Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Spatiotemporally kontrollerade translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med bur molekylär lim som Photoactivatable Taggar

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58631
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Det här protokollet beskriver ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med bur molekylär lim-taggar. Denna metod är lovande för webbplats-selektiva kärnvapen-targeting drogen leverans.

Abstract

Cellkärnan är en av de viktigaste organeller som subcellulär drog-leverans mål, sedan modulering av genen replikering och uttryck är effektiv för behandling av olika sjukdomar. Här visar vi ljus-utlöst translokationen i cellkärnan i gäster som använder bur molekylär lim (Cagedlim-R) Taggar, vars flera guanidinium ion (Gu+) hängen skyddas av en anjoniska photocleavable grupp (butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gäster med Cagedlim-R etiketten tas i levande celler via endocytos och förbli i endosomes. Dock är Cagedlim-R vid photoirradiation omvandlas uncaged molekylär lim (Uncagedlim-R) bär flera Gu+ hängen, som underlättar endosomal fly och efterföljande translokationen i cellkärnan av gästerna. Denna metod är lovande för webbplats-selektiva kärnvapen-targeting drogen leverans, eftersom de taggade gästerna kan migrera in i cytoplasman följt av cellkärnan endast när photoirradiated. Caged Lim-R taggar kan leverera makromolekylära gäster såsom kvantprickar (QDs) samt småmolekylär gäster. Caged Lim-R taggar kan vara uncaged med UV-ljus men också två-photon nära infrarött (NIR) ljus, som kan tränga djupt in i vävnaden.

Introduction

Cellkärnan, som bär den genetiska informationen, är en av de viktigaste organeller som subcellulär drog-leverans mål, sedan modulering av genen replikering och uttryck är effektiv för behandling av olika sjukdomar inklusive cancer och genetiska sjukdomar i1,2,3. För nukleära leverans av läkemedel, Konjugation av peptid taggar såsom cellkärnelokalisering signaler (NLS)4,5,6 allmänt har undersökts. För att minska oönskade bieffekter, krävs dock spatiotemporal kontroll av translokationen i cellkärnan.

Tidigare, ljus-utlöst flyttning av proteiner i cellkärnan har uppnåtts med bur NLS7,8,9. NLS migrerar in i cellkärnan genom bindning till cytoplasmiska transport proteiner6. I de rapportera metoderna, är gäst proteiner med bur NLS direkt införlivas i cytoplasman av Mikroskop8 eller uttryckt i målcellerna använder en genetisk kod expansion teknik9. En metod som kan uppnå både cellernas upptag och foto-inducerad translokationen i cellkärnan är därför fördelaktigt för praktiska tillämpningar.

Häri, beskriver vi ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med hjälp av dendritiska bur molekylär lim (Cagedlim-R, figur 1) Taggar. Vattenlösliga molekylär lim10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 med flera Gu+ hängen har tidigare utvecklats, som tätt följa proteiner11,12,13,14,15, 16,17, nukleinsyror18,19,20, fosfolipid membran21och lera nu22,23 genom den bildandet av flera salt broar mellan deras Gu+ hängen och oxyanionic grupper på mål. Gu+ Hängen av Cagedlim-R skyddas av en anjoniska photocleavable grupp, butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gäster med Cagedlim-R etiketten tas i levande celler via endocytos och vistelse i endosomes (figur 2). Vid photoirradiation, är BANVOC grupperna av Cagedlim-R fristående för att ge en uncaged molekylär lim (Uncagedlim-R) bär flera Gu+ hängen, vilket då underlättar migreringen av märkta gästen i cytoplasman följt av cellkärnan (figur 2). Taggen Cagedlim-R kan vara uncaged av exponering för UV- eller två-photon nära infrarött (NIR) ljus utan allvarliga fototoxicitet. Vi visar den spatiotemporally kontrollerade kärn leveransen av makromolekylära gäster samt småmolekylär gäster med Cagedlim-R taggar, som använder kvantprickar (QDs) och ett fluorescerande färgämne (nitrobenzoxadiazole; NBD), respektive, som exempel.

Figure 1
Figur 1: Schematisk strukturer av Cagedlim-R. 9 guanidinium ion (Gu+) Hängen av Cagedlim-R skyddas av en butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) grupp. BANVOC grupperna klyvs av bestrålning med UV- eller två-photon NIR ljus. Focal kärnan i Cagedlim-R är functionalized med antingen nitrobenzoxadiazole (NBD) eller dibenzocylooctyne (DBCO). Omtryckt med tillåtelse från referens20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk illustration av ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster konjugerat med ett Cagedlim-R tag. Gästen /Cagedlim-R konjugat tas i levande celler via endocytos. Vid photoirradiation är Cagedlim-R taggen uncaged ge en Uncagedlim-R tagg, som kan underlätta endosomal flykten av märkta gästen. Därefter migrerar märkta gästen in i cellkärnan. Omtryckt med tillåtelse från referens20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av gäster med burlim-R Taggar

  1. Förbereda Cagedlim-NBD lösning.
    1. Syntetisera Cagedlim-NBD (figur 1) efter de tidigare beskrivna förfaranden-20.
    2. Förbereda en stamlösning av Cagedlim-NBD (10 mM) i torr dimetyl sulfoxid (DMSO).
      Obs: Förvara stamlösning i mörkret. Lösningen kan spädas med aqueous buffertar eller cell kulturmassmedia vid användning.
  2. Bered Cagedlim-QD.
    1. Syntetisera Cagedlim-dibenzocylooctyne (Cagedlim-DBCO) (figur 1) följa förfaranden som tidigare beskrivs20.
    2. Förbereda en stamlösning av Cagedlim-DBCO (10 mM) i torr DMSO.
    3. För beredning av Cagedlim-QD, först förbereda natriumazid-functionalized QDs (natriumazid-QD; (Se figur 3). Tillsätt 100 µL av en dimethyl formamid (DMF, 125 µM) lösning av natriumazid-PEG4-NHS ester (figur 3) till 400 µL av en DMF (500 nM) lösning av kvantprickar (QDs) belagd med amine-functionalized PEG (Amine-QD; (Se figur 3). Rör blandningen för 1 h i rumstemperatur.
    4. Dialyze den resulterande lösningen för 24 h mot 800 mL DMF med en regenererad cellulosa membran med 3.500 molekylvikt cut-off (MWCO).
    5. Späd stamlösningen av Cagedlim-DBCO till 50 µM med DMF. Tillsätt 200 µL av lösningen till efter dialys lösningen (figur 3) och rör blandningen för 3 h i rumstemperatur.
    6. Dialyze den resulterande lösningen för 24 h mot 800 mL DMF använder en regenererad cellulosa membran (25.000 MWCO).
    7. Späd den resulterande lösningen till 200 nM med DMF.

Figure 3
Figur 3: Schematisk illustration av utarbetandet av Cagedlim-QD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. förberedelse av Hep3B Cell provet för mikroskopiska observationer

  1. Upprätthålla mänskliga hepatocellulära carcinom Hep3B celler i örnens minimal viktigt medium (EMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C under 5% CO2.
  2. Utsäde cellerna dagen innan experimentet. Utsäde 5,0 × 103 Hep3B celler per väl av en 8-kamrar glassubstrat i EMEM (10% FBS, 200 µL), och inkubera cell provet vid 37 ° C under 5% CO2 för 24 h.
  3. Ta bort odlingsmediet och skölj cell provet med 100 µL av Dulbeccos fosfat buffert saltlösning (D-PBS) två gånger.

3. observation av translokationen i cellkärnan småmolekylär gäster utlöses av UV-ljus

  1. Leverera cell provet (beredd i steg 2,3) med 200 µL av FBS-fri EMEM som innehåller Cagedlim-NBD (10 µM) och inkubera resulterande cell provet vid 37 ° C under 5% CO2 för 3 h.
    Obs: Inkubation av cell provet i FBS-fri EMEM längre än 4 h orsakar allvarliga cellskador.
  2. Ta bort odlingsmediet och skölj cell provet med 100 µL av D-PBS två gånger.
  3. För visualisering av endosomes, leverera cell provet med 200 µL EMEM (10% FBS) som innehåller ett rött fluorescerande färgämne (t.ex., LysoTracker röd, 100 nM), och inkubera resulterande cell provet vid 37 ° C under 5% CO2 för 20 min. ta bort kulturen medium och skölj cell provet med 100 µL av D-PBS två gånger. Leverera cell provet med 200 µL EMEM (10% FBS).
  4. För translokationen i cellkärnan av Cagedlim-NBD, exponera cell provet med UV-ljus för 2 min via en optisk fiber med hjälp av en 100-W xenon ljuskälla utrustad med ett 365 nm bandpassfilter. För ett cell referensprov utan UV-exponering, hålla cell provet i mörkret.
    Obs: Locket på i glas substrat kan tas bort för effektiv UV-exponering. Långvarig exponering för UV-ljus kan orsaka cytotoxicitet till cellerna.
  5. För visualisering av atomkärnor, tillsätt 1 µL av Hoechst 33342 (1 mg/mL) till odlingsmediet och inkubera resulterande cell provet vid 37 ° C under 5% CO2 för 10 min.
  6. Underkastade cell provet confocal microscopy för laserscanning och spela in micrographs vid magnetiseringen på 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm), och 710 nm (två-photon; Λ Obs = 390-465 nm) för NBD, röd fluorescerande färgämne och Hoechst 33342, respektive.

4. observation av translokationen i cellkärnan småmolekylär gäster utlöses av två-photon NIR ljus

  1. Leverera cell provet (beredd i steg 2,3) med 200 µL av FBS-fri EMEM som innehåller Cagedlim-NBD (10 µM) och inkubera resulterande cell provet vid 37 ° C under 5% CO2 för 3 h.
  2. Ta bort odlingsmediet och skölj cell provet med 100 µL av D-PBS två gånger. Leverera cell provet med 200 µL EMEM (10% FBS).
  3. Underkastade cell provet confocal microscopy för laserscanning och spela in micrographs vid magnetiseringen på 488 nm (λobs = 500-530 nm).
  4. För translokationen i cellkärnan av Cagedlim-NBD, bestråla regionen inklusive cellen av intresse med en två-photon excitation laser (710 nm), installeras som en ljuskälla i mikroskopet, i 2 min (30 s × 4). Observera translokationen som beskrivs i steg 4,3.

5. observation av translokationen i cellkärnan av makromolekylära gäster utlöses av UV-ljus

  1. Leverera cell provet (beredd i steg 2,3) med 200 µL av FBS-fri EMEM som innehåller Cagedlim-QD (10 nM), och inkubera resulterande cell provet vid 37 ° C under 5% CO2 för 3 h.
  2. Ta bort odlingsmediet och skölj cell provet med 100 µL av D-PBS två gånger. Leverera cell provet med 200 µL EMEM (10% FBS).
  3. För translokationen i cellkärnan av Cagedlim-QD, exponera cell provet med UV-ljus för 2 min via en optisk fiber med hjälp av en 100-W xenon ljuskälla utrustad med ett 365 nm bandpassfilter. För ett cell referensprov utan UV-exponering, hålla cell provet i mörkret.
  4. För visualisering av atomkärnor, tillsätt 1 µL av Hoechst 33342 (1 mg/mL) till odlingsmediet och inkubera resulterande cell provet vid 37 ° C under 5% CO2 för 10 min.
  5. Underkastade cell provet confocal microscopy för laserscanning och spela in micrographs vid excitation vid 405 nm (λobs = 430-520 nm) och 488 nm (λobs = 625-680 nm) för Hoechst 33342 och QDs, respektive.

6. cell livskraft Assay

  1. Upprätthålla mänskliga hepatocellulära carcinom Hep3B celler i EMEM (10% FBS) vid 37 ° C under 5% CO2.
  2. Utsäde cellerna dagen innan experimentet. Utsäde 5,0 × 103 Hep3B celler per väl av en platta med 96 brunnar kultur i EMEM (10% FBS, 200 µL), och inkubera cell provet vid 37 ° C under 5% CO2 för 24 h.
  3. Ta bort odlingsmediet och skölj cell provet med 100 µL av D-PBS två gånger.
  4. Leverera cell provet med 200 µL av FBS-fri EMEM som innehåller Cagedlim-NBD (0,1-100 µM) och inkubera resulterande cell provet vid 37 ° C under 5% CO2 för 3 h.
  5. Exponera cell provet med UV-ljus för 2 min via en optisk fiber med hjälp av en 100-W xenon ljuskälla utrustad med ett 365 nm bandpassfilter. För en motsvarande cell prov utan UV-exponering, hålla cell provet i mörkret.
  6. Tillsätt 10 µL av Cell räknar Kit-8 reagens (10 µL) till odlingsmediet och inkubera resulterande cell provet vid 37 ° C under 5% CO2 för 2 h.
  7. Omfattas av cell provet absorption spektroskopi (λ = 450 nm) med en microplate reader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Innan photoirradiation, uppvisade Hep3B cellerna inkuberas med Cagedlim-NBD punktuell fluorescens utsläpp från sin inre (λext = 488 nm. Figurerna 4A och 4 C, grön). En liknande Mikrograf erhölls vid magnetiseringen på 543 nm för röd fluorescerande färgämne (figurerna 4B och 4 C, röd), som anger att Cagedlim-NBD lokaliserade i endosomes. Följaktligen fluorescens utsläpp assignable till Cagedlim-NBD (figur 4 d, grön) observerades utanför cellkärnan, som var visualiserat med Hoechst 33342 (λext = 710 nm, två-photon; Figur 4 d, blå). Efter UV-strålning, celler som avges fluorescens på grund av NBD (figur 4E, grön) också från kärnan (figur 4E, blå), vilket tyder på att Cagedlim-NBD var uncaged direktavkastning Uncagedlim-NBD, som migreras in i cytoplasman följt av cellkärnan. Sådan translokationen i cellkärnan av Cagedlim-NBD kan induceras webbplats-selektivt av två-photon NIR ljus (figur 5A och film 1, vit streckad cirkel). Som visas i figur 5B och film 1, Cagedlim-NBD i försök områden undgick inte från endosomes och återstod som punktuell fluorescens. Ingen märkbar cytotoxicitet observerades för cellerna behandlas med Cagedlim-NBD innan och även efter den UV-exponeringen (figur 6).

Cagedlim-R taggar kan också leverera makromolekylära gäster såsom QDs in i cellkärnan. QD /Cagedlim-R konjugat (Cagedlim-QD, figur 3) kan tas upp i Hep3B celler (figur 7A). Visualisering av cellkärnan med Hoechst 33342 indikerar att Cagedlim-QD förblir utanför kärnan innan photoirradiation (figur 7A). Efter UV-exponering i 2 min framkom fluorescens utsläpp av QDs i kärnan (siffror 7B och 7 C). En tvärsnitts bild av cellerna visat att fluorescens utsläpp assignable till QDs faktiskt släpps från inuti kärnan (figur 7 d).

Figure 4
Figur 4: Endosomal fly och translokationen i cellkärnan av Cagedlim-NBD utlöses av UV-ljus. Confocal laserscanning micrographs Hep3B celler efter 3 h inkubation vid 37 ° C i EMEM som innehåller Cagedlim-NBD (10 µM) följt av sköljning med D-PBS. (A, B) Micrographs registrerades vid excitation vid (A) 488 nm (λobs = 500-530 nm, grön) och (B) 543 nm (λobs = 565-620 nm, röd) efter 20 min inkubation i EMEM (10% FBS) som innehåller röd fluorescerande färgämne (100 nM) . (C) sammanfogad bild av (A) och (B). (D, E) Micrographs registreras vid magnetiseringen på 488 nm (λobs = 500-530 nm, grön) och 710 nm (två-photon; Λ Obs = 390-465 nm, blå). Hep3B cellerna, behandlas med Cagedlim-NBD, var inkuberas vid 37 ° C i EMEM (10% FBS) som innehåller Hoechst 33342 (5 µg/mL) före (D) och efter (E) 2-min UV-exponering på 365 nm. Skala barer = 20 µm. Reprinted med tillstånd från referens20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Translokationen i cellkärnan av Cagedlim-NBD utlöses av två-photon NIR ljus. Confocal laserscanning micrographs Hep3B celler efter 3 h inkubation vid 37 ° C i EMEM som innehåller Cagedlim-NBD (10 µM) följt av sköljning med D-PBS. Micrographs registrerades vid magnetiseringen på 488 nm (λobs = 500-530 nm) före (A) och efter (B) två-photon bestrålning på 710 nm i 2 min (30 s × 4). Den vit streckad cirkeln ( a) representerar det bestrålade området. Skala barer = 20 µm. Reprinted med tillstånd från referens20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Cell livskraft assay. Förmåga av Hep3B celler efter inkubation i EMEM som innehåller Cagedlim-NBD (0,1-100 µM) före (A) och efter (B) 2-min UV-exponering på 365 nm. Omtryckt med tillåtelse från referens20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Translokationen i cellkärnan av Cagedlim-QD utlöses av UV-ljus. Confocal laserscanning micrographs Hep3B celler vid excitation vid 405 nm (λobs = 430-520 nm) och 488 nm (λobs = 625-680 nm). Hep3B celler var inkuberas vid 37 ° C för 3 h i EMEM som innehåller Cagedlim-QD (10 nM), sköljas med D-PBS och sedan inkuberas vid 37 ° C i 10 min i EMEM (10% FBS) som innehåller Hoechst 33342 (5 µg/mL) före (A) och efter (B, C) 2-min UV-exponering ljus på 365 nm. (D) tvärsnitts bilden längs den gula linjen i (C). Skala barer = 20 µm. Reprinted med tillstånd från referens20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Movie
Film 1. Translokationen i cellkärnan av Cagedlim-NBD utlöses av två-photon NIR ljus. Time-lapse confocal laserscanning mikroskopi av Hep3B celler efter 3 h inkubation vid 37 ° C i EMEM som innehåller Cagedlim-NBD (10 µM) följt av sköljning med D-PBS. Micrographs spelades in med 3-s intervall vid magnetiseringen på 488 nm (λobs = 500-530 nm). Cellerna ligger i vit streckad cirkel bestrålades med två-photon NIR ljus på 710 nm i 2 min (30 s × 4). Omtryckt med tillåtelse från referens20. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidigare undersökningar av ljus-utlöst flyttning av proteiner i cellkärnan har uppnåtts med bur NLS7,8,9. Som tidigare nämnts, kräver dessa metoder ytterligare tekniker för att införliva de NLS-märkta proteinerna i cytoplasman. Däremot kan vår Cagedlim-R tag inte bara foto-inducerad translokationen i cellkärnan, utan även cellernas upptag av gästerna. Funktionen av taggen Cagedlim-R är fördelaktiga för i vivo applikationer.

Cagedlim-R etiketten kan leverera makromolekylära gäster såsom QDs in i cellkärnan. De QDs anställd här är större i diameter (DH = 15-20 nm) än kärnkraft porerna (~ 5 nm)24, vilket tyder på möjligheten att leverera andra makromolekyler som inte passivt diffunderar in i cellkärnan. Protokoll för funktionalisering av biomolekylära ytor med natriumazid grupper är väl etablerad25; Dessutom Taggar syntes av Cagedlim-R Taggar försedda andra funktionella grupper som maleimides, N- hydroxysuccinimide (NHS) estrar och så vidare som en förankring enhet kommer att bredda tillämpligheten av Cagedlim-R till olika biomakromolekyler.

Onödigt att säga, är den kritiska steget av denna metod införlivandet av gästerna med Cagedlim-R via endocytos etiketten. Effektiviteten i det cellernas upptaget av de märkta gästerna beror på deras koncentration och inkubationstiden. Om gäster av intresse, när etiketten med Cagedlim-R, endocytosed ineffektivt, inkubera cellerna längre med högre koncentration av de märkta gästerna. Ett möjligt alternativ är att öka antalet Cagedlim-R införlivas med gästen.

De gäster som används i detta protokoll är kovalent konjugerad till taggen Cagedlim-R. Detta är en möjlig nackdel särskilt för leverans av småmolekylär ligander, eftersom deras bindning till det målet biomolekyler kan hämmas av skrymmande dendritiska etiketten. Införlivandet av en stimuli-lyhörd linker26 mellan taggen Cagedlim-R och gäst molekyl kan tillåta release av gästerna efter translokationen i cellkärnan.

Sammanfattningsvis visade vi ljus-utlöst translokationen i cellkärnan i gäster som använder photoactivatable bur molekylär lim (Cagedlim-R) Taggar. Gäster med Cagedlim-R etiketten tas i levande celler via endocytos och förbli i endosomes. Vid photoirradiation konverteras Cagedlim-R till Uncagedlim-R, som underlättar endosomal fly och efterföljande translokationen i cellkärnan av gästerna. Ytterligare lång tid observationer kan vara viktigt att undersöka ödet för de gäster som finns kvar i endosomes as well as de levereras in i cellkärnan. Spatiotemporally styrda genuttryck som använder Cagedlim-R taggar är ett intressant ämne värdig av vidare utredning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi erkänner centrum för NanoBio Integration, University of Tokyo. Detta arbete var stöds av bidrag för unga forskare (B) (26810046) att K.O. och delvis stöds av bidrag för speciellt främjat forskning (25000005) att T.A. R.M. tack Forskning Stipendier Japan samhällets för främjande av vetenskap (JSPS ) för unga forskare och Program för ledande forskarskolor (GPLLI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
  13. Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Tags

Kemi fråga 143 molekylär lim ljusaktivering cellkärnan endosomal fly translokationen i cellkärnan två-photon excitation kvantprickar
Spatiotemporally kontrollerade translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med bur molekylär lim som Photoactivatable Taggar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A.,… More

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter