Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Spatiotemporally Photoactivatable etiketleri kafesli moleküler tutkallar kullanılarak canlı hücreler Konuk nükleer Translocation kontrollü

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58631
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Bu iletişim kuralı ışık tetiklemeli nükleer translocation kafesli moleküler tutkal Etiketler kullanarak canlı hücreler Konuk açıklar. Bu yöntem site seçici hedefleme nükleer ilaç dağıtım için umut verici.

Abstract

Hücre çekirdeği en önemli organellerin hücre altı ilaç dağıtım hedefi farklı gen çoğaltma modülasyon beri biridir ve ifade çeşitli hastalıkların tedavisinde etkilidir. Burada, biz ışık tetiklemeli nükleer translocation kullanarak Konuk moleküler tutkal (kafeslitutkal-R) Etiketler olan birden çok guanidinium iyon (Gu+) kolyeler anyonik photocleavable grupla (bütrat yerine korunur, Kafesli göstermek nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Kafeslitutkal-R ile öğesini konuklar kapladığı yaşam içine endositoz ile hücre ve endosomes içinde kalır. Ancak, photoirradiation, kafeslitutkal-R endosomal kaçış ve konukların sonraki nükleer translocation kolaylaştırır birden çok Gu+ kolye, taşıyan kokulum moleküler tutkal (Uncagedtutkal-R) dönüştürülür. Tagged konuklar hücre çekirdeği tarafından takip sitoplazma içine geçirebilirsiniz bu yana bu yöntem site seçici hedefleme nükleer ilaç dağıtım için umut verici sadece photoirradiated. Kafesli Tutkal-R Etiketler kuantum nokta (QDs) gibi makromoleküllerin Konuklar küçük molekül konuklar yanı sıra teslim edebilirsiniz. Kafesli Tutkal-R Etiketler sadece UV ışık aynı zamanda derin doku nüfuz edebilir iki fotonlu yakın kızılötesi (Nur) ışık ile kokulum olabilir.

Introduction

Genetik bilgi taşıyan, hücre çekirdeği en önemli organellerin hücre altı ilaç dağıtım hedefi farklı gen çoğaltma modülasyon beri biridir ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların tedavisinde etkili ve genetik ifadesidir 1,2,3bozuklukları. Gibi nükleer yerelleştirme sinyalleri (NLS)4,5,6 yaygın olarak araştırılması için nükleer teslimat ilaçların peptid konjugasyon Etiketler. Ancak, istenmeyen yan etkileri azaltmak için nükleer translocation kronolojik zamanmekansal kontrolü gereklidir.

Daha önce ışık tetiklemeli translocation proteinlerin hücre çekirdeği içine kafesli NLS7,8,9kullanılarak elde edilmiştir. NLS içine hücre çekirdeği sitoplazmik taşıma proteinleri6bağlama yaparak geçirir. Bildirilen yöntemlerde kafesli NLS taşıyan Konuk proteinler doğrudan mikroenjeksiyon8 tarafından sitoplazma dahil veya genetik kod genişleme teknik9kullanarak hedef hücrelerde dile getirdi. Bu nedenle, hücresel alımı ve nükleer translocation fotoğraf kaynaklı elde edebilirsiniz bir yöntem pratik uygulamalar için avantajlıdır.

Burada, nükleer translocation ışık tetiklemeli dendritik kafesli moleküler tutkal (kafeslitutkal-R, Şekil 1) Etiketler kullanarak canlı hücreler Konuk açıklar. Suda çözünen moleküler tutkallar10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , birden çok Gu+ kolye taşıyan 23 daha önce hangi sıkıca proteinler11,12,13,14,-15uygun geliştirilmiştir, 16,17, nükleik asitler18,19,20, fosfolipid membranlar21ve kil nanosheets22,23 üzerinden Gu+ kolye ve oxyanionic gruplarını temel hedefleri arasında birden fazla tuz köprüleri oluşumu. Kafeslitutkal-R Gu+ kolye bir anyonik photocleavable grup bütrat yerine nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) tarafından korunmaktadır. Kafeslitutkal-R ile öğesini konuklar kapladığı yaşam içine hücreleri ile endositoz've konaklama endosomes (Şekil 2). Photoirradiation, kafeslitutkal-R BANVOC grupları öğesini Konuk göç kolaylaştıran birden çok Gu+ kolye, taşıyan bir kokulum moleküler tutkal (Uncagedtutkal-R) vermeye ayrılır hücre çekirdeği (Şekil 2) tarafından takip sitoplazma. Kafeslitutkal-R etiket UV veya iki fotonlu yakın kızılötesi (Nur) ışık ciddi fototoksisite olmadan maruz kokulum olabilir. Biz spatiotemporally kontrollü nükleer teslimat makromoleküllerin konuklar hem de kuantum nokta (QDs) ve floresan boya (nitrobenzoxadiazole; kullanarak küçük molekül konuklar kafeslitutkal-R etiketlerle göstermek NBD), sırasıyla, örnek olarak.

Figure 1
Resim 1: Şematik yapıları kafeslitutkal-r. 9 guanidinium iyon (Gu+) kolyeler kafeslitutkal-r bütrat yerine nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) grubu tarafından korunmaktadır. BANVOC grupları ile UV veya iki fotonlu nur ışık tarafından i ciddi. Kafeslitutkal-R odak özünü nitrobenzoxadiazole (NBD) veya dibenzocylooctyne (DBCO) ile functionalized. Başvuru20izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Işık tetiklemeli nükleer translocation Konuk şematik gösterimi Birleşik bir kafeslitutkal-R etiketiyle. Konuk /kafeslitutkal-R eşlenik yaşam içine alınır endositoz ile hücre. Photoirradiation, kafeslitutkal-R endosomal kaçış tagged Konuk kolaylaştırabilir bir Uncagedtutkal-R etiketi verim kokulum etikettir. Daha sonra tagged Konuk hücre çekirdeği geçirir. Başvuru20izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlanması konuklar kafeslitutkal-R ile Etiketler

  1. Kafeslitutkal-NBD çözüm hazırlamak.
    1. Kafeslitutkal-NBD (Şekil 1) aşağıdaki yordamlar yukarıda açıklanan20sentez.
    2. Kafeslitutkal-NBD (10 mM) Kuru dimetil sülfoksit (DMSO) içinde stok çözeltisi hazırlamak.
      Not: stok çözüm karanlıkta saklamak. Çözüm sulu arabellekleri veya hücre kültür medya kullanımı üzerine ile seyreltilmiş.
  2. Kafeslitutkal-QD çözüm hazırlamak.
    1. Kafeslitutkal-dibenzocylooctyne (kafeslitutkal-DBCO) sentez (Şekil 1) aşağıdaki yordamları daha önce açıklanan20.
    2. Kafeslitutkal-DBCO (10 mM) Kuru DMSO içinde stok çözeltisi hazırlamak.
    3. Kafeslitutkal-QD hazırlanması için ilk azid functionalized QDs (azid-QD; hazırlamak Şekil 3). Bir DMF 400 µL için 100 µL azid-PEG4-NHS ester (Şekil 3) dimetil formamide (DMF, 125 µM) çözeltisi ekleyin (500 nM) Amin functionalized PEG (Amin-QD; ile kaplı çözüm kuantum nokta (QDs) Şekil 3). 1s için karışımı oda sıcaklığında ilave edin.
    4. DMF rejenere selüloz membran 3.500 molekül ağırlığı kesme (MWCO) ile kullanarak 800 mL karşı 24 h için elde edilen çözüm diyaliz.
    5. Kafeslitutkal-DBCO için 50 µM DMF ile hisse senedi çözüm sulandırmak. 200 µL çözüm sonrası diyaliz (Şekil 3) ekleyin ve karışımı 3 h için oda sıcaklığında ilave edin.
    6. DMF rejenere selüloz membran (25.000 MWCO) kullanarak 800 mL karşı 24 h için elde edilen çözüm diyaliz.
    7. 200 için elde edilen çözüm seyreltik nM DMF ile.

Figure 3
Şekil 3: şematik kafeslitutkal-QD hazırlanması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. mikroskobik gözlemler için Hep3B hücre örnek hazırlanması

  1. Altında %5 37 ° C'de % 10 fetal Sığır serum (FBS) içeren kartal'ın en az gerekli Orta (EMEM) insan hepatosellüler karsinom Hep3B hücreleri korumak CO2.
  2. Tohum hücreleri bir gün önce deney. Bir 8 odalı cam alt katman içinde EMEM kuyu başına tohum 5.0 × 103 Hep3B hücreleri (% 10 FBS, 200 µL) ve hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 24 h için.
  3. Kültür orta kaldırmak ve hücre örnek 100 µL Dulbecco'nın fosfat tampon salin (D-PBS) ile iki kez yıkayın.

3. küçük molekül Konuk UV ışık tarafından tetiklenen nükleer Translocation gözlenmesi

  1. (Hazırlanan adım 2.3) hücre örnekle FBS ücretsiz EMEM kafeslitutkal-NBD içeren 200 µL tedarik (10 µM) ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 3 h için.
    Not: Kuluçka FBS ücretsiz EMEM 4 h daha uzun süre içinde hücre örneğinin ciddi hücre hasarı neden olur.
  2. Kültür orta kaldırmak ve hücre örneği D-PBS 100 µL ile iki kez yıkayın.
  3. Endosomes görselleştirme için hücre örnek EMEM 200 µL ile tedarik (% 10 FBS) kırmızı-floresan boya içeren (Örneğin, LysoTracker kırmızı, 100 nM) ve elde edilen hücre örneği 37 ° C'kuluçkaya altında %5 20 dakika süreyle CO2 ' yi kaldırmak kültür Orta ve durulama ile iki kez 100 µL D-PBS, hücre örnek. Hücre örneği EMEM 200 µL ile tedarik (% 10 FBS).
  4. İçin nükleer translocation kafeslitutkal-NBD, UV ışığı için 2 dk üzerinden fiber optik bir 365 nm bant filtre ile donatılmış 100-W xenon ışık kaynağı kullanarak bir hücre örneğine maruz. Hücre örneği için UV Işınlarına maruz kalma olmadan, hücre örnek karanlıkta bırakın.
    Not: Cam yüzeylerde kapak için etkili UV Işınlarına maruz kalma kapalı alınabilir. UV ışık uzun süre maruz sitotoksisite hücrelere neden olabilir.
  5. Çekirdeklerin görselleştirme, kültür ortamına Höchst 33342 (1 mg/mL) 1 µL eklemek ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 10 dk için.
  6. Hücre örnek mikroskobu tarama confocal lazer konu ve filmler uyarma 488, üzerine kayıt nm (λobs 500-530 nm =), 543 nm (λobs 565-620 nm =) ve 710 nm (iki fotonlu; λ OBS 390-465 nm =) için NBD, kırmızı-floresan boya ve Höchst 33342, anılan sıraya göre.

4. küçük molekül Konuk iki fotonlu nur ışık tarafından tetiklenen nükleer Translocation gözlenmesi

  1. (Hazırlanan adım 2.3) hücre örnekle FBS ücretsiz EMEM kafeslitutkal-NBD içeren 200 µL tedarik (10 µM) ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 3 h için.
  2. Kültür orta kaldırmak ve hücre örneği D-PBS 100 µL ile iki kez yıkayın. Hücre örneği EMEM 200 µL ile tedarik (% 10 FBS).
  3. Hücre örnek mikroskobu tarama confocal lazer konu ve filmler uyarma 488, üzerine kayıt nm (λobs 500-530 nm =).
  4. İki fotonlu uyarma lazer ile ilgi hücre de dahil olmak üzere bölge için nükleer translocation kafeslitutkal-NBD, ışınlatayım (710 nm), yüklü bir ışık kaynağı olarak 2 dk (30 s × 4) için mikroskop. Translocation 4.3 adımda anlatıldığı gibi gözlemlemek.

5. makromoleküllerin Konuk UV ışık tarafından tetiklenen nükleer Translocation gözlenmesi

  1. (Hazırlanan adım 2.3) hücre örnekle FBS ücretsiz EMEM kafeslitutkal-QD içeren 200 µL tedarik (10 nM) ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 3 h için.
  2. Kültür orta kaldırmak ve hücre örneği D-PBS 100 µL ile iki kez yıkayın. Hücre örneği EMEM 200 µL ile tedarik (% 10 FBS).
  3. İçin nükleer translocation kafeslitutkal-QD, UV ışığı için 2 dk üzerinden fiber optik bir 365 nm bant filtre ile donatılmış 100-W xenon ışık kaynağı kullanarak bir hücre örneğine maruz. Hücre örneği için UV Işınlarına maruz kalma olmadan, hücre örnek karanlıkta bırakın.
  4. Çekirdeklerin görselleştirme, kültür ortamına Höchst 33342 (1 mg/mL) 1 µL eklemek ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 10 dk için.
  5. Hücre örnek mikroskobu tarama confocal lazer konu ve filmler uyarma 405, üzerine kayıt nm (λobs 430-520 nm =) ve 488 nm (λobs 625-680 nm =) Höchst 33342 ve QDs, anılan sıraya göre.

6. hücre canlılığı tahlil

  1. İnsan hepatosellüler karsinom Hep3B hücrelerde EMEM korumak (% 10 FBS) 37 ° c altında %5 CO2.
  2. Tohum hücreleri bir gün önce deney. Bir 96-şey kültür tabağına EMEM kuyu başına tohum 5.0 × 103 Hep3B hücreleri (% 10 FBS, 200 µL) ve hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 24 h için.
  3. Kültür orta kaldırmak ve hücre örneği D-PBS 100 µL ile iki kez yıkayın.
  4. Hücre örneği FBS ücretsiz EMEM kafeslitutkal-NBD içeren 200 µL ile tedarik (0,1-100 µM) ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 3 h için.
  5. UV ışık için 2 dk yolu ile hücre örneğe fiber optik bir 365 nm bant filtre ile donatılmış 100-W xenon ışık kaynağı kullanarak bir ifşa. UV Işınlarına maruz kalma olmadan bir benzer hücre örnek için hücre örnek karanlıkta bırakın.
  6. Hücre sayımı Kit-8 reaktif (10 µL) 10 µL kültür ortamına Ekle ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 2 h için.
  7. Hücre örnek soğurma spektroskopisi için konu (λ = 450 nm) bir Mikroplaka Okuyucu kullanarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Photoirradiation önce onların iç punctate floresan emisyon kafeslitutkal-NBD ile inkübe Hep3B hücreleri sergilenen (λext 488 = nm; Rakamlar 4A ve 4 C, yeşil). Benzer bir test uyarma, 543 üzerine elde edildi kafeslitutkal-NBD endosomes içinde lokalize gösteren nm kırmızı-floresan boya (rakamlar 4B ve 4 C, kırmızı). Buna göre floresans emisyon kafeslitutkal-NBD için (Şekil 4 d, yeşil) atanabilir Höchst 33342 ile görüntülenmiştir hücre çekirdeği dışında gözlenmiştir (λext = 710 nm, iki fotonlu; Şekil 4 d, mavi). UV ışınlama sonra yayılan hücreleri floresan NBD (Şekil 4E, yeşil) nedeniyle de çekirdek (Şekil 4E, mavi), kafeslitutkal-NBD verim Uncagedtutkal-NBD, içine göç için kokulum düşündüren sitoplazma hücre çekirdeği tarafından takip. Kafeslitutkal-NBD nükleer böyle translocation sitesi-seçmeli olarak iki fotonlu nur ışık (Şekil 5A ve Film 1, beyaz çizgili Daire) bağlı olmak. Şekil 5B ve Film 1' de gösterildiği gibi kafeslitutkal-NBD nonirradiated alanlarda endosomes kaçmadı ve punctate floresan kaldı. Kayda değer hiçbir sitotoksisite kafeslitutkal-NBD ile tedavi öncesi ve düz-den sonra UV Işınlarına maruz kalma (Şekil 6) hücrelerin gözlendi.

Kafeslitutkal-R Etiketler Ayrıca hücre çekirdeği içine QDs gibi makromoleküllerin konuklar teslim edebilirsiniz. QD /kafeslitutkal-R eşlenik (kafeslitutkal-QD, Şekil 3) alınabilir Hep3B hücrelere (Şekil 7A). Hücre çekirdeği Höchst 33342 ile görselleştirme kafeslitutkal-QD photoirradiation (7A rakam) önce çekirdeği dışında kalan gösterir. 2 min için UV Işınlarına maruz kalma sonra QDs floresans emisyon (rakamlar 7B ve 7 C) çekirdeğinde ortaya çıktı. Hücreleri kesitsel bir görüntüsünü floresans emisyon QDs için atanabilir gerçekten üzerinden çekirdek (Şekil 7 d) içinde duyulur olduğunu gösterdi.

Figure 4
Resim 4: Endosomal kaçış ve kafeslitutkal-NBD UV ışık tarafından tetiklenen nükleer translocation. Confocal lazer filmler Hep3B hücre kafeslitutkal-NBD içeren EMEM 37 ° C'de 3-h kuluçka sonra tarama (10 µM) ardından D-PBS ile durulama tarafından. (a, B) Filmler uyarma (A) 488, üzerine kaydedildi nm (λobs 500-530 nm, yeşil =) ve (B) 543 nm (λobs 565-620 nm, kırmızı =) EMEM 20 dk kuluçka sonra (% 10 FBS) kırmızı-floresan boya içeren (100 nM) . (A) ve (B) (C) birleştirilmiş görüntü. (D, E) Filmler kaydedilen uyarma 488, üzerine nm (λobs 500-530 nm, yeşil =) ve 710 nm (iki fotonlu; λ OBS 390-465 nm, mavi =). Kafeslitutkal-NBD ile tedavi Hep3B hücreleri EMEM 37 ° C'de inkübe (% 10 FBS) Höchst 33342 (5 µg/mL) önce (D) ve (E) 2-min UV Işınlarına maruz kalma 365, sonra içeren nm. Ölçek çubukları 20 µm. Reprinted izni başvurusu20=. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Kafeslitutkal-NBD iki fotonlu nur ışık tarafından tetiklenen nükleer translocation. Confocal lazer filmler Hep3B hücre kafeslitutkal-NBD içeren EMEM 37 ° C'de 3-h kuluçka sonra tarama (10 µM) ardından D-PBS ile durulama tarafından. Filmler uyarma 488, üzerine kaydedildi nm (λobs 500-530 nm =) önce (A) ve (B) iki fotonlu ışınlama 710, sonra 2 dk (30 s × 4) nm. (A) beyaz kesikli çemberde radyasyonlu alanını temsil eder. Ölçek çubukları 20 µm. Reprinted izni başvurusu20=. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: hücre canlılığı tahlil. Viabilities Hep3B hücre kafeslitutkal-NBD içeren EMEM kuluçka sonra (0,1-100 µM) (A) öncesi ve sonrası (B) 2-min UV Işınlarına maruz kalma, 365 nm. Başvuru20izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: Kafeslitutkal-QD UV ışık tarafından tetiklenen nükleer translocation. Confocal lazer Hep3B hücrelerin uyarma 405, üzerine filmler tarama nm (λobs 430-520 nm =) ve 488 nm (λobs 625-680 nm =). Hep3B hücreleri EMEM kafeslitutkal-QD içeren 3 h için 37 ° C'de inkübe (10 nM), D-PBS ile durulanır ve EMEM 10 min için 37 ° C'de inkübe (% 10 FBS) Höchst 33342 (5 µg/mL) (A) önce ve UV (B, C) 2-min maruz kaldıktan sonra içeren ışık, 365 nm. (D) (c) sarı hattı boyunca kesitsel görüntü. Ölçek çubukları 20 µm. Reprinted izni başvurusu20=. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Movie
Film 1. Nükleer translocation kafeslitutkal-NBD iki fotonlu nur ışık tarafından tetiklenen. Hızlandırılmış confocal lazer Hep3B hücrelerinin mikroskopisi kafeslitutkal-NBD içeren EMEM 37 ° C'de 3-h kuluçka sonra tarama (10 µM) ardından D-PBS ile durulama tarafından. Filmler 3 sn aralıklarla uyarma 488, üzerine kaydedildi nm (λobs 500-530 nm =). Beyaz çizgili daire içinde yer alan hücreleri iki fotonlu NIR 710 ışık ile ışınlanmış nm için 2 dk (30 s × 4). Başvuru20izni ile yayımlanmaktadır. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Önceki araştırmalar, ışık tetiklemeli translocation proteinlerin hücre çekirdeği içine kafesli NLS7,8,9kullanılarak elde edilmiştir. Daha önce belirtildiği gibi bu yöntemler NLS öğesini proteinler sitoplazma dahil etmek için ek teknikler gerektirir. Buna ek olarak, bizim kafeslitutkal-R etiketi sadece nükleer translocation fotoğraf kaynaklı aynı zamanda misafir hücresel alımını sağlar. Bu özellik kafeslitutkal-R etiketinin içinde vivo uygulamalar için avantajlıdır.

Kafeslitutkal-R etiketi hücre çekirdeği içine QDs gibi makromoleküllerin konuklar teslim edebilirsiniz. Burada istihdam QDs çapı daha büyük (DH = 15-20 nm) nükleer gözenekleri daha (~ 5 nm)24bu pasif çekirdek yaygın olamaz oluştururlar teslim imkanı düşündüren,. İyi kurulmuş25kurallarıdır azid gruplarla biomacromolecular yüzeylerin functionalization için; Buna ek olarak, kafeslitutkal-R Etiketler gibi bir demir birimi kafeslitutkal-R uygulanabilirliği genişletecek diğer fonksiyonel grupların maleimides, N- hydroxysuccinimide (NHS) esterleri ve benzeri gibi taşıyan sentezi çeşitli Etiketler biomacromolecules.

Tabii ki, bu yöntemin kritik adım kafeslitutkal-R ile endositoz ile öğesini konuklar birleşme olduğunu. Tagged konuklar hücresel alımını verimliliğini onların konsantrasyon ve kuluçka süresi bağlıdır. Konuklar ilgi, kafeslitutkal-R ile tagged zaman verimsiz endocytosed iseniz, tagged Konuklar daha yüksek konsantrasyon ile daha uzun hücreleri kuluçkaya. Kafeslitutkal-R Konuk dahil sayısını artırmak mümkün bir alternatiftir.

Bu protokol için kullanılan konuklar kovalent kafeslitutkal-R etiketi için Birleşik. Kendi bağlama hedef biomolecules için hantal dendritik etiketi tarafından inhibe bu yana bu özellikle küçük molekül ligandlar, teslim etmek için potansiyel bir dezavantaj olduğunu. Kafeslitutkal-R etiketi ve konuk molekül arasında uyaranlara duyarlı bağlayıcı26 birleşmesiyle konuklar yayımlanmasından sonra nükleer translocation izin verebilir.

Özetle, biz nükleer translocation ışık tetiklemeli kafesli photoactivatable moleküler tutkal (kafeslitutkal-R) Etiketler kullanarak Konuk gösterdi. Kafeslitutkal-R ile öğesini konuklar yaşam içine alınır endositoz ile hücre ve endosomes içinde kalır. Photoirradiation, kafeslitutkal-R Uncagedtutkal-endosomal kaçış ve konukların sonraki nükleer translocation kolaylaştırır R için dönüştürülür. Daha uzun süreli gözlemler endosomes olanların yanı sıra içinde kalan konuklar kaderi araştırmak önemli olabilir hücre çekirdeği teslim. Spatiotemporally kontrollü gen ekspresyonu kafeslitutkal-R Etiketler kullanarak daha fazla araştırma yapılması layık ilginç bir konu var.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

NanoBio entegrasyonu için Tokyo Üniversitesi Merkezi anıyoruz. Bu eser için genç bilim adamları (B) (26810046) K.O. Grant-in-Aid tarafından desteklenen ve Grant-in-Aid tarafından özel olarak terfi için araştırma (25000005) ta RM sayesinde araştırma bursu Japonya Derneği promosyon, bilim (JSP'ler için kısmen destekleniyor ) genç bilim adamları ve önde gelen Enstitüler (GPLLI) için Program için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
  13. Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Tags

Kimya sayı 143 moleküler tutkallar photoactivation hücre çekirdeği endosomal kaçış nükleer translocation iki fotonlu uyarma kuantum nokta
Spatiotemporally Photoactivatable etiketleri kafesli moleküler tutkallar kullanılarak canlı hücreler Konuk nükleer Translocation kontrollü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A.,… More

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter