Summary
このプロトコルでは、ケージ分子接着剤タグを使用して生きている細胞での核内移行を光トリガーについて説明します。このメソッドは、サイト選択的核ターゲット ドラッグデリバリーの有望です。
Abstract
細胞核は、遺伝子の複製の変調から最も重要な細胞内小器官の一つを細胞内薬物送達ターゲットとして、式は様々 な疾患の治療に有効です。ここでは、光トリガー核移行を利用するお客様のケージが複数のためイオン (Gu+) ペンダント (酪酸置換アニオン光分解性グループによって保護されて分子接着剤 (ケージ接着剤 R) タグを紹介します。nitroveratryloxycarbonyl;BANVOC)。ボールリテーナ入り接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソームのまま。しかし、光照射に伴い、ボールリテーナ入り接着剤-R がアンケージ分子接着剤 (Uncaged接着剤-R) 複数の区+ペンダントを運ぶエンドソーム脱出とゲストの後の核移行を容易にするに変換されます。このメソッドは、タグ付けのお客様は細胞核に続いて細胞質に移行できますので核ターゲット サイト選択の薬物送達のための有望な場合にのみ長。ケージ接着剤 R タグは、小分子のお客様だけでなく、量子ドット (Qd) など高分子のゲストを提供できます。ケージ接着剤 R タグは紫外線だけでなく、組織に深く浸透することができます, 二光子励起近赤外線 (NIR) ライトとケージですることができます。
Introduction
遺伝情報を運ぶ、細胞核の 1 つ最も重要な細胞内小器官細胞内薬物送達ターゲットとして遺伝子複製の変調から式は、がんを含むさまざまな病気の治療に有効と遺伝1,2,3 を障害します。薬のデリバリー、ペプチドの活用は、ような核局在化信号 (NLS)4,5,6が広く検討されているタグを付けます。ただし、望ましくない副作用を減らすために核移行の時空間的制御が必要です。
以前は、ケージ NLS7,8,9を使用して、細胞の核蛋白質の光トリガー転流を実現しています。NLS は、6細胞質輸送タンパク質に結合して細胞核に移行します。報告の方法でケージの NLS を軸受ゲスト蛋白質はマイクロインジェクション8で細胞質に組み込まれてまたは遺伝コードの拡張手法9を使用してターゲット細胞で発現直接。したがって、細胞内取り込みと光誘起核移行を実現できる手法は実用的なアプリケーションのために有利です。
ここで、細胞樹状突起のケージ分子接着 (ボールリテーナ入り接着剤-R は、図 1) タグを使用してお客様の核内移行を光トリガーをについて説明します。水溶性の分子接着剤10、11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,タンパク質11,12,13,14,15、しっかりと接着した23複数区+ペンダントをベアリングが以前開発されています。 16,17, 核酸18,19、20、リン脂質膜21、そして粘土ナノシート22,23を通じて、複数の塩橋区+ペンダントとターゲットにされグループの形成。ボールリテーナ入り接着剤-R の区+ペンダントは光分解性陰イオン グループ、酪酸置換 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) によって保護されています。ボールリテーナ入り接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソーム (図 2) でご滞在。光照射に伴い、ボールリテーナ入り接着剤-R のBANVOC グループは、アンケージ分子接着剤 (Uncaged接着剤-R) 複数の区+ペンダントを運ぶタグ ゲストの移行を容易に屈する戸建します。細胞質は細胞核 (図 2) が続きます。ボールリテーナ入り接着剤 R タグが紫外線や深刻な毒性なし二光子励起近赤外線 (NIR) ライトへの露出によってケージですることができます。高分子のお客様だけでなく、小分子ボールリテーナ入り接着剤 R タグ量子ドット (Qd) と蛍光色素 (nitrobenzoxadiazole; を使用してお客様の時空制御の核配信を紹介します。NBD) の例として、それぞれ。
ボールリテーナ入り接着剤-R の図 1: 概略構造ボールリテーナ入り接着剤-R の 9 のためのイオン (Gu+) ペンダントが酪酸置換 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) グループによって保護されています。BANVOC グループは二光子励起近赤外光照射によって裂かれます。ボールリテーナ入り接着剤研究の焦点のコアは nitrobenzoxadiazole (NBD) または dibenzocylooctyne (DBCO) のいずれかで修飾します。参照20から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: お客様の核内移行を光トリガーの模式図ボールリテーナ入り接着剤 R タグを持つ共役します。ゲスト/ボールリテーナ入り接着剤 R 共役は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスを介して。光照射に伴い、ボールリテーナ入り接着剤 R タグはタグ ゲストのエンドソーム脱出を容易にすることができますUncaged接着剤 R タグを生成するケージではありません。その後、タグ付けのゲストは、細胞核に移行します。参照20から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Protocol
1. 接着剤-R のケージでお客様の準備のタグします。
- ボールリテーナ入り接着剤 NBD ソリューションを準備します。
- ボールリテーナ入り接着剤 NBD (図 1) を次の手順に説明した20を合成します。
- 乾燥ジメチルスルホキシド (DMSO) でボールリテーナ入り接着剤-NBD (10 mM) の原液を準備します。
注: は、暗闇の中で原液を保存します。ソリューションは、水性バッファーまたは使用時の細胞培養媒体で希釈することができます。
- ボールリテーナ入り接着剤 QD ソリューションを準備します。
- ボールリテーナ入り接着剤 dibenzocylooctyne (ボールリテーナ入り接着剤-DBCO) の合成 (図 1)20以前の手順を説明します。
- 乾燥 DMSO のボールリテーナ入り接着剤-DBCO (10 mM) の原液を準備します。
- ボールリテーナ入り接着剤-量子ドットの作製、アジ化修飾ドット (アジ化量子ドット; をまず準備します。図 3)。DMF の 400 μ L に 100 μ L のアジド PEG4 NHS エステル (図 3) のジメチル ホルムアミド (DMF、125 μ M) ソリューションを追加 (500 nM) アミン修飾 PEG (アミン QD; でコーティングされた量子ドット (Qd) のソリューション図 3)。室温で 1 h の混合物をかき混ぜなさい。
- 24 h 3,500 分子量カットオフ (MWCO) で再生セルロース膜を使用して DMF の 800 mL に対しての得られた溶液を dialyze します。
- ボールリテーナ入り接着剤-DBCO 50 μ m に DMF の原液を希釈します。後透析液 (図 3) にソリューションの 200 μ L を追加し、室温で 3 h の混合物をかき混ぜなさい。
- 再生セルロース膜 (25,000 MWCO) を使用して DMF の 800 mL に対して 24 時間の結果のソリューションを dialyze します。
- 200 に得られた溶液を希釈 DMF の nM。
図 3:ボールリテーナ入り接着剤-量子ドットの作製の模式図.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
2. 顕微鏡観察の Hep3B 細胞サンプルの調製
- イーグル最小必須培地 (実装された EMEM) 37 ° C で 5% 未満 10% 牛胎児血清 (FBS) を含む人間の肝細胞癌 Hep3B 細胞を維持 CO2。
- 種細胞実験の前日。実装された EMEM の 8 室のガラス基板のウェルあたりの種子 5.0 × 103 Hep3B 細胞 (10 %fbs、200 μ L)、37 ° c 未満 5% 細胞サンプルをインキュベートと 24 h の CO2 。
- 培を取り外してダルベッコ リン酸バッファー生理食塩水 (D-PBS) 100 μ L でセルのサンプルを 2 回すすいでください。
3. 紫外線によって引き起こされる小分子ゲストの核移行の観察
- ボールリテーナ入り接着剤 NBD を含む無料の FBS EMEM の 200 μ L でセルのサンプル (の準備ステップ 2.3) を供給 (10 μ M) 37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベートして 3 h の CO2 。
注意: FBS 無料 4 h 以上実装された EMEM の細胞サンプルの培養は、深刻な細胞の損傷を引き起こします。 - 培を削除、D pbs 100 μ L でセルのサンプルを 2 回すすいでください。
- エンドソームの可視化、実装された EMEM の 200 μ L でセルのサンプルを供給 (10 %fbs) 赤色蛍光色素が含まれている (例えばLysoTracker 赤、100 nM)、37 ° C で結果のセルのサンプルをインキュベートし、5% 未満 20 分の CO2を削除、文化媒体とすすぎ 2 回 D pbs 100 μ L でセルのサンプル。EMEM の 200 μ L で細胞サンプルを供給 (10 %fbs)。
- ボールリテーナ入り接着剤 NBD の核移行は、UV ライト 2 分で365 nm バンドパス フィルター搭載 100 W キセノン光源を用いた光ファイバーにセルのサンプルを公開します。紫外線露出なし参照セルのサンプル、暗闇の中でセルのサンプルを保ちます。
注: ガラス基板上の蓋は、効率的な紫外線露出のため撮影することができます。紫外線に長時間露光は、細胞に細胞毒性を引き起こす可能性があります。 - 核の可視化、培養液にヘキスト 33342 (1 mg/mL) の 1 μ L を追加し、37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベート 10 分の CO2 。
- 共焦点レーザ走査型顕微鏡の細胞サンプルを対象し、励起 488 で顕微鏡写真を記録 nm (λobs = 500 530 nm)、543 nm (λobs = 565 620 nm)、および 710 nm (光子;Λobs = 390-465 nm)、NBD、赤い蛍光染料、ヘキスト 33342、それぞれ。
4. 小分子ゲスト二光子励起近赤外光によるトリガーの核移行の観察
- ボールリテーナ入り接着剤 NBD を含む無料の FBS EMEM の 200 μ L でセルのサンプル (の準備ステップ 2.3) を供給 (10 μ M) 37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベートして 3 h の CO2 。
- 培を削除、D pbs 100 μ L でセルのサンプルを 2 回すすいでください。EMEM の 200 μ L で細胞サンプルを供給 (10 %fbs)。
- 共焦点レーザ走査型顕微鏡の細胞サンプルを対象し、励起 488 で顕微鏡写真を記録 nm (λobs = 500 530 nm)。
- ボールリテーナ入り接着剤 NBD の核移行の 2 光子励起レーザー興味のセルを含む領域を照射 (710 nm)、2 分間 (30 秒 × 4)、顕微鏡の光源としてインストールされています。4.3 の手順で説明するように、転流を観察します。
5. 紫外線によって引き起こされる高分子のゲストの核移行の観察
- ボールリテーナ入り接着剤-ドットを含む無料の FBS EMEM の 200 μ L でセルのサンプル (の準備ステップ 2.3) を供給 (10 nM)、37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベートして 3 h の CO2 。
- 培を削除、D pbs 100 μ L でセルのサンプルを 2 回すすいでください。EMEM の 200 μ L で細胞サンプルを供給 (10 %fbs)。
- ボールリテーナ入り接着剤 QD の核移行は、UV ライト 2 分で365 nm バンドパス フィルター搭載 100 W キセノン光源を用いた光ファイバーにセルのサンプルを公開します。紫外線露出なし参照セルのサンプル、暗闇の中でセルのサンプルを保ちます。
- 核の可視化、培養液にヘキスト 33342 (1 mg/mL) の 1 μ L を追加し、37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベート 10 分の CO2 。
- 共焦点レーザ走査型顕微鏡の細胞サンプルを対象し、405 で励起による顕微鏡写真を記録 nm (λobs = 430 520 nm) と 488 nm (λobs = 625-680 nm) ヘキスト 33342、量子ドット、それぞれ。
6. セル実行可能性の試金
- 実装された EMEM のひと肝細胞癌 Hep3B 細胞を維持 (10 %fbs) 37 ° c 未満 5% CO2。
- 種細胞実験の前日。実装された EMEM の 96 ウェル培養プレートのウェルあたりの種子 5.0 × 103 Hep3B 細胞 (10 %fbs、200 μ L)、37 ° c 未満 5% 細胞サンプルをインキュベートと 24 h の CO2 。
- 培を削除、D pbs 100 μ L でセルのサンプルを 2 回すすいでください。
- ボールリテーナ入り接着剤 NBD を含む無料の FBS EMEM の 200 μ L で細胞サンプルを供給 (0.1-100 μ M) 37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベートして 3 h の CO2 。
- 365 nm バンドパス フィルター搭載 100 W キセノン光源を用いた光ファイバー経由で2 分紫外線細胞サンプルを公開します。紫外線露出なし類似細胞サンプル、暗闇の中でセルのサンプルを保ちます。
- 培に携帯はキット 8 カウント試薬 (10 μ L) の 10 μ L を追加し、37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベート 2 h の CO2 。
- 吸収分光法対象セルのサンプル (λ = 450 nm) マイクロ プレート リーダーを使用しています。
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Representative Results
、光照射前にボールリテーナ入り接着剤 NBD と培養 Hep3B 細胞展示、インテリアから点状蛍光性の放出 (λext = 488 nm;図 4 aと4 C、緑)。543 で励起による得られた類似の顕微鏡写真、エンドソームにボールリテーナ入り接着剤 NBD がローカライズされているを示す赤色蛍光色素 (図 4 b 4 C、赤) の nm。したがって、ボールリテーナ入り接着剤 NBD (図 4、緑) に割り当てることができる蛍光性の放出がヘキスト 33342 で可視化された細胞の核外観察された (λext = 710 nm、光子。図 4青)。UV 照射後 NBD (図 4E、緑) による放出される細胞蛍光も (図 4E、青)、核から示唆ボールリテーナ入り接着剤 NBD に移行収量Uncaged接着剤-NBD、ケージが細胞質は細胞核が続きます。ボールリテーナ入り接着剤 NBD のような核転座によって誘導されうるサイト選択的に二光子励起近赤外光 (図 5 aと映画 1、白い破線の円)。図 5Bと映画 1のようにあわせたエリアのボールリテーナ入り接着剤 NBD はエンドソームからエスケープしていないと点状蛍光として残った。紫外線照射 (図 6) でも前後にボールリテーナ入り接着剤 NBD と細胞にかなり毒性は認められなかった。
ボールリテーナ入り接着剤 R タグは、量子ドットなど、細胞の核のゲスト高分子を配信することも。量子ドット/ボールリテーナ入り接着剤 R 共役 (ボールリテーナ入り接着剤 QD、図 3) Hep3B 細胞 (図 7 a) をとることができます。ヘキスト 33342 の細胞核の可視化 (図 7 a) 照射前に核外ボールリテーナ入り接着剤 QD が保たれていることを示します。2 分間の紫外線暴露後量子ドットの蛍光性の放出は核 (図 7 b 7 C) の浮上しました。セルの断面イメージを示した量子ドットに割り当て可能な蛍光性の放出が核 (図 7) の中確かにから生成されます。
図 4: エンドソーム脱出とボールリテーナ入り接着剤-NBD 紫外線によって引き起こされるの核内移行します。ボールリテーナ入り接着剤 NBD を含む実装された EMEM の 37 ° C で 3 時間培養後の共焦点レーザースキャニング Hep3B 細胞の顕微鏡写真 (10 μ M) に続いて D PBS で洗浄します。(A B)顕微鏡写真(A) 488、振動時に記録された nm (λobs = 500 530 nm、緑) と(B) 543 nm (λobs = 565 620 nm、赤色) 実装された EMEM の 20 分後 (10 %fbs) 赤色蛍光色素が含まれている (100 nM).(C) (A)および(B)のマージされた画像。(D, E)488 で励起による顕微鏡写真記録 nm (λobs = 500 530 nm、緑) と 710 nm (光子;Λobs = 390-465 nm、青色)。ボールリテーナ入り接着剤-NBD と扱われる Hep3B 細胞培養で実装された EMEM 37 ° C (10 %fbs) ヘキスト 33342 (5 μ g/mL) (D) (E) 2 分紫外線 365 で前後を含む nm。スケール バー = 20 μ m. 転載参照20から権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:ボールリテーナ入り接着剤-NBD 二光子励起近赤外光によるトリガーの核移行します。ボールリテーナ入り接着剤 NBD を含む実装された EMEM の 37 ° C で 3 時間培養後の共焦点レーザースキャニング Hep3B 細胞の顕微鏡写真 (10 μ M) に続いて D PBS で洗浄します。顕微鏡は励起 488 で記録された nm (λobs = 500 530 nm) (A) (B) 2 光子照射 710 前後 2 分間 (30 秒 × 4) nm。( A) 白い破線の円は、照射領域を表します。スケール バー = 20 μ m. 転載参照20から権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: セル実行可能性の試金。ボールリテーナ入り接着剤 NBD を含む実装された EMEM のインキュベーション後 Hep3B セル目 (0.1-100 μ M) (A) 、 (B) 2 分紫外線 365 で前後 nm。参照20から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 紫外線によって引き起こされるボールリテーナ入り接着剤 QD の核移行します。共焦点レーザー走査励起 405 Hep3B 細胞の顕微鏡写真 nm (λobs = 430 520 nm) と 488 nm (λobs = 625-680 nm)。37 ° C で実装された EMEMボールリテーナ入り接着剤-ドットを含む 3 h で Hep3B 細胞培養 (10 nM)、D-PBS で洗浄、その後実装された EMEM の 10 分の 37 ° C で培養した (10 %fbs) ヘキスト 33342 (5 μ G/ml) 前(A)に、と(B, C)の 2 分露出紫外線に後を含む光 365 nm。(D) (C)で黄色の線に沿って断面のイメージ。スケール バー = 20 μ m. 転載参照20から権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ムービー 1。核内移行ボールリテーナ入り二光子励起近赤外光によって引き起こされる接着剤 NBD 。コマ撮りレーザーで実装された EMEMボールリテーナ入り接着剤 NBD を含む 37 ° C 3 時間培養後 Hep3B 細胞の顕微鏡 (10 μ M) に続いて D PBS で洗浄します。顕微鏡は励起 488 で 3 の間隔で記録された nm (λobs = 500 530 nm)。710 で光の二光子励起近赤外照射した白い破線の円内にある細胞を 2 分間 (30 秒 × 4) nm。参照20から許可を得て転載。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
タンパク質の光トリガーの転流、細胞の核の前の調査は、ケージ NLS7,8,9を使用して達成されています。前述したように、これらのメソッドに NLS タグ付きタンパク質の細胞質を組み込む付加的な技術が必要です。対照的に、私たちボールリテーナ入り接着剤 R タグにより誘起核移行だけでなく、ゲストの細胞内取り込みできます。ボールリテーナ入り接着剤 R タグのこの機能は、生体内でアプリケーションで有利です。
ボールリテーナ入り接着剤 R タグは、量子ドットなど、細胞の核のゲスト高分子を提供できます。ここで採用されているドットが大きい直径 (DH = 15 ~ 20 nm) 核気孔より (〜 5 nm)24核に拡散できない受動的他の高分子を提供する可能性を示唆しています。アジ化グループを持つ生体高分子表面の機能化のためのプロトコルが確立した25;さらに、アンカー ユニットはボールリテーナ入り接着剤-R の適用を広げるマレイミド、 N- ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステルなどの他の機能グループを含むボールリテーナ入り接着剤 R タグの合成タグ各種生体高分子。
言うまでもなく、このメソッドの重要なステップを介してエンドサイトーシスボールリテーナ入り接着剤-R が付いたお客様の混入であります。タグお客様の細胞取り込みの効率は、その濃度と培養時間に依存します。ボールリテーナ入り接着剤-R が付いたとき、関心のお客様は貪食を効率的、タグのお客様の高い濃度で長くセルを孵化させなさい。可能な選択肢は、ボールリテーナ入り接着剤-R 組み込まれて、ゲストの数を増やすことです。
このプロトコルで使われるお客様はボールリテーナ入り接着剤 R タグに共役しました。かさばる樹状タグでターゲット生体分子への結合が阻害されるかもしれないので、これは特に小分子リガンドの配信のための潜在的な欠点です。ボールリテーナ入り接着剤-R タグとゲスト分子の刺激応答性リンカー26定款があります核移行ゲストのリリースを許可します。
要約すると、我々 はケージ活性型分子接着剤 (ボールリテーナ入り接着剤-R) タグを使用しているゲストの核内移行を光トリガーを実証しました。ボールリテーナ入り接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソームのまま。光照射に伴い、ボールリテーナ入り接着剤-R はUncaged接着剤-R、エンドソーム脱出とゲストの後の核移行を容易にするに変換されます。更に長い時間観察はそれらと同様、エンドソーム内に残っているお客様の運命を調べる必要があります細胞核に配信。ボールリテーナ入り接着剤 R タグを用いた時空制御遺伝子発現は、さらなる調査の価値がある面白い主題です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ナノバイオの統合、東京の大学中心を認めます。この作品は文部の若手研究 (B) (26810046) k. o. して、部分的にサポート費補助金特別推進研究 (25000005). a. r. m. のおかげで日本社会の研究奨学金のための科学振興) 若手研究者の博士課程教育リーディング (GPLLI) のためのプログラム。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Azide-PEG4-NHS ester | Click Chemistry Tools | AZ103 | |
Q-dot 655 ITK | Invitrogen | Q21521MP | |
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) | NIPPON Genetics | TOR-3K | |
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) | Harvard Apparatus | 7425-RC25K | |
Hep3B Cells | ATCC | HB-8064 | |
8-chambered glass substrate | Nunc | 155411JP | |
96-well culture plate | Nunc | 167008 | |
Eagle's minimal essential medium (EMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10370-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare | SH30406.02 | |
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) | Wako Pure Chemical Industries | 045-29795 | |
LysoTracker Red | Lonza Walkersville | PA-3015 | |
Hoechst 33342 | Dojindo | H342 | |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
Confocal laser scanning microscope | Carl-Zeiss | LSM 510 | Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics) |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
Xenon light source | Asahi Spectra | LAX-102 | |
Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax Paradigm |
References
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