Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Spatiotemporally kontrollert kjernefysiske translokasjon av gjester i levende celler med bur molekylær lim som Photoactivatable Tags

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58631
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Denne protokollen beskriver lys-utløst kjernefysiske translokasjon av gjester i levende celler ved hjelp av bur molekylær lim koder. Denne metoden er lovende for området-selektiv kjernefysiske målretting stoffet levering.

Abstract

Cellekjernen er en av de viktigste organelles som subcellular narkotikarelaterte levering mål, siden modulering av genet replikering og uttrykket er effektive for behandling av ulike sykdommer. Her viser vi lys-utløst kjernefysiske translokasjon av Gjester som bruker bur molekylær lim (burlim-R) koder, som flere guanidinium ion (Gu+) anheng er beskyttet av en anionic photocleavable gruppe (butyrate-substituert nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gjestene merket med Cagedlim-R er tatt opp til levende celler via endocytose og forblir i endosomes. Men på photoirradiation konverteres Cagedlim-R til uncaged molekylær lim (Uncagedlim-R) bærer flere Gu+ anheng, som forenkler endosomal rømme og påfølgende kjernefysiske translokasjon av gjestene. Denne metoden er lovende for området-selektiv kjernefysiske målretting stoffet levering, siden merket gjestene kan overføre til cytoplasma etterfulgt av cellekjernen bare når photoirradiated. Bur Lim-R tags kan levere macromolecular Gjester som kvante prikker (QDs) og små-molekylet gjester. Bur Lim-R tags kan uncaged ikke bare UV lys, men også to-fotonet (NIR) røyken, som kan trenger dypt inn i vev.

Introduction

Cellekjernen, som bærer genetisk informasjon, er en av de viktigste organelles som subcellular narkotikarelaterte levering mål, siden modulering av genet replikering og uttrykket er effektive for behandling av ulike sykdommer, inkludert kreft og genetiske lidelser1,2,3. Kjernefysisk levering av narkotika, Bøyning av peptid koder som kjernefysisk lokalisering signaler (NLS)4,5,6 har blitt mye undersøkt. For å redusere uønskede bivirkninger, er imidlertid spatiotemporal kontroll over kjernefysiske translokasjon nødvendig.

Tidligere er lys-utløst translokasjon av proteiner til cellekjernen oppnådd med bur NLS7,8,9. NLS overfører til cellekjernen ved binding til cytoplasmatiske transport proteiner6. I rapporterte metoder, gjest proteiner bærer bur NLS direkte innlemmet i cytoplasma av microinjection8 eller uttrykt i målcellene bruker en genetisk kode ekspansjon teknikk9. Derfor er en metode som kan oppnå både mobilnettet opptak og foto-indusert kjernefysiske translokasjon fordelaktig for praktiske anvendelser.

Her beskriver vi lys-utløst kjernefysiske translokasjon av gjester i levende celler ved hjelp av dendrittiske bur molekylær lim (Cagedlim-R, figur 1) koder. Vannløselige molekylær lim10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 bærer flere Gu+ anheng er tidligere utviklet, som strengt overholder proteiner11,12,13,14,15, 16,17, nukleinsyrer18,19,20, phospholipid membraner21og leire nanosheets22,23 gjennom den dannelsen av flere salt broer mellom Gu+ anheng og oxyanionic grupper på målene. Gu+ anheng av Cagedlim-R er beskyttet av en anionic photocleavable, butyrate-substituert nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gjestene merket med Cagedlim-R er tatt opp til levende celler via endocytose og opphold i endosomes (figur 2). På photoirradiation, er BANVOC gruppene av Cagedlim-R frittliggende for å gi en uncaged molekylær lim (Uncagedlim-R) bærer flere Gu+ anheng, som så forenkler overføringen av merket gjestene i cytoplasma etterfulgt av cellekjernen (figur 2). Cagedlim-R koden kan være uncaged av eksponering for UV eller to-fotonet (NIR) røyken uten alvorlige Phototoksisitet. Vi viser spatiotemporally kontrollert kjernefysiske levering av macromolecular gjester samt små molekyl gjestene Cagedlim-R koder, kvante prikker (QDs) og en fluorescerende farge (nitrobenzoxadiazole; NBD), henholdsvis som eksempler.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk strukturer av Cagedlim-R. 9 guanidinium ion (Gu+) anhengene Cagedlim-r er beskyttet av en butyrate-substituert nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) gruppe. BANVOC gruppene er kløyvde av bestråling med UV eller to-fotonet NIR lys. Fokal kjernen av Cagedlim-R er functionalized nitrobenzoxadiazole (NBD) eller dibenzocylooctyne (DBCO). Gjengitt med tillatelse fra referanse20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av lys-utløst kjernefysiske translokasjon av gjester konjugert med en Cagedlim-R kode. Gjesten /Cagedlim-R konjugert er tatt til levende celler via endocytose. På photoirradiation er Cagedlim-R taggen uncaged å gi en Uncagedlim-R-kode, som kan lette endosomal rømning av merket gjestene. Deretter overfører merket gjestene til cellekjernen. Gjengitt med tillatelse fra referanse20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av gjestene burlim-R koder

  1. Forberede Cagedlim-NBD løsning.
    1. Syntetisere Cagedlim-NBD (figur 1) følgende prosedyrer beskrevet tidligere20.
    2. Forberede en lagerløsning av Cagedlim-NBD (10 mM) i tørr dimethyl sulfoxide (DMSO).
      Merk: Lagre lager løsningen i mørket. Løsningen kan fortynnes med vandig buffere eller celle kultur medier på bruk.
  2. Forberede Cagedlim-QD løsning.
    1. Syntetisere Cagedlim-dibenzocylooctyne (Cagedlim-DBCO) (figur 1) følge prosedyrene tidligere beskrevet20.
    2. Forberede en lagerløsning av Cagedlim-DBCO (10 mM) i tørr DMSO.
    3. For utarbeidelse av Cagedlim-QD, først forberede azide-functionalized QDs (Azide-QD; Figur 3). Legge til 100 µL av en dimethyl formamide (DMF, 125 µM) løsning av azide-PEG4-NHS ester (Figur 3) 400 µL av en DMF (500 nM) løsning av kvante prikker (QDs) belagt med Amin-functionalized pinne (Amin-QD; Figur 3). Rør blandingen 1t ved romtemperatur.
    4. Dialyze den resulterende løsningen for 24 h mot 800 mL DMF en Spartments cellulose membran med 3500 molekylvekt cut-off (MWCO).
    5. Fortynne lager løsning av Cagedlim-DBCO til 50 µM med DMF. Legg 200 µL av løsningen etter dialyse løsningen (Figur 3) og rør blandingen for 3t ved romtemperatur.
    6. Dialyze den resulterende løsningen for 24 h mot 800 mL DMF bruker en Spartments cellulose membran (25.000 MWCO).
    7. Fortynne den resulterende løsningen til 200 nM med DMF.

Figure 3
Figur 3: skjematisk illustrasjon av utarbeidelse av Cagedlim-QD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. forberedelse av Hep3B celle prøve til mikroskopiske observasjoner

  1. Opprettholde menneskelige hepatocellulært karsinom Hep3B celler i Eagle's minimal viktig medium (EMEM) som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS) på 37 ° C under 5% CO2.
  2. Frø cellene dagen før eksperimentet. Frø 5.0 × 103 Hep3B celler per brønn av en 8-chambered barometer substrate i EMEM (10% FBS, 200 µL), og Inkuber celle prøven på 37 ° C under 5% CO2 24 h.
  3. Fjerne kultur medium og skyll celle prøven med 100 µL Dulbeccos fosfat buffer saltoppløsning (D-PBS) to ganger.

3. observasjon av kjernefysiske translokasjon av små-molekylet gjester utløst av UV-lys

  1. Angi cellen prøven (forberedt i trinn 2.3) med 200 µL av FBS-fri EMEM som inneholder Cagedlim-NBD (10 µM) og Inkuber resulterende celle prøven på 37 ° C under 5% CO2 3 h.
    Merk: Inkubasjonstiden for cellen eksemplet i FBS-fri EMEM lenger enn 4 h forårsaker alvorlig celleskader.
  2. Fjerne kultur medium og skyll celle prøven med 100 µL av D-PBS to ganger.
  3. For visualisering av endosomes, angi cellen prøven med 200 µL av EMEM (10% FBS) som inneholder en rød-fluorescerende farge (f.eksLysoTracker røde, 100 nM), og Inkuber resulterende celle prøven på 37 ° C under 5% CO2 i 20 min. fjerne kultur medium, og skyll celle prøven med 100 µL av D-PBS to ganger. Angi cellen prøven med 200 µL av EMEM (10% FBS).
  4. For kjernefysisk translokasjon av Cagedlim-NBD, utsette celle prøven for UV-lys for 2 min via en optisk fiber med en 100-W xenon lyskilde utstyrt med en 365 nm Båndpassdesign filter. For en referanse celle prøve uten UV eksponering, holde celle prøven i mørket.
    Merk: Lokket av glass substrater kan tas for effektiv UV-stråling. Lang tids eksponering for UV lys kan forårsake cytotoksisitet til cellene.
  5. For visualisering av kjerner, legger 1 µL av Hoechst 33342 (1 mg/mL) kultur medium og ruge resulterende celle prøven på 37 ° C under 5% CO2 i 10 min.
  6. Underlagt celle prøven AC confocal mikroskopi for laserskanning og registrere micrographs på eksitasjon på 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm), og 710 nm (to-fotonet; Λ Obs = 390-465 nm) for NBD, rød-fluorescerende fargestoff og Hoechst 33342, henholdsvis.

4. observasjon av kjernefysiske translokasjon av små-molekylet gjester utløst av to-fotonet NIR lys

  1. Angi cellen prøven (forberedt i trinn 2.3) med 200 µL av FBS-fri EMEM som inneholder Cagedlim-NBD (10 µM) og Inkuber resulterende celle prøven på 37 ° C under 5% CO2 3 h.
  2. Fjerne kultur medium og skyll celle prøven med 100 µL av D-PBS to ganger. Angi cellen prøven med 200 µL av EMEM (10% FBS).
  3. Underlagt celle prøven AC confocal mikroskopi for laserskanning og registrere micrographs på eksitasjon på 488 nm (λobs = 500-530 nm).
  4. For kjernefysisk translokasjon av Cagedlim-NBD, irradiate regionen inkludert cellen rundt med en to-fotonet eksitasjon laser (710 nm), installert som en lyskilde i mikroskop, i 2 minutter (30 s × 4). Observere translokasjon som beskrevet i trinn 4.3.

5. observasjon av kjernefysiske translokasjon av Macromolecular gjester utløst av UV-lys

  1. Angi cellen prøven (forberedt i trinn 2.3) med 200 µL av FBS-fri EMEM som inneholder Cagedlim-QD (10 nM), og Inkuber resulterende celle prøven på 37 ° C under 5% CO2 3 h.
  2. Fjerne kultur medium og skyll celle prøven med 100 µL av D-PBS to ganger. Angi cellen prøven med 200 µL av EMEM (10% FBS).
  3. For kjernefysisk translokasjon av Cagedlim-QD, utsette celle prøven for UV-lys for 2 min via en optisk fiber med en 100-W xenon lyskilde utstyrt med en 365 nm Båndpassdesign filter. For en referanse celle prøve uten UV eksponering, holde celle prøven i mørket.
  4. For visualisering av kjerner, legger 1 µL av Hoechst 33342 (1 mg/mL) kultur medium og ruge resulterende celle prøven på 37 ° C under 5% CO2 i 10 min.
  5. Underlagt celle prøven AC confocal mikroskopi for laserskanning og registrere micrographs på eksitasjon ved 405 nm (λobs = 430-520 nm) og 488 nm (λobs = 625-680 nm) for Hoechst 33342 og QDs, henholdsvis.

6. celle levedyktighet analysen

  1. Opprettholde menneskelige hepatocellulært karsinom Hep3B celler i EMEM (10% FBS) på 37 ° C under 5% CO2.
  2. Frø cellene dagen før eksperimentet. Frø 5.0 × 103 Hep3B celler per brønn av en 96-brønnen plate i EMEM (10% FBS, 200 µL), og Inkuber celle prøven på 37 ° C under 5% CO2 24 h.
  3. Fjerne kultur medium og skyll celle prøven med 100 µL av D-PBS to ganger.
  4. Angi cellen prøven med 200 µL av FBS-fri EMEM som inneholder Cagedlim-NBD (0,1-100 µM) og Inkuber resulterende celle prøven på 37 ° C under 5% CO2 3 h.
  5. Utsett celle prøve å UV lys for 2 min via en optisk fiber med en 100-W xenon lyskilde utstyrt med en 365 nm Båndpassdesign filter. For en tilsvarende celle utvalg uten UV eksponering, holde celle prøven i mørket.
  6. Legg til 10 µL av cellen teller Kit-8 reagensen (10 µL) kultur medium og ruge resulterende celle prøven på 37 ° C under 5% CO2 2 h.
  7. Underlagt celle prøven absorpsjon spektroskopi (λ = 450 nm) bruker en microplate reader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før photoirradiation, Hep3B celler inkubert med Cagedlim-NBD utstilt vises punctate fluorescens utslipp fra sitt interiør (λext = 488 nm; Tallene 4A og 4 C, grønn). En tilsvarende mikroskop-bilde ble innhentet på eksitasjon på 543 nm for rød-fluorescerende farge (tall 4B og 4 C, rød), som indikerer at Cagedlim-NBD lokalisert i endosomes. Følgelig fluorescens utslipp tilordnes Cagedlim-NBD (Figur 4 d, grønn) ble observert utenfor cellekjernen, som var visualisert med Hoechst 33342 (λext = 710 nm, to-fotonet; Figur 4 d, blå). Etter UV bestråling tyder celler slippes ut fluorescens på grunn av NBD (figur 4E, grønn) også fra kjernen (figur 4E, blå), på at Cagedlim-NBD var uncaged til å gi Uncagedlim-NBD, som overføres til cytoplasm etterfulgt av cellekjernen. Slike kjernefysiske translokasjon av Cagedlim-NBD kan indusert området-selektivt ved to-fotonet NIR lys (figur 5A og film 1, hvite stiplede sirkelen). Som vist i figur 5B og film 1, Cagedlim-NBD i nonirradiated områder flykte ikke fra endosomes og forble som vises punctate fluorescens. Ingen merkbar cytotoksisitet ble observert for cellene behandlet med Cagedlim-NBD før og selv etter UV eksponering (figur 6).

Cagedlim-R kodene kan også levere macromolecular Gjester som QDs til cellekjernen. QD /Cagedlim-R konjugert (Cagedlim-QD, Figur 3) kan tas opp i Hep3B celler (figur 7A). Visualisering av cellekjernen med Hoechst 33342 angir at Cagedlim-QD forblir utenfor kjernen før photoirradiation (figur 7A). Etter UV eksponering i 2 minutter kom fluorescens utslipp av QDs i kjernen (tall 7B og 7 C). Et tverrsnitt bilde av cellene vist at fluorescens utslipp tilordnes QDs faktisk slippes ut fra inne i kjernen (figur 7 d).

Figure 4
Figur 4: Endosomal rømme og kjernefysiske translokasjon av Cagedlim-NBD utløst av UV-lyset. AC confocal laserskanning micrographs Hep3B celler etter 3-h inkubasjon på 37 ° C i EMEM som inneholder Cagedlim-NBD (10 µM) fulgt av skylling med D-PBS. (A, B) Micrographs ble registrert på eksitasjon på (A) 488 nm (λobs = 500-530 nm, grønn) og (B) 543 nm (λobs = 565-620 nm, rød) etter 20 min inkubasjon i EMEM (10% FBS) som inneholder røde-fluorescerende farge (100 nM) . (C) sammenslått bilde av (A) og (B). (D, E) Micrographs spilte på eksitasjon på 488 nm (λobs = 500-530 nm, grønn) og 710 nm (to-fotonet; Λ Obs = 390-465 nm, blå). Hep3B cellene, behandlet med Cagedlim-NBD, ble inkubert på 37 ° C i EMEM (10% FBS) som inneholder Hoechst 33342 (5 µg/mL) før (D) og etter (E) 2-min UV-stråling på 365 nm. Skalere barer = 20 µm. Reprinted med tillatelse fra referanse20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Kjernefysiske translokasjon av Cagedlim-NBD utløst av to-fotonet NIR lys. AC confocal laserskanning micrographs Hep3B celler etter 3-h inkubasjon på 37 ° C i EMEM som inneholder Cagedlim-NBD (10 µM) fulgt av skylling med D-PBS. Micrographs ble registrert på eksitasjon på 488 nm (λobs = 500-530 nm) før (A) og etter (B) to-fotonet irradiation 710 nm i 2 minutter (30 s × 4). Den hvite stiplede sirkelen i (A) representerer bestrålt området. Skalere barer = 20 µm. Reprinted med tillatelse fra referanse20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: cellen levedyktighet analysen. Viabilities av Hep3B celler etter inkubasjon i EMEM som inneholder Cagedlim-NBD (0,1-100 µM) før (A) og etter (B) 2-min UV-stråling på 365 nm. Gjengitt med tillatelse fra referanse20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Kjernefysiske translokasjon av Cagedlim-QD utløst av UV-lyset. AC confocal laserskanning micrographs Hep3B celler på eksitasjon ved 405 nm (λobs = 430-520 nm) og 488 nm (λobs = 625-680 nm). Hep3B celler ble inkubert på 37 ° C 3 h i EMEM som inneholder Cagedlim-QD (10 nM), skylles med D-PBS og deretter ruges ved 37 ° C i 10 minutter i EMEM (10% FBS) som inneholder Hoechst 33342 (5 µg/mL) før (A) og etter (B, C) 2-min eksponering for UV lys i 365 nm. (D) tverrsnitt bilde langs den gule streken c. Skalere barer = 20 µm. Reprinted med tillatelse fra referanse20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie
Film 1. Kjernefysisk translokasjon av CagedLim-NBD utløst av to-fotonet NIR lys. Time-lapse AC confocal laserskanning mikroskopi Hep3B celler etter 3-h inkubasjon på 37 ° C i EMEM som inneholder Cagedlim-NBD (10 µM) fulgt av skylling med D-PBS. Micrographs ble registrert med 3-s mellomrom på eksitasjon på 488 nm (λobs = 500-530 nm). Cellene i den hvite stiplede sirkelen var irradiated med to-fotonet NIR lys i 710 nm i 2 minutter (30 s × 4). Gjengitt med tillatelse fra referanse20. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere undersøkelser av lys-utløst translokasjon av proteiner til cellekjernen har oppnådd bruker bur NLS7,8,9. Som nevnt tidligere, krever metodene flere teknikker for å innlemme NLS-merket proteiner i cytoplasma. I kontrast, kan vår Cagedlim-R koden ikke bare Foto-indusert kjernefysiske translokasjon, men også mobilnettet opptak av gjestene. Denne funksjonen av Cagedlim-R koden er fordelaktig for i vivo programmer.

Cagedlim-R koden kan levere macromolecular Gjester som QDs til cellekjernen. QDs ansatt her er større i diameter (DH = 15-20 nm) enn kjernefysiske porene (~ 5 nm)24, antyder muligheten til å levere andre makromolekyler som ikke passivt spre inn i kjernen. Protokoller for functionalization av biomacromolecular overflater med azide grupper er godt etablert25; i tillegg koder syntese Cagedlim-R koder med andre funksjonelle grupper som maleimides, N- hydroxysuccinimide (NHS) estere og så videre som en forankring enhet vil utvide anvendelsesområdene av Cagedlim-R til ulike biomacromolecules.

Unødvendig å si, er det kritiske trinnet av denne metoden inkorporering av gjestene merket med Cagedlim-R via endocytose. Effektiviteten av mobilnettet opptaket av merket gjestene avhenger av deres konsentrasjon og inkubasjon tid. Hvis gjestene av interesse, når merket med Cagedlim-R, er endocytosed ineffektivt, ruge cellene lenger med høyere konsentrasjon av merket gjestene. Et mulig alternativ er å øke antall Cagedlim-R innlemmet i gjesten.

Gjestene i denne protokollen er covalently likt til Cagedlim-R koden. Dette er en potensiell ulempe spesielt for levering av små-molekylet ligander, siden deres binding til målet biomolecules kan bli hemmet av den store dendrittiske tag. Innlemmelse av en stimuli-responsive koblingsfunksjonalitet26 mellom Cagedlim-R koden og gjest molekylet kan utgivelsen av gjestene etter kjernefysiske translokasjon.

I sammendraget viste vi lys-utløst kjernefysiske translokasjon av gjester ved hjelp av photoactivatable bur molekylær lim (Cagedlim-R) koder. Gjestene merket med Cagedlim-R er tatt opp til levende celler via endocytose og forblir i endosomes. På photoirradiation konverteres Cagedlim-R til Uncagedlim-R, som forenkler endosomal rømme og påfølgende kjernefysiske translokasjon av gjestene. Ytterligere mangeårige observasjoner kan være viktig å undersøke skjebnen til gjestene forblir i endosomes, samt de leveres til cellekjernen. Spatiotemporally kontrollert genuttrykk bruker Cagedlim-R koder er et interessant emne verdig videre etterforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi erkjenner sentrum for NanoBio integrasjon, Universitetet i Tokyo. Dette arbeidet ble støttet av Grant-in-Aid for unge forskere (B) (26810046) til K.O. og støttes delvis av Grant-in-Aid for spesielt forfremmet forskning (25000005) å T.T. RM Takk Research stipend i Japan Society for fremme av vitenskap (Javaserver ) for unge forskere og programmet for ledende utdannet skoler (GPLLI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
  13. Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Tags

Kjemi problemet 143 molekylær lim photoactivation cellekjernen endosomal rømme kjernefysiske translokasjon to-fotonet eksitasjon kvante prikker
Spatiotemporally kontrollert kjernefysiske translokasjon av gjester i levende celler med bur molekylær lim som Photoactivatable Tags
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A.,… More

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter