के परमाणु translocation के लिए-NBD, विकीर्ण एक दो फोटॉन उत्तेजना लेजर (७१० एनएम), माइक्रोस्कोप में एक प्रकाश स्रोत के रूप में स्थापित के साथ ब्याज की कोशिका सहित क्षेत्र, 2 मिनट के लिए (30 एस × 4) । चरण ४.३ में वर्णित के रूप में translocation का निरीक्षण ।

5. यूवी प्रकाश द्वारा ट्रिगर Macromolecular मेहमानों के परमाणु Translocation का अवलोकन

  1. सेल नमूना आपूर्ति (२.३ चरण में तैयार) के २०० µ एल के साथ FBS मुक्त EMEM युक्त पिंजरागोंद-QD (10 एनएम), और गर्मी के परिणामस्वरूप सेल नमूना ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% सह2 के लिए 3 एच ।
  2. संस्कृति माध्यम निकालें और दो बार डी-पंजाबियों के १०० µ एल के साथ सेल नमूना कुल्ला । EMEM (10% FBS) के २०० µ l के साथ सेल नमूने की आपूर्ति ।
  3. बंदीगोंद के परमाणु translocation के लिए QD, एक ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से 2 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के लिए सेल नमूना बेनकाब एक १००-W क्सीनन प्रकाश एक ३६५ एनएम bandpass फिल्टर के साथ सुसज्जित स्रोत का उपयोग कर । यूवी एक्सपोजर के बिना एक संदर्भ सेल नमूना के लिए, अंधेरे में सेल नमूना रखें ।
  4. नाभिक के दृश्य के लिए, संस्कृति माध्यम करने के लिए Hoechst ३३३४२ (1 मिलीग्राम/एमएल) के 1 µ l जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 5% सह2 के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर परिणामी सेल नमूना मशीन ।
  5. फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग और ४०५ एनएम पर उत्तेजना पर माइक्रोग्राफ रिकॉर्ड (λobs = 430-520 एनएम) और ४८८ एनएम (λ obs = 625-680 एनएम) Hoechst ३३३४२ और QDs के लिए, क्रमशः के लिए सेल नमूना विषय ।

6. सेल व्यवहार्यता परख

  1. EMEM में मानव hepatocellular कार्सिनोमा Hep3B कोशिकाओं को बनाए रखने (10% FBS) ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% CO2में ।
  2. प्रयोग के पहले दिन कोशिकाओं को सीड कर दीजिये । बीज ५.० × 103 EMEM में एक अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के प्रति अच्छी तरह से Hep3B कोशिकाओं (10% FBS, २०० µ एल), और $३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% सह2 के लिए 24 घंटे के लिए सेल नमूना मशीन ।
  3. संस्कृति माध्यम निकालें और दो बार डी-पंजाबियों के १०० µ एल के साथ सेल नमूना कुल्ला ।
  4. FBS-मुक्त EMEM युक्त पिंजरा गोंद-NBD (0.1-100 µ एम) के २०० µ एल के साथ सेल नमूने की आपूर्ति और ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% सह2 के लिए परिणामस्वरूप सेल नमूना मशीन 3 एच ।
  5. एक ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से 2 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के लिए सेल नमूना बेनकाब एक ३६५ एनएम bandpass फिल्टर के साथ सुसज्जित एक १००-W क्सीनन प्रकाश स्रोत का उपयोग कर । यूवी जोखिम के बिना एक अनुरूप सेल नमूने के लिए, अंधेरे में सेल नमूना रखें.
  6. सेल गिनती किट के 10 µ l जोड़ें-संस्कृति माध्यम के लिए 8 एजेंट (10 µ एल) और ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% 2 ज के लिए सह2 के परिणामस्वरूप सेल नमूना मशीन ।
  7. एक microplate रीडर का उपयोग स्पेक्ट्रोस्कोपी (λ = ४५० एनएम) अवशोषण के लिए सेल नमूना विषय ।

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Representative Results

photoirradiation से पहले, पिंजरा गोंद के साथ Hep3B कोशिकाओं NBD उनके इंटीरियर से कबरा प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का प्रदर्शन किया (λext = ४८८ एनएम; आंकड़े 4a और 4c, हरा) । एक अनुरूप micrograph उत्तेजना पर लाल-फ्लोरोसेंट डाई (आंकड़े 4B और 4c, लाल) के लिए ५४३ एनएम पर प्राप्त किया गया था, यह दर्शाता है कि पिंजरागोंद-NBD endosomes में स्थानीयकृत । तदनुसार, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को आबंटित करने के लिए पिंजरा गोंद-NBD (चित्रा 4d, ग्रीन) सेल नाभिक है, जो Hoechst ३३३४२ (λext = ७१० एनएम, दो फोटॉन के साथ visualized था के बाहर मनाया गया था; चित्रा 4d, नीला) । यूवी विकिरण के बाद, NBD के कारण प्रतिदीप्ति उत्सर्जित कोशिकाओं (चित्रा 4E, हरे) नाभिक से भी (चित्रा 4E, नीले), सुझाव है कि पिंजरागोंद-NBD uncageed गोंद-NBD, जो में चले गए सेल नाभिक द्वारा पीछा कोशिका द्रव्य । इस तरह के परमाणु translocation के पिंजरा गोंद-NBD साइट प्रेरित किया जा सकता है-चुनिंदा द्वारा दो-फोटॉन NIR प्रकाश (चित्रा 5 और फिल्म 1, सफेद डैश्ड सर्कल) । जैसा कि चित्रा 5B और मूवी 1में दिखाया गया है, nonirradiated क्षेत्रों में पिंजरागोंद-NBD endosomes से नहीं बच पाया और कबरा प्रतिदीप्ति के रूप में बने रहे । कोई प्रशंसनीय cytotoxicity से पहले और यहां तक कि यूवी जोखिम (चित्रा 6) के बाद बंदीगोंद-NBD के साथ इलाज किया कोशिकाओं के लिए मनाया गया था ।

पिंजरागोंद आर टैग भी ऐसे सेल नाभिक में QDs के रूप में macromolecular मेहमानों को वितरित कर सकते हैं । QD/पिंजरागोंद-R संयुग्मी (पिंजरागोंद-QD, चित्रा 3) Hep3B कोशिकाओं (चित्रा 7A) में लिया जा सकता है । Hoechst ३३३४२ के साथ सेल नाभिक के दृश्य इंगित करता है कि पिंजरा गोंद-QD photoirradiation (चित्रा 7A) से पहले नाभिक के बाहर रहता है । 2 मिनट के लिए यूवी जोखिम के बाद, नाभिक में उभरा QDs के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (आंकड़े 7B और 7C) । एक पार कोशिकाओं के अनुभागीय छवि का प्रदर्शन किया है कि प्रतिदीप्ति QDs को आबंटित उत्सर्जन वास्तव में नाभिक के अंदर से उत्सर्जित है (आंकड़ा 7d) ।

Figure 4
चित्रा 4: Endosomal भागने और बंदीगोंद के परमाणु translocation-NBD यूवी प्रकाश द्वारा ट्रिगर । फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोग्राफ Hep3B कोशिकाओं के बाद 3-एच ३७ ° c में EMEM युक्त पिंजरा गोंद -NBD (10 µ m) में डी के साथ धोने के बाद-पंजाबियों । (A, B) माइक्रोग्राफ पर उत्तेजना पर दर्ज किया गया (A) ४८८ एनएम (λobs = 500-530 एनएम, हरा) और (ख) ५४३ एनएम(λobs = 565-620 एनएम, लाल) के बाद 20 EMEM में मिन मशीन (10% FBS) लाल-फ्लोरोसेंट डाई (१०० एनएम) युक्त . ( ग ) की विलय की गई छवि (क) और (ख). (डी, ई) माइक्रोग्राफ ४८८ एनएम पर उत्तेजना पर दर्ज (λobs = 500-530 एनएम, हरा) और ७१० एनएम (दो फोटॉन; λ obs = 390-465 एनएम, नीला) । Hep3B कोशिकाओं, पिंजरा गोंद के साथ इलाज-NBD, EMEM में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन (10% FBS) Hoechst ३३३४२ (5 µ g/एमएल) से पहले (D) और के बाद (ई) 2-३६५ एनएम पर ंयूनतम यूवी जोखिम से युक्त थे । स्केल पट्टियां = 20 µm. संदर्भ20से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: दो-फोटॉन NIR प्रकाश द्वारा ट्रिगर किया गया पिंजरा गोंद-NBD के परमाणु translocation । फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोग्राफ Hep3B कोशिकाओं के बाद 3-एच ३७ ° c में EMEM युक्त पिंजरा गोंद -NBD (10 µ m) में डी के साथ धोने के बाद-पंजाबियों । माइक्रोग्राफ ४८८ एनएम पर उत्तेजना पर दर्ज किया गया (λobs = 500-530 एनएम) से पहले (A) और उसके बाद (ख) दो ७१० एनएम में 2 मिनट के लिए फोटॉन विकिरण (30 एस × 4) । सफेद डैश्ड सर्कल में (A) विकिरणित क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल पट्टियां = 20 µm. संदर्भ20से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: सेल व्यवहार्यता परख । EMEM में पिंजरा गोंद युक्त Hep3B कोशिकाओं के Viabilities -NBD (0.1-100 µ मीटर) से पहले (A) और बाद (ख) 2-३६५ एनएम पर ंयूनतम यूवी जोखिम । संदर्भ20से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: परमाणु पिंजरा गोंद के translocation-QD यूवी प्रकाश द्वारा ट्रिगर । ४०५ एनएम पर उत्तेजना पर Hep3B कोशिकाओं के फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोग्राफ (λobs = 430-520 एनएम) और ४८८ एनएम (λobs = 625-680 एनएम) । Hep3B कोशिकाओं ३७ ° c में 3 ज के लिए बंदीगोंद युक्त EMEM में मशीन थे-QD (10 एनएम), डी-पंजाबियों के साथ कुल्ला, और फिर EMEM में 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन (10% FBS) युक्त Hoechst ३३३४२ (5 µ g/एमएल) से पहले (A) और के बाद (B, C) 2-ंयूनतम करने के लिए जोखिम यूवी ३६५ एनएम पर प्रकाश । ( D) क्रॉस-अनुभागीय छवि (C)में पीली रेखा के साथ । स्केल पट्टियां = 20 µm. संदर्भ20से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie
फिल्म 1. दो-फोटॉन NIR प्रकाश से उत्प्रेरित गोंद-NBD के परमाणु translocation । समय चूक फोकल लेजर स्कैनिंग EMEM युक्त गोंद-NBD (10 µ मीटर) में डी-पंजाबियों के साथ धोने के बाद ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3-एच की मशीन के बाद Hep3B कोशिकाओं के माइक्रोस्कोप । माइक्रोग्राफ उत्तेजना पर 3-s अंतराल के साथ ४८८ एनएम पर दर्ज किया गया (λobs = 500-530 एनएम) । सफेद डैश्ड सर्कल में स्थित कक्ष दो-फोटॉन NIR लाइट के साथ 2 मिनट (30 एस × 4) के लिए ७१० एनएम पर विकिरणित थे । संदर्भ20से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

सेल नाभिक में प्रकाश ट्रिगर प्रोटीन की translocation के पिछले जांच के पिंजरा एनएलएस7,8,9का उपयोग कर प्राप्त किया गया है । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, इन तरीकों अतिरिक्त तकनीक की आवश्यकता को शामिल एनएलएस-कोशिका द्रव्य में टैग प्रोटीन । इसके विपरीत, हमारे पिंजरागोंद आर टैग न केवल फोटो प्रेरित परमाणु translocation लेकिन यह भी मेहमानों के सेलुलर अधिक सक्षम बनाता है । पिंजरा गोंद आर टैग की इस सुविधा के लिए vivo अनुप्रयोगों में लाभप्रद है ।

पिंजरागोंद-R टैग macromolecular मेहमानों को इस तरह के सेल नाभिक में QDs के रूप में वितरित कर सकते हैं । यहां कार्यरत QDs व्यास में बड़ा (डीएच = 15-20 एनएम) परमाणु pores से (~ 5 एनएम)24, संभावना को अंय अणुओं कि नहीं निष्क्रिय नाभिक में फैलाना कर सकते है उद्धार सुझाव दे रहे हैं । azide समूहों के साथ biomacromolecular सतहों के functionalization के लिए प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं25; इसके अलावा, पिंजरा गोंद आर के संश्लेषण ऐसे maleimides के रूप में अंय कार्यात्मक समूहों असर टैग, N-hydroxysuccinimide (एन एच एस) एस्टर, और एक लंगर इकाई के रूप में बहुत आगे के लिए विभिंन पिंजरागोंद आर टैग की प्रयोज्यता व्यापक होगा biomacromolecules ।

कहने की जरूरत नहीं है, इस विधि के महत्वपूर्ण कदम पिंजरा गोंद के साथ टैग की गईं मेहमानों का निगम है-R via endocytosis । टैग मेहमानों के सेलुलर के ऊपर की क्षमता उनकी एकाग्रता और मशीन समय पर निर्भर करता है । ब्याज के मेहमानों को, जब बंदीगोंद के साथ टैग-आर, endocytosed अकुशल, कर रहे है कोशिकाओं को टैग मेहमानों की उच्च एकाग्रता के साथ अब गर्मी । एक संभव विकल्प को बंदीगोंद की संख्या में वृद्धि-आर अतिथि में शामिल है ।

इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त मेहमानों को पिंजरा गोंद-R टैग करने के लिए covalently संयुग्मित हैं । यह विशेष रूप से छोटे अणु लाइगैंडों की डिलीवरी के लिए एक संभावित नुकसान है, क्योंकि उनके लक्ष्य के लिए बाध्यकारी अणुओं भारी वृक्ष टैग द्वारा बाधित किया जा सकता है । एक उत्तेजनाओं के शामिल-उत्तरदाई26 के बीच पिंजरा गोंद आर टैग और अतिथि अणु परमाणु translocation के बाद मेहमानों की रिहाई की अनुमति हो सकती है ।

सारांश में, हम प्रकाश का प्रदर्शन किया photoactivatable बंदी आणविक गोंद (पिंजरेमें गोंद-आर) टैग का उपयोग कर मेहमानों के परमाणु translocation ट्रिगर । बंदीगोंद के साथ टैग मेहमानों-आर endocytosis के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में ले रहे है और endosomes में रहते हैं । photoirradiation पर, पिंजरागोंद आर uncageा गोंद -r, जो endosomal भागने और मेहमानों के बाद परमाणु translocation की सुविधा में परिवर्तित कर दिया है । आगे लंबे समय से टिप्पणियों के लिए मेहमानों के भाग्य की जांच महत्वपूर्ण हो सकता है कि endosomes में रहने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उन लोगों को सेल नाभिक में दिया । Spatiotemporally नियंत्रित जीन की अभिव्यक्ति का उपयोग कर पिंजरा गोंद आर टैग एक दिलचस्प आगे की जांच के योग्य विषय है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम NanoBio एकीकरण, टोक्यो विश्वविद्यालय के लिए केंद्र स्वीकार करते हैं । यह काम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था युवा वैज्ञानिकों के लिए सहायता (ख) (२६८१००४६) K.O. करने के लिए और आंशिक रूप से अनुदान द्वारा समर्थित विशेष रूप से पदोन्नत अनुसंधान के लिए सहायता (२५०००००५) T.A. R.M. धन्यवाद विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान समाज के अनुसंधान फैलोशिप (JSPS ) युवा वैज्ञानिकों और अग्रणी स्नातक स्कूलों (GPLLI) के लिए कार्यक्रम के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

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References

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रसायन विज्ञान अंक १४३ आणविक गोंद photoactivation सेल नाभिक endosomal एस्केप नाभिकीय translocation दो-फोटॉन उत्तेजना क्वांटम डॉट्स
Spatiotemporally नियंत्रित परमाणु Photoactivatable टैग के रूप में बंदी आणविक गोंद का उपयोग कर कोशिकाओं में रहने वाले मेहमानों के Translocation
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Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

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