Summary
Antimikrobiel synergi test bruges til at vurdere effekten af to eller flere antibiotika, der anvendes i kombination og udføres typisk af en af to metoder: skakternet array eller tid-kill assay. Her præsenterer vi en automatiseret, inkjet printer-assisteret skakternet array synergi teknik og en klassisk tid-kill synergi undersøgelse.
Abstract
Som satser for multidrug-resistente (MDR) patogener fortsætter med at stige, overgår udviklingen af nye antimikrobielle stoffer, grad nye strategier til behandlingen af MDR bakterier i stigende en nødvendighed. En sådan tilgang er kombinationsbehandling, i hvilke to eller flere antibiotika bruges sammen til at behandle en infektion imod hvilke en eller begge af narkotika kan være ineffektive alene. Når to stoffer sammen, lægge en større end additiv effekt, de betragtes synergistisk. In vitro undersøgelse af synergistisk aktivitet er et vigtigt første skridt i evaluering muligt effektiviteten af narkotika kombinationer. To vigtigste in vitro-synergy test metoder er blevet udviklet: matrixen skakternet og tiden-kill undersøgelse. I dette papir, præsenterer vi en automatiseret skakternet array metode, der gør brug af inkjet print teknologi til at øge effektiviteten og nøjagtigheden af denne teknik, såvel som en standard manuel tid-kill synergi metode. Automatiseret skakternet array kan tjene som en høj overførselshastighed screening assay, mens manuel tid-kill undersøgelsen giver yderligere, supplerende data på synergistisk aktivitet og drab.
Skakternet array er en ændring af standard mindste hæmmende koncentration (MIC) test, hvor bakterier er inkuberes med antibiotika på forskellige koncentration kombinationer og evalueret for væksthæmning efter natten inkubation. Manuel ydeevne af matrixen skakternet kræver en møjsommelig og fejlbehæftet serier af beregninger og fortyndinger. I den automatiserede metode præsenteres her, beregning og udlevering af nødvendige antibiotika stamopløsning diskenheder er automatiseret ved hjælp af inkjet printer teknologi. I gang-kill synergi assay, er bakterier inkuberes med antibiotika af interesse, både sammen og hver for sig, og stikprøven med intervaller i løbet af 24 timer for kvantitative kultur. Resultaterne kan afgøre, hvorvidt en kombination er synergistiske og om det er bakteriedræbende og levere data om hæmning og drab af bakterier over tid.
Introduction
Spredningen af multiresistente (MDR) bakterielle patogener, især MDR Gram-negative bakterier såsom carbapenem-resistente Enterobacteriaceae (CRE), har forladt klinikere med stadig mere begrænsede muligheder for vellykket antiinfektiøs terapi 1, et problem, der forværres af den træge tempo af nye antibakterielle drug discovery2,3. Antimikrobiel synergi, hvor to lægemidler, der anvendes i kombination udøve en større-end-additiv effekt, giver mulighed for at redde eksisterende antibiotika til brug i behandling af MDR bakterier, selv når disse bakterier er resistente over for den ene eller begge af de antibiotika individuelt. De teknikker, der er beskrevet i denne hvidbog giver to komplementære metoder til in vitro-synergy test, når de bruges sammen, tillade efterforskere at effektivt skærmen antimikrobiel kombinationer af interesse for dokumentation af synergistisk aktivitet (den automatiserede skakternet array metode) og derefter yderligere evaluere kinetik af hæmning og drab demonstreret af lovende kombinationer identificeres i screening etape (den manuelle tid-kill metode).
En af de mest almindeligt anvendte metoder til in vitro-synergy test er skakternet array assay, en ændring af mindste hæmmende koncentration (MIC) test, hvor de hæmmende aktivitet af to forskellige antibiotika mod en bakteriel isolere er testet over en række koncentration kombinationer4,5. Hvis de to stoffer udøve større end additiv aktivitet når de bruges sammen, kombinationen er betragtes som synergistiske6. Opsætning af et skakternet array manuelt indebærer imidlertid en række beregninger og fortynde og pipettering trin, der er besværlige og sårbare over for menneskelige fejl. Disse begrænsninger har haft virkningen at begrænse brugen af synergi test primært til retrospektiv evaluering af et lille antal antibiotika kombinationer og bakteriel isolater, og resultaterne har ikke altid været konsekvent blandt undersøgelser7, 8,9,10,11. Derudover har kompleksiteten af synergy test bidraget til dens utilgængelighed i klinisk Mikrobiologi laboratorium og virtuelle fraværet af in vitro-synergy test data fra kliniske studier af kombination terapi12, 13.
For at øge effektiviteten og gennemløb af metoden skakternet array, gjorde vi brug af en automatiseret MIC test teknik tidligere udviklet i vores laboratorium, der benytter inkjet print teknologi til netop og konsekvent fritage små mængder af antibiotika stamopløsning i brønd i et mikrotiter plade14. Platformen overflødiggør behovet for komplekse beregninger og flere pipettering trin. Det tilknyttede programmel beregner og dispenserer passende mængder af antibiotika for at oprette en todimensional skakternet array, hvis brugeren simpelthen indlæser rækken ønskede koncentration og Stamopløsningens koncentration af antibiotika. Vi i første omgang testet denne metode mod en samling af CRE isolater15 og efterfølgende har fokuseret på test colistin-holdige kombinationer for aktivitet mod colistin-resistente isolater16. Colistin er et lægemiddel af sidste udvej generelt reserveret til brug i behandling af MDR Gram-negative patogener17,18, og colistin modstand gør allerede MDR bakterier næsten pan-resistente19, hvilket gør dem ideelle kandidater til udviklingen af nye terapeutiske strategier ved hjælp af narkotika som de er ufølsomme individuelt. Vi fandt, at kombinationen af colistin og protein syntese hæmmer antibiotika minocycline havde et meget højt sats af synergi, selv mod stammer, der var resistente over for hvert af disse stoffer enkeltvis, formentlig fordi colistin udøver en subinhibitory permeabilizing effekt på selv colistin-resistente bakterier. Vi har valgt denne kombination skal bruges som et eksempel i dette papir. Af note, synergi test kan også bruges til at evaluere for øget effekten af to lægemidler, som er både effektiv individuelt.
Metoden automatiseret skakternet array letter hurtig, høj overførselshastighed synergi test. Skakternet array metode har imidlertid begrænsninger. Som en modificeret MIC assay, det giver data kun på hæmning af bakteriel vækst og ikke på drab, og det giver ikke data om antibiotikaresistens virkninger over tid. Derimod manuel udførelsen af tid-kill synergi assays er mere arbejdskraftintensive men indeholder oplysninger om både hæmning og drab over en 24 h tid kursus20,21. Vi brugte tid-kill analyse på et mindre antal isolater bekræfte vores skakternet array resultater og at afgøre, om de synergistiske kombinationer vi identificeret var også bakteriedræbende.
Begge skakternet array og tid-kill synergi metoder give værdifulde oplysninger om aktiviteten af stoffet kombinationer, og er især nyttig ved vurdering potentielle nye terapeutiske muligheder for meget resistente bakterielle patogener. Metoderne, der også har iboende begrænsninger. Standard microbroth fortynding MIC metode har en kendt forventede fejl række 1 tofolds22, der øges, når to stoffer testes sammen i et skakternet array. Standarddefinition af synergi, som finder en synergistisk kombination kun hvis stofferne er aktive sammen på en fjerdedel deres respektive mikrofoner6, tager hensyn til dette forventes variabilitet, men sådanne variabilitet, (som menes at medføre fra en kombination af biologiske og tekniske udsving23) uundgåeligt genererer usikkert om synergy resultaternes pålidelighed. Manglen på etablerede kvalitetskontrol standarder for synergy test er også en strømbegrænsning. Måske er den vigtigste begrænsning af alle synergi testmetoder manglen på etablerede korrelationer mellem in vitro-resultater og kliniske resultater når kombinationer der bruges til at behandle patienter24. Enklere og hurtigere synergi testmetoder, som den automatiserede Skaktern array metode beskrevet her, kan lette integrationen af in vitro-synergy test inden for kliniske forsøg eller andre evalueringer af patient resultater for bedre at kunne karakterisere forholdet mellem in vitro- og in vivo effekter i fremtiden.
Metoden automatiseret skakternet array, der præsenterer vi her giver mulighed for høj overførselshastighed screening af en række forskellige kombinationer og giver mulighed for hurtig evaluering af usædvanlige, "høj risiko-høj belønning" kombinationer uden en større investering af tid og ressourcer. Den tid-kill metode, som vi efterfølgende vise, kan give ekstra støttende oplysninger om kombinationen synergistisk aktivitet og kan hjælpe til at karakterisere sin bakteriedræbende aktivitet og antibakterielle kinetik.
Protocol
Forsigtighed: Bruge relevante sikkerhedsprocedurer, når du arbejder med bakterier. Bære handsker og en lab coat på alle tidspunkter. Udføre arbejde i en biosikkerhed kabinet hvis aerosoler vil blive genereret eller arbejder med høj risiko patogener.
Bemærk: Tyve til 24 h før du starter eksperimenter, streak ud den bakterielle isolate(s) skal testes (fra en koloni-renset, minimalt passaged bestand frosset ved-80 ° C i tryptic soja bouillon med 50% glycerol bestand) på en blod agar plade. Inkuber plade ved 35 ° C i luften.
1. Inkjet Printer-støtteberettiget automatiserede skakternet Array synergi
- Gøre antimikrobiel stamopløsninger (colistin og minocycline).
- Bestemme antibiotika stamopløsning koncentrationer baseret på opløseligheden af antibiotika og ønskede endelige koncentrationer i skakternet array. Gøre 10 mg/mL bestande af colistin og minocycline i dette eksempel. Brug der M100 dokument til at fastlægge passende opløsningsmidler for hver antibiotiske25. Både colistin og minocycline er vandopløselige; fordi D300 inkjetprinter kræver tilføjelse af overfladeaktivt stof for ordentlig vandige væske håndtering, opløse antibiotika i ultrarent deioniseret vand med 0,3% Polysorbat 20.
- Afvejes antibiotika pulver ved hjælp af en Analysevægt og beregne volumen af opløsningsmidlet nødvendigt for at opnå målet stock koncentration.
- Hvis antibiotika er leveret som en salt (fx colistin sulfat, minocycline hydrochlorid) eller i hydreret form (fx meropenem trihydrat), eller hvis det er rapporteret af fabrikanten at have mindre end 100% renhed, udføre en styrke beregning26 til bestemme mængden opløsningsmiddel, der kræves.
- Følg dette eksempel på minocycline hydrochlorid med erklærede renhed af 900 mg/mg:
Assay renhed: 900 mg/mg
Vandindhold: ingen
Aktive brøkdel: 0.926 (fremkommer ved at dividere molekylvægt af minocycline (457.48 Da) af molekylevægt af minocycline hydrochlorid (493.94 Da)).
Potens = (Assay renhed) * (1-vandindhold) * (aktiv brøkdel)
= (900 mg/mg) * (1) * (0.926) = 833.4 mg/mg eller 83.34%
Derefter bestemme omfanget af opløsningsmiddel kræves som følger:
Volumen (mL) = [vægt (mg) * styrken (mg/mg)] ÷ [koncentration (mg/mL)]
Så, for eksempel, hvis 34,7 mg minocycline hydrochlorid pulver vejes, bruge følgende beregning til at bestemme mængden opløsningsmiddel, der kræves for at gøre en 10 mg/mL opløsning:
Volumen = (34,7 mg) * (833.4 mg/mg) = 2.89 mL
10.000 mg/mL
- Hæld antibiotika pulver i en 15 mL konisk slange og tilføje den passende mængde vand plus 0,3% Polysorbat 20. Vortex indtil opløst.
- Alikvot antibiotika stamopløsning i 0,5 mL microcentrifuge rør og opbevares ved-80 ° C indtil klar til brug.
- Udføre kvalitetskontrol (QC) af antimikrobielle bestande til brug i skakternet array eksperimenter mindst én dag før synergi test således at QC resultater kan vurderes før du bruger bestanden til synergi test.
BEMÆRK:QC teknik beskrevet her er identisk med den teknik, der vil blive anvendt til mindste hæmmende koncentration (MIC) testning af individuelle narkotika og kan bruges som sådan med alle stammer, der er af interesse for investigator.- Forberede bakteriel suspension.
- Tage en delprøve af hver antibiotiske bestand af-80 ° C fryser at starte optøning samtidig med at forberede bakteriel suspension. Vortex når optøet for at sikre, at antibiotika er i opløsning.
- Vælg en passende QC stamme og bestemme det acceptable MIC område for narkotika testet baseret på tabel 5A-1 i der M10025. For narkotika her, bruge E. coli ATCC 25922; MIC intervallerne for denne stamme er 0,25-1 mg/mL for minocycline og 0,25-2 mg/mL for colistin.
- Vælg en række antibiotika koncentrationer til test, der vil omfatte hele QC området. Bruge intervallet 0.0156 mg/mL til 8 mg/mL for minocycline og colistin for ATCC 25922.
- Der tilsættes 1 mL 0,9% natriumchlorid til en 12 mm x 75 mm rund bund glasrør kultur. Vælg en eller to kolonier fra en overnight plade ATCC 25922 og vortex forsigtigt at suspendere.
- Kontrollere koncentrationen af bakterier ved hjælp af en McFarland læser. Juster efter behov ved at tilføje flere 0,9% natriumchlorid eller flere bakterier til at opnå en 0,5 McFarland turbiditet læsning.
- Gøre en 1: 300 fortynding af 0,5 McFarland suspensionen ved tilsætning af 100 mL af suspensionen til 30 mL kation-justeret Mueller-Hinton bouillon (CAMHB) i en 50 mL konisk slange at nå frem til en afsluttende celle tæthed af 5 x 105 CFU/mL, som anbefalet af der27.
- Ved hjælp af en steril inoculating loop, isolering streak en dråbe af den begyndende inokulum på en blod agar plade til at bekræfte inokulum renhed, og der inkuberes ved 35 ° C i luften.
- Tilføje antimikrobielle stoffer til en flad bund, square-godt, klart, ubehandlet 384-godt plade ved hjælp af D300. Udføre dette trin umiddelbart efter forbereder bakteriel suspension, således at suspension kan føjes til plader indenfor 15 min forberedelse26.
- Drej på D300 inkjetprinter og de tilknyttede computer. Åbn programmet.
- Start en ny fil. Ovenstående billede af gitteret plade, skal du højreklikke på pladen 1 og vælge Rediger plade. Vælg den passende plade type (384 godt) og ekstra volumen (50 mL).
- Tilføje væsker (dvs., antibiotika bestande) i protokollen ved at klikke på plustegnet ud for væsker på panelet til venstre. Tilføje to væsker (colistin og minocycline).
- Svæve over det panel, der dukkede op for væske 1 og klik på blyant til at redigere. Navn væske "Colistin", ændre klasse til "vandige + Tween 20", ændre koncentration til 10.000, og ændre koncentration enheder til mg/mL (Bemærk, at bestanden koncentration er 10 mg/mL, dvs., 10.000 mg/mL). Forlade dispensere by på koncentration og efterlade resten af felterne på deres standardindstillinger. Klik på OK.
- Gentag ovenstående fremgangsmåde for væske 2 (minocycline).
- Klik på fanen Nuværende protokol øverst på skærmen og ændre koncentration (masse) til mg/mL til at bestemme de anvendte for endelige godt antibiotikaet koncentrationer enheder.
- Vælg 10 brønde i nettet ved at klikke og trække, så klik på titrering øverst på skærmen. Angiv titrering ved hjælp af select højeste koncentration, for væske vælge Colistin, Højeste koncentration indtaste 8 (sørge for enheder er mg/mL), og til Distribution Vælg 1:2 (50%). Forlade standard værdier i sted for resten af vinduet og klik OK.
- Gentag ovenstående fremgangsmåde for minocycline at generere minocycline titrering.
- Gem protokollen, og klik derefter på knappen Kør øverst til venstre.
- Klik på knappen Start . Indlæse en 384-godt plade (med låget fjernes) i plade-indehaveren og tryk Loaded under "Load plade 1 – synergi" prompt.
Bemærk: Denne prompt er valgt af softwaren og angiver ikke, at synergy test udføres. Placer en T8 + kassette i slidsen kassette til og tryk på Loaded under belastning en T8 + kassette prompt. - Når du bliver bedt om det, skal du tilføje antibiotika stamopløsning til de angivne reservoirer på kassetten. Følg vejledningen på skærmen for korrekt indlæsning og dispensere omhyggeligt for at undgå at få nogen bobler i løsningen. Efter hver løsning er tilføjet, skal du trykke på knappen Fyld .
- Når inkjet-printer har tilføjet antibiotika lager i passende mængder til hver brønd og feltet Kør afsluttet vises, klik på Luk, fjerne pladen og slukke D300.
- Tilføje bakteriel suspensioner til 384-godt plade og inkuberes plade.
- Hæld de tidligere parat bakteriel suspension i en steril reagens reservoir.
- Brug en multikanalpipette til at tilføje 50 mL af bakteriel suspension til alle antibiotika-holdige brønde. Der tilsættes 50 mL af CAMHB uden bakterier til en tom godt; Dette vil være den negative kontrol godt at bekræfte sterilitet af medierne.
- Læg pladen i et 35 ° C omgivende luft inkubator og Inkuber i 16-20 h26.
Bemærk: En anden varighed af inkubationen kan kraeves, hvis organismer andre end Enterobacteriaceae er ved at blive testet; konsultere der M10025 for organismen-specifikke anbefalinger.
- Læs plade på en mikrotiterplade læseren med en optisk tæthed på 600 (OD600) og analysere resultater.
- Ved hjælp af et regnearksprogram, skyggelægge celler med en OD600 værdi af ≥0.07 green, med angivelse af vækst, og celler med en værdi på < 0,07 rødt, hvilket angiver ingen vækst.
Bemærk: Disse værdier blev bestemt baseret på visuel inspektion af vækst vs. ingen vækst og korrelation med OD aflæsninger for disse eksperimenter; OD600 aflæsninger fra brønde, der indeholder medier alene var konsekvent lavere end 0,07. Passende cutoffs kan variere med forskellige plade læsere og bakterier. - Bestemme MIC for hvert stof. MIC er den laveste koncentration af stof hvor bakteriel vækst hæmmes. Hvis mikrofonen er inden for det forventede QC område ifølge der M100 dokument25, er stamopløsningen egnet til brug.
- Ved hjælp af et regnearksprogram, skyggelægge celler med en OD600 værdi af ≥0.07 green, med angivelse af vækst, og celler med en værdi på < 0,07 rødt, hvilket angiver ingen vækst.
- Forberede bakteriel suspension.
- Forberede skakternet array bakteriel suspension.
- Tage en delprøve af hver antibiotiske bestand af-80 ° C fryser at starte optøning samtidig med at forberede bakteriel suspension. Vortex når optøet for at sikre, at antibiotika er i opløsning.
- Tilføje ~ 1 mL 0,9% natriumchlorid til en 12 mm x 75 mm rund bund glasrør kultur. Vælg en eller to kolonier fra en overnight plade af bakterier (i dette tilfælde, E. coli -stamme FDA-CDC 0494) og vortex forsigtigt at suspendere disse i 0,9% natriumchlorid.
- Kontrollere koncentrationen af bakterier ved hjælp af en McFarland læser. Juster efter behov ved at tilføje flere 0,9% natriumchlorid eller flere bakterier til at opnå en 0,5 McFarland turbiditet læsning.
- Gøre en 1: 300 fortynding af 0,5 McFarland suspensionen ved tilsætning af 100 mL af suspensionen til 30 mL af CAMHB i en 50 mL konisk slange at nå frem til en afsluttende celle tæthed af 5 x 105 CFU/mL27.
- Tilføje antimikrobielle stoffer til en flad bund, square-godt, klart, ubehandlet 384-godt plade ved hjælp af D300.
Bemærk: udføre dette trin umiddelbart efter forbereder bakteriel suspension, således at suspension kan føjes til pladerne inden for 15 minutter af forberedelse26.- Drej på inkjet-printer, starter en ny fil og tilføje væsker i protokollen som i trin 1.2.2.1-1.2.2.3.
- Generere gitteret synergi.
- Klik på ikonet synergi øverst på skærmen og gå gennem trinene. Vælg to eller flere væsker indregnes sammenfor Type . For pladeer det ikke nødvendigt at udelukke enhver brønde; Klik på næste på dette trin uden at foretage ændringer.
- Angiv den antibiotikaet koncentrationer og placering under fanen titrering .
- For at tilføje minocycline i faldende fordobling fortyndinger fra 32 til 0.031 mg/mL, ud over en negativ brønd med ingen antibiotikum, ned med y's akse, skal du indtaste 12 for titreringen niveauer på panelet til venstre. Angiv titrering ved hjælp af, skal du vælge højeste koncentration; for væske, Vælg Minocycline; højeste koncentration, Indtast 32 (Sørg for enheden er angivet i mg/mL, hvis det ikke, lukke dialogboksen synergi og ændre under fanen Nuværende protokol ). Sørg for at medtage 0 værdi boks er markeret. Ændre Distribution til 1:2 (50%).
- Gentag disse trin for colistin på det højre panel, bruge 12 titrering niveauer og en højeste koncentration af 16. Klik på næste.
- Vælg fanen Layout titrering niveauer af første 2 væsker bestemmer antallet af rækker og kolonner i en layoutgitteret. Klik på næste. Hvis gitteret vises som forventet, skal du klikke på Finish.
- Gem protokollen, så klik på knappen Kør øverst til venstre.
- Klik på knappen Start . Lægge en 384-godt plade (med låget fjernes) i plade-indehaveren og trykke Loaded under belastning plade 1 – synergi prompt. Placer en T8 + kassette i slidsen kassette til og tryk på Loaded under belastning en T8 + kassette prompt.
- Når du bliver bedt om det, skal du tilføje antibiotika stamopløsning til de angivne reservoirer på kassetten. Følg vejledningen på skærmen for korrekt indlæsning og dispensere omhyggeligt for at undgå at få nogen bobler i løsningen. Efter hver løsning er tilføjet, skal du trykke på knappen Fyld .
- Når D300 dispenser har tilføjet antibiotika lager i passende mængder til hver brønd og feltet Kør afsluttet vises, klik på Exit, fjerne pladen og slukke D300.
- Tilføje bakteriel suspensioner til 384-godt plade og inkuberes plade.
- Hæld de tidligere parat bakteriel suspension i en steril reagens reservoir.
- Brug en multikanalpipette til at tilføje 50 mL af ophæng til alle brønde i matrixen skakternet. Der tilsættes 50 mL af CAMHB uden bakterier til en tom godt; Dette vil være den negative kontrol godt at bekræfte sterilitet af medierne. Inkuber i et 35 ° C omgivende luft inkubator for 16-20 h26.
- Læs plade på en mikrotiterplade læser på OD600 og analysere skakternet array resultater.
- Først kontrollere renhed plade og sikre, at de isolerede kolonier er en enkelt morfologi, der er i overensstemmelse med den forventede morfologi af organismen bliver testet.
- Ved hjælp af et regnearksprogram, skyggelægge celler for at angive vækst og ingen vækst som i trin 1.2.4.1.
- Bestemme MIC for hvert stof. For et stof, der ikke hæmmer bakterievækst ved den højeste koncentration testet, MIC er anses for at være off-skala.
- For hver brønd hvor vækst hæmmes, bestemmer den fraktioneret hæmmende koncentration (FIC) for hver antibiotikum baseret på dette antibiotikum MIC (Se figur 1B og figur 2B).
Bemærk: FIC er forholdet mellem koncentrationen af antibiotika i en brønd, hvor vækst er hæmmet til sin mikrofon; så for et stof med en mikrofon på 8 mg/mL, et godt indeholdende 8 mg/mL af dette stof har en FIC 1, mens en godt indeholdende 4 mg/mL har en FIC på 0,5. - Beregne fraktioneret hæmmende koncentration (FICjeg) indeksværdien for hver brønd hvor vækst hæmmes som summen af FICs hver af narkotika i så godt.
- Bestemme den laveste FICjeg som vækst er hæmmet (minimum FICjeg). Hvis den minimale FICjeg er £0.5, overveje kombinationen synergistiske; Hvis 0,5-4, overveje kombinationen ligegyldige; og hvis > 4, overveje kombinationen antagonistisk. Hvis kombinationen er synergistisk på nogle koncentration kombinationer men antagonistisk på andre, Bemærk dette resultat men overveje kombinationen samlede antagonistisk.
2. gang-kill synergi test
- Gøre antimikrobiel stamopløsninger. Hvis dette trin udføres forud for forsøget, fryse bestande på-80 ° C indtil klar til brug.
- Bestemme antibiotika stamopløsning koncentrationer baseret på opløseligheden af antibiotika og ønskede endelige koncentrationer i tid-kill undersøgelser. I dette eksempel, skal du gøre colistin og minocycline bestande i en koncentration på 1 mg/mL. Brug der M100 dokument til at fastlægge passende opløsningsmidler for hver antibiotiske25. Vandforbrug, som anbefales til både colistin og minocycline.
- Afvejes antibiotika pulver ved hjælp af Analysevægt og beregne volumen af opløsningsmidlet nødvendigt for at opnå målet stock koncentration. Hvis det er nødvendigt, udføre en styrke beregning forud for fastlæggelse af mængden opløsningsmiddel, der kræves, som beskrevet i trin 1.1.2.1 ovenfor.
- Hæld antibiotika pulver i 15 mL koniske rør og tilføje den passende mængde vand. Vortex indtil opløst.
- Manuel bouillon microdilution metoden i der M0726, udføre QC af antimikrobielle bestande til brug i tide dræbe synergi eksperimenter. Udføre dette trin mindst én dag før synergi test således at QC resultater kan prøves før ved hjælp af bestanden.
- Vælg en passende QC stamme og bestemme det acceptable MIC område for narkotika testet baseret på tabel 5A-1 i der M10025. For narkotika her, bruge E. coli ATCC 25922; MIC intervallerne for denne stamme er 0,25-1 mg/mL for minocycline og 0,25-2 mg/mL for colistin.
- Forberede antibiotikum-holdige bouillon microdilution plader.
- Vælg den højeste koncentration af antibiotika skal testes så rækken hele QC kan være inkluderet. Bruge en række 0.016 til 8 mg/mL for minocycline og colistin for ATCC 25922.
- Fortynd de antibiotiske bestande til en brugsopløsning i CAMHB på to gange den højeste koncentration (fordi det bliver fortyndet 1:1 med suspension af bakterier). I dette eksempel, fortyndes begge bestande fra 10 mg/mL til 16 mg/mL.
- Brug af en multikanal-pipette, tilsættes 100 mL af hver af 2 x antibiotika suspensioner til en brønd i den første kolonne i en klar, runde-bunden, ubehandlet 96-brønd plade og tilsættes 50 mL af almindeligt bouillon (dvs. uden antibiotikum) til hvert hul i de efterfølgende kolonner.
- Fjerne 50 mL af antibiotika-holdige bouillon fra hver godt i den første kolonne og føje til brønde i den anden kolonne. Pipetteres op og ned flere gange for at blande indholdet, generere et antibiotikum koncentration halvdelen af koncentrationen i den første kolonne.
- Gentag trin 2.2.2.4 med hver kolonne, således at en række serie to-Folds fortyndinger, hver med et volumen på 50 mL, er forberedt. Ændre pipette tips mellem hver fortynding skridt, hvis det ønskes at fjerne muligheden for antibiotika fremførsel. Bemærk, at de deraf følgende koncentrationer er alle stadig 2 x de endelige koncentrationer, som de vil efterfølgende være fortyndet 1:1 med bakteriel suspension.
- Tilføj ikke nogen antibiotikum til de sidste to kolonner, da disse vil være negativ og vækst control kolonner.
- Forberede bakteriel suspension.
- Forberede en 0,5 McFarland suspension fra en overnight plade af E. coli ATCC 25922 i 0,9% natriumchlorid, som beskrevet i trin 1.2.1.5-1.2.1.6.
- Gøre en 1:150 fortynding af 0,5 McFarland suspension ved at tilføje 50 mL af suspensionen 7,5 mL af CAMHB.
Bemærk: Den endelige bakteriel suspension vil være fortyndet 1: 300, når det blandes 1:1 med antibiotika løsning, at nå der anbefalede celle tætheden af 5 x 105 CFU/mL27).
- Tilføje bakterier til mikrotiterplade og inkuberes.
- Tilsæt 50 mL af den bakterielle suspension til hver brønd, undtagen i kolonnen 11th . Der tilsættes 50 mL af CAMHB til de 11th kolonne (negativ kontrol).
- Inkuber plade ved 35 ° C i 16-20 h.
Bemærk: En anden varighed af inkubationen kan kraeves, hvis organismer andre end Enterobacteriaceae er ved at blive testet; konsultere der M10025 for organismen-specifikke anbefalinger. - Læs plade for vækst visuelt ved hjælp af gennemlysning, og for hver antibiotikum, bestemme den laveste koncentration, der er ingen vækst; Dette er MIC. Konsultere der M07 dokument for yderligere detaljer om visuelle fortolkning af MIC26. Hvis mikrofonen er inden for det forventede interval, QC, er stamopløsningen egnet til brug.
- Start oprindelige kultur.
- Gøre en 0,5 McFarland suspension af testorganismen i steril 0,9% NaCl som beskrevet ovenfor.
- Der tilsættes 100 mL 0,5 McFarland suspension til 5 mL af CAMHB i en 25 mm x 150 mm glas runde bunden kultur tube med rustfrit stål lukning og vortex forsigtigt at blande.
- Ved hjælp af en steril inoculating loop, isolering streak en dråbe af den fortyndede suspension på en blod agar plade til at bekræfte inokulum renhed og inkuberes ved 35 ° C i luften.
- Erstatte lukning på tube og Inkuber i et reagensglas rack på en shaker ved 35 ° C i luften i mindst 3 timer, indtil logaritmiske fase vækst er nået (Se trin 2.6.1). Fortsæt til trin 2.4 mens kultur er i rugemaskinen.
- Forberede antimikrobiel løsninger i 25 mm x 150 mm glas kultur rør.
- Tegne antimikrobiel stock delprøver fra-80 ° C fryser til at tø. Vortex når optøet for at sikre, at antibiotika er i opløsning.
- Mens oprindelige kultur inkubere, der tilsættes 10 mL af CAMHB til fem autoklaveres 25 mm x 150 mm glas kultur rør og tilføje antimikrobiel stamopløsninger som følger.
Bemærk: For en synergi undersøgelse, bør mindst ét stof i en koncentration, der ikke påvirker væksten kurve individuelt28; Dette kan bestemmes ved at evaluere virkningerne af enkelt drug koncentrationer inden synergi undersøgelse.- Rør 1: Tilføje passende mængde antibiotika #1 for at opnå målet endelige antibiotikum koncentration. I dette tilfælde tilsættes 10 mL af 1 mg/mL colistin materiel for at opnå en endelig colistin koncentration af 1 mg/mL, da dette er en koncentration, der er ineffektive mod den stamme, der bruges i eksemplet.
- Rør 2: Tilføje passende mængde antibiotika #2 at opnå endelige antibiotikum koncentration skal testes. I dette tilfælde tilsættes 10 mL af 1 mg/mL minocycline materiel for at opnå en endelig koncentration på 1 mg/mL, en koncentration, der er ineffektive mod den stamme, der anvendes i dette eksempel.
- Rør 3: Tilføj den samme mængde af antibiotika #1 og antibiotikum #2 som bruges i rør 1 og 2. I dette tilfælde tilsættes 10 mL af 1 mg/mL minocycline materiel og 10 mL af 1 mg/mL colistin lager.
- Tube 4: Tilføje ingen antibiotika; Dette vil være vækst kontrol tube.
- Rør 5: Tilføje ingen antibiotika; Dette vil være negativ kontrol tube.
- Forberede 96 dybt godt polypropylen plader med 2 mL brønde for serielle fortyndinger ved at tilføje 900 µL sterilt 0,9% natriumchlorid rækker B-H i kolonnerne 1-5 med en multikanalpipette.
- Forberede start inokulum og tilføje til rør.
- Når den oprindelige kultur har nået logaritmisk vækstfase (~ 3 h for Klebsiella pneumoniae, den organisme, der anvendes i dette eksempel), fjerne kultur røret fra shaker, vortex forsigtigt, overføre ~ 1 mL af suspension til en 12 mm x 75 mm kultur glasrør, og kontrollere tæthed med en McFarland læser.
- Hvis det er mindre end 1,0 McFarland, returnere tube til shaker og udruge længere. Hvis det er større end 1,0 McFarland, føje CAMHB til rør, vortex forsigtigt, og igen prøve, gentage processen, indtil suspensionen er på 1,0 McFarland.
- Tilsættes 100 mL af 1.0 McFarland suspensionen rør 1-4 og vortex forsigtigt.
- Når den oprindelige kultur har nået logaritmisk vækstfase (~ 3 h for Klebsiella pneumoniae, den organisme, der anvendes i dette eksempel), fjerne kultur røret fra shaker, vortex forsigtigt, overføre ~ 1 mL af suspension til en 12 mm x 75 mm kultur glasrør, og kontrollere tæthed med en McFarland læser.
- Prøve delprøver fra hver kultur og udføre serie billeddetaljerne fortyndinger.
- På tidspunkt 0 (umiddelbart efter at tilføje bakterier til rør) og på 1, 2, 4, 6 og 24 h, fjerne en 150 mL alikvot fra hver kultur rør ved at vippe røret, så at kun steril pipette spidsen ind i røret og ikke usterile pipette akslen under alikvot tilbagetrækning. Tilføje delprøver, henholdsvis træk brønde i den første række af de tidligere parat 96 dyb brønd plade. Returnere rør til et reagensglas rack på en shaker i et 35 ° C omgivende luft inkubator umiddelbart efter fjernelse af delprøver på hvert tidspunkt.
- Ved hjælp af en multikanalpipette, fjerne 100 mL fra række A, tilføje til række B (som indeholder 900 mL 0,9% natriumchlorid) og pipetteres op og ned 4 - 5 gange til mix, at skabe en 1:10 fortynding. Kassér tips efter hver fortynding skridt til at forhindre fremførsel af bakterier, som kan medføre falsk forhøjede koloni tæller.
- Gentag trin 2.7.2 for rækker B-H med nye pipette tips for hver række.
- Plade fortyndede prøver til kolonien tæller ved hjælp af drop pladen metode29,30.
- Label Mueller-Hinton agar plader med antibiotika betingelser og fortyndingsgraden skal være forgyldt.
- Ved hjælp af en multikanalpipette og ekstra lange tips (for at sikre, at tips nå ind i suspension), fjerne 10 mL fra hver brønd i kolonne et og dispensere omhyggeligt i en række på behørigt mærket pladen. Små (100 mm i diameter) plader anvendes, dispensere 3 rækker (hver bestående af dråber fra en enkelt kolonne rækker A-H) pr. plade; på store (150 mm i diameter) plader, dispensere 8 rækker pr. plade.
- Tillad dråber til at tørre helt (~ 15 min).
- På 24 h, placere en 10 mL drop taget direkte fra negative kontrol rør i et angivet område i en af pladerne til at teste for sterilitet. Invertere plader og inkuberes natten over ved 35 ° C i luften.
- Tælle kolonier og beregne celle tæthed. Markere kolonier med en fin-tip permanent markør på bagsiden af pladen til at undgå dobbelt-tælling eller manglende kolonier.
- Først kontrollere renhed plade og sikre, at de isolerede kolonier er en enkelt morfologi, der er i overensstemmelse med den forventede morfologi af organismen bliver testet.
- For hver fortynding serie, skal du identificere dråber med 3-30 kolonier (typisk en dråbe pr. fortyndingsrække). Kolonierne i disse dråber og optage tæller sammen med fortyndingsfaktoren.
- Hvis der er nogen dråber i en fortyndingsrække med 3-30 kolonier, kolonierne i den sidste dråbe med > 30 kolonier og den første dråbe med < 3 kolonier (disse skal være tilstødende dråber).
- For hver fortyndingsrække, beregne antallet af kolonidannende enheder pr. milliliter (CFU/mL) i den prøve, der er baseret på antallet af kolonier i drop ved hjælp af følgende formel: CFU/mL = n(1 /d) (100) hvor n er antallet af kolonier, d er fortyndingsfaktoren (1 for ufortyndet prøve (linje A), 0,1 eller 10-1 til den første 1:10 fortynding (række B), 0,01 eller 10-2 til den anden 1:10 fortynding (række C), og så videre, og de konstante 100 regnskab for faktum, at den samlede mængde af drop jeg s 10 mL, mens den endelige værdi er udtrykt i CFU/mL, dvs, CFU/1.000 mL. Bruge et regneark, der indeholder formler, som beregner CFU/mL fra kimtal at forenkle denne proces.
- For fortyndingsrække, hvor mere end én dråbe var tællelig (eller hvor to dråber skulle medregnes, fordi ingen dråbe faldt inden for rækkevidde), den gennemsnitlige endelige CFU/mL tæller for alle optalte dråber.
- Fordi den nedre grænse for opdagelse er 300 CFU/mL (3 kolonier i ufortyndet drop), post og plot koloni tæller som £300 CFU/mL for fortyndingsrække, der er < 3 kolonier i ufortyndet drop.
- Inspicere sterilitet håndbetjening falde fra tid 24; Hvis nogen vækst er observeret i denne dråbe, bør resultaterne af forsøget ikke anvendes.
- Graf og analysere resultater.
- Plot vækstkurver fra de tre antibiotikum-holdige kulturer og vækst control på den samme graf. Plot tid på x -aksen og CFU/mL, benytter en logaritmisk skala på y -aksen.
- Beregne forskellen i CFU/mL kombination tube dengang 24 og den mest aktive enkelt agent dengang 24. Hvis forskellen er ≥2 log10, overveje kombinationen synergistisk. Derefter Beregn forskellen i CFU/mL kombination tube dengang 24 og på tidspunkt 0. Hvis forskellen er ≥3 log10, overveje kombinationen bakteriedræbende.
Representative Results
Figur 1A præsenterer et gitter fra et skakternet array synergi eksperiment i hvilke minocycline i koncentrationer på 0-32 μg/mL blev kombineret med colistin i koncentrationer på 0-16 μg/mL og testet mod E. coli stamme FDA-CDC 0494. Værdierne repræsenterer spektrofotometriske målinger ved ekstinktionen 600 nm (OD600). Brønde med OD600 værdier under 0,07 (hvilket svarer til ingen vækst ved visuel inspektion) er skyggefulde rød, mens brønde med OD600 værdier 0,07 (hvilket svarer til vækst ved visuel inspektion) er nedtonede grøn. For hvert stof er den mindste hæmmende koncentration (MIC; fed) den laveste koncentration af stof, der hæmmer bakterievækst. For minocycline, dette er 32 μg/mL og colistin, det er 8 μg/mL. Skraveringen er bevaret i figur 1B, men værdier i brøndene vækst hæmmes erstattes af fraktioneret hæmmende koncentration (FICjeg) indeksværdier. Disse er fastsat som følger: i hver brønd, fraktioneret hæmmende koncentration indekset (FIC) for hvert stof beregnes ved at dividere koncentrationen af antibiotika i godt med det stof MIC og FICjeg beregnes ved at addere de to FICs. Brønde med en FICjeg værdi på 0,5, der betragtes som cutoff for synergi, er angivet med en brudt stregramme, og godt med den laveste FICjeg værdi (0.094) er med fed. Fordi den mindste FICjeg værdi er i rækken synergistiske, kombinationen er betragtes som synergistisk.
Figur 2A og figur 2B viser gitre svarer til dem i figur 1A og figur 1B, men i dette tilfælde kombinationen ikke godtgør synergy mod isolatet testet (K. pneumoniae isolat BIDMC 4), fordi den minimum FICjeg hvor vækst hæmmes er 1, som er > 0,5.
Figur 3 illustrerer absorbansaflæsningerne af et skakternet synergi gitter, hvor flere springes wells opstod (Enterobacter cloacae komplekse isolat BIDMC 27). Springes brønde er brønde som bakteriel vækst hæmmes trods tilstedeværelsen af bakterievækst i tilstødende brønde med højere koncentrationer af antibiotikum. Dette fænomen, der vides at forekomme i standard MIC test så godt, er sandsynligvis på grund af biologiske variation i bakteriel vækst egenskaber fra godt til godt og følsomheden af nogle antibiotika til små forskelle i bakteriel inokulum23 , 31 , 32. Hvis mere end én springes over godt skete i et skakternet array, vi kasseret resultaterne og gentages analysen.
Figur 4 præsenterer eksempler på tid-kill synergi resultaterne af tre kombinationer testet mod K. pneumoniae isolere BIDMC 32. Koloni tæller er angivet i en logaritmisk skala på y-aksen og tid i timer, på x-aksen. Forskellen mellem den begyndende inokulum i røret som indeholder kombinationen narkotika og koncentrationen af bakterier i at røret på 24 h er illustreret ved den røde bar og nummer, mens forskellen mellem koncentrationen af bakterier på 24 h mellem røret indeholdende kombinationen og det rør, der indeholder de mest aktive enkelt agent alene er illustreret ved den blå bjælke og antallet. Figur 4A viser resultater fra en kombination af colistin og minocycline; Denne kombination var synergistiske (forskellen mellem koncentrationer af bakterier eksponeres kombination og mest aktive agent alene ≥2 log10 CFU/mL på 24 h) og bakteriedræbende (tilbagegang fra start inokulum koncentration på 24 h ≥3 log10 CFU/mL). Figur 4B viser resultater fra en kombination af colistin og clindamycin, en kombination, der var synergistiske men var ikke bakteriedræbende. Denne kombination hæmmet vækst af bakterier, som hverken stof gjorde alene, men ikke dræbe dem. Figur 4 c viser resultater fra en kombination af colistin og erythromycin, der var hverken bakteriedræbende eller synergistiske.
Figur 1: Skakternet array resulterer demonstrerer synergi (minocycline + colistin testet mod E. coli stamme FDA-CDC 0494). (A) spektrofotometriske udlæsning og vækst fortolkning af et skakternet array. Værdier i celler er absorbansaflæsningerne på 600 nm (OD600). Celler med OD600 værdier under 0,07 (svarende til ingen vækst ved visuel inspektion) er skyggefuld rød, mens celler med OD600 værdier 0,07 (svarende til vækst ved visuel inspektion) er nedtonede grøn. (B) fraktioneret hæmmende koncentration indeks (FICjeg) beregning. Skygge med angivelse af vækst eller ingen vækst er blevet bibeholdt. Værdier for colistin og minocycline langs x- og y-akser, henholdsvis nu repræsentere fraktioneret hæmmende koncentration (FIC) eller forholdet mellem koncentrationen af stoffet i den pågældende kolonne eller række til den mindste hæmmende koncentration ( MIC) af dette stof alene. Værdien i hver celle er FICjeg, eller summen af to FICs narkotika i så godt. Den store brudte linje-omkranset boks omslutter brønde med en FICjeg på 0,5. Den tykke-omkranset celle angiver godt med den laveste FICjeg vækst hæmmes, eller den mindste FICjeg. Fordi den mindste FICjeg er 0,5, kombinationen er betragtes som synergistisk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skakternet array resultaterne af en kombination, der ikke viser synergi (minocycline + colistin testet mod K. pneumoniae isolere BIDMC 4). (A) optisk tæthedsværdier på 600 nm og vækst fortolkning af skakternet array resultater som beskrevet i figur 1A. (B) fraktioneret hæmmende koncentration indeks (FICjeg) beregning som beskrevet i figur 1A. Fordi den mindste FICjeg er > 0,5, kombinationen er ikke betragtes som synergistisk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Skakternet array resultater, der er uninterpretable grund sprunget wells (minocycline + colistin testet mod Enterobacter cloacae komplekse isolere BIDMC 27). Optisk tæthedsværdier på 600 nm og vækst fortolkning af skakternet array resultater som beskrevet i figur 1A. Flere springes brønde, hvor bakteriel vækst hæmmes trods tilstedeværelsen af vækst i tilstødende brønde med højere koncentrationer af antibiotikum, er påvist. Resultaterne er ikke fortolkelige og eksperimentere skal gentages. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Tid-kill synergi resultaterne af tre kombinationer testet mod K. pneumoniae isoleres BIDMC 32. Koloni tæller er angivet i en logaritmisk skala på y-aksen og tid i timer, på x-aksen. Forskellen mellem koncentrationen af bakterier i kombination på 24 h og den begyndende inokulum i røret er illustreret ved den røde bar og antal. Hvis tilbagegang fra start inokulum koncentration på 24 h er ≥3 log10 CFU/mL, anses kombinationen bakteriedræbende. Forskellen mellem koncentrationen af bakterier på 24 h mellem rør indeholdende kombinationen og det rør, der indeholder de mest aktive enkelt agent alene er illustreret ved den blå bjælke og antallet; Hvis der er ≥2 log10 reduktion af CFU/mL, anses kombinationen synergistisk. (A) Colistin (CST) + minocycline (MIN), en kombination, der er både synergistiske og bakteriedræbende. (B) Colistin + clindamycin (CLI), en kombination der er synergistisk men ikke bakteriedræbende. (C) Colistin + erythromycin (ERY), en kombination, der er hverken synergistisk eller bakteriedræbende. Disse resultater blev oprindeligt udgivet som en del af en undersøgelse af colistin-holdige synergistisk aktivitet kombinationer mod colistin-resistente enterobakterier, hvor vi viste at colistin var synergistisk med en række antibiotika, der er aktive individuelt kun (f.eks clindamycin) eller primært (fx erythromycin) mod Gram-positive bakterier16. (Bemærk at erythromycin var synergistiske af skakternet array mod den stamme, der er vist, men ikke af tid-dræbe, så det er blevet valgt her som et eksempel på en ikke-synergistisk kombination.) Vi en hypotese som colistin, som er kendt for at handle ved permeabilization af Gram-negative ydre membran, udøver en sub-hæmmende permeabilizing effekt på colistin-resistente Gram-negative bakterier, at tillade indrejse af stoffer som clindamycin, normalt ikke kan angive cellen Gram-negative. Panelet (A) i denne figur er blevet ændret fra Brennan-Krohn, Pironti og Kirby 201816, copyright © American Society for Microbiology, antimikrobielle stoffer og kemoterapi, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
De to metoder beskrevet her giver begge oplysninger om aktiviteten af antimikrobielle stoffer brugt i kombination i forhold til deres individuelle aktivitet. Den automatiserede, inkjet printer-assisteret digitale udlevering metode er en tilpasning af metoden beskrevet i klinisk Mikrobiologi procedurer håndbog33, mens metoden tid-kill mere nøje følger den tilhørende protokol fra den samme referere til34.
I metoden skakternet array beregninger til at bestemme antimikrobiel materiel til at tilføje til hver brønd nødvendige mængde samt udlevering af disse mængder er automatiseret, således at eliminere nogle af de vigtigste potentielle kilder til fejl opstod i en manual skakternet array. Det er imidlertid stadig vigtigt, at investigator bestemmer, at oprindelige bestande er lavet på den planlagte fusion og at målet endelige koncentrationer er indgået D300 softwaren korrekt. Tilføje antimikrobiel suspension brønde i en 384-godt plade kan være udfordrende i første omgang og kræver pleje for at sikre at pipette tip Angiv passende brøndene og at væske splash op ikke i kanten af brøndene. En automatiseret flydende handleren kan bruges i stedet for en håndholdt multikanalpipette for at øge hastighed og nøjagtighed, hvormed den bakterielle suspension er føjet til brønde. Som beskrevet i protokollen, kræver D300 tilføjelse af det overfladeaktive stof, Polysorbat 20 (P-20), for korrekt flydende håndtering. En anden overfladeaktivt stof, Polysorbat 80, i en koncentration på 0,002%, er blevet konstateret for at sænke colistin mikrofoner for organismer med colistin mikrofoner af < 2 µg/mL i standard bouillon microdilution assays. 35 , 36 vores laboratorium tidligere vist, at P-20 i koncentrationer op til 0.0015% havde ingen effekt på D300-assisteret MIC resultater i sammenligning med reference BMD14. I analysen eksemplet præsenteres her, er den maksimale P-20, koncentrationen er 0.0014%.
Et problem vi stødte med nogle skakternet array assays var et stort antal springes brønde. Dette skete efter en uforholdsmæssige sats til visse antibiotika. Specifikt, i en skærm kombinationer mod en samling af carbapenem-resistente enterobakterierfandt vi, at samtidig med at 49 af 521 forsøg (9,4%) var ubrugelig på grund af flere springes wells, 2 af de 12 antibiotika testet (fosfomycin og cefepime) tegnede sig for 46 af disse forsøg (94%). Sådanne øgede satser er mere sandsynligt i lægemidler, som er særligt modtagelige for inokulum effekt31,32,37. Af note anbefaler der ikke test fosfomycin i bouillon fortynding25 på grund af bekymringer om resultaternes pålidelighed med denne metode, som kan forklare de upålidelige resultater set med dette stof. Nogle ændringer kan foretages til automatiseret skakternet metode efter investigator præference. Antimikrobielle stoffer kan udleveres i plader der allerede indeholder bakteriel suspension, snarere end i tomme wells, hvis dette er at foretrække af hensyn til arbejdsgangen i laboratoriet. Mens 384-godt plader blev brugt her, kan metoden også gennemføres i 96-brønd plade assays med passende ændring af godt volumen. Brugen af en 96-brønd plade format kan hjælpe med at reducere springes brønde for antibiotika, der er særligt følsomme over for små ændringer i inokulum. Ved beregning af FIC,jeg, kan der være situationer, hvor mikrofonen er unormale (dvs., højere end testet), herunder situationer, hvor stoffet testes har ingen aktivitet individuelt mod type af organismen bliver testet. I disse tilfælde, kan FIC beregnes på basis antager MIC er én fortynding højere end den højeste koncentration testet. Dette er den mest konservative strategi, som det påtager sig den maksimale mulige FIC værdi for enhver fortynding, hvor hæmning er iagttaget under synergy test. For eksempel, hvis den faktiske MIC blev i stedet to fordobling fortyndinger ovenfor den højeste koncentration testet, så de tilsvarende FICs ville være to gange lavere end de konservative tildelinger, og så videre.
Præcist vurdere de bakteriedræbende aktivitet af narkotika i en tid-kill assay, er det væsentligt, at kulturer i logaritmiske fase vækst, især når cellevæg aktive antibiotika er ved at blive testet28. For de hastigt voksende bakterier bruges i dette eksempel (K. pneumoniae), 3 timers inkubation med ryster var passende at nå denne vækstfase, men forskellige mængder af tid kan være nødvendigt for forskellige organismer. Generelt bør kulturen vises synligt, men ikke stærkt grumset. Den passende mængde tid kan bestemmes ved at konstruere en vækstkurve med koloni tæller taget på serielle tid point (f.eks. hvert 30 min for 4-6 h)38. Den planlagte start inokulum i tid-kill undersøgelse er også vigtig. Target koncentrationen af den begyndende inokulum er ca 5 x 105 til 1 x 106 CFU/mL. Fortynding beskrevet her (100 μL af 1.0 McFarland suspension i 10 mL af medier) genererer denne inokulum for Klebsiella pneumoniae og andre enterobakterier arter som vi har testet det. Hvis tætheden af de begyndende inocula i et eksperiment ved hjælp af forskellige organismer er betydeligt højere eller lavere end dette, kan derefter en anden fortynding være nødvendig. (Den passende fortynding påkrævet for en given art kan bestemmes ved at udføre et kimtal af 0,5 eller 1,0 McFarland suspension til at bestemme, hvor mange organismer denne turbiditet repræsenterer, derefter beregningen som den første udsættelse skal være fortyndes for at nå den passende slutkoncentration.) Hvis på anmeldelse af pladen tæller fra synergi undersøgelse, den begyndende inokulum af nogen af de antibiotika, der indeholder rør er fundet at have været betydeligt lavere end den begyndende inokulum i kontrolelementet vækst, kan dette angive hver antibiotiske fremførsel eller meget hurtig aflivning af bakterier i den korte tid mellem tilsætning af bakterier til antibiotika-holdige røret og fjernelse af alikvot for plating. Hvis det faktiske antal kolonier i ufortyndet drop i en serie er lavere end antallet af kolonier i efterfølgende fortyndinger, tyder dette antibiotika afsmittende virkning. Forskellige muligheder er blevet beskrevet for at forhindre denne virkning, herunder sprede en enkelt alikvot over en hel plade38 eller spinning ned prøven, fjernelse af supernatanten og re suspension i sterilt saltvand før plating39. På hvert tidspunkt i tid-kill metode er det også afgørende for investigator effektivt men præcist fjerne en prøve fra hver kultur tube og udføre serielle fortyndinger. Forsinkelser under denne proces, især i tidlig tidspunkter, der forekommer i tætte træk, kan føre til længere perioder hvor kulturer ikke er blevet udruget og rystet, skødesløse udlevering og serielle fortyndinger kan medføre unøjagtige plade tæller. I forhold til den spredning plade metode plade skal tælles, hvori 100 μL af hver fortynding er spredt over en hel agar plade, den drop plate beskrevne metode er langt mere hurtig, kræver et langt mindre antal agar plader, og giver mulighed for hurtigere optælling, som maksimalt tællelig antallet af kolonier for hver dråbe er 30, mens op til 300 kolonier kan typisk tælles fra en spredning plade. Men spredningen plade metode er også en mulighed hvis efterforskere er mere komfortabel med denne teknik. Hvis dråber spredt sig til hinanden efter påfyldes en multikanalpipette, kan individuel anvendelse af mere bredt fordelte dråber med en enkelt kanal pipette udføres i stedet. Vores erfaring syntes køling plader ved 4 ° C forud for udlevering dråber at reducere overdreven spredning.
En begrænsning af de teknikker, der er beskrevet her er at resultaterne af de to typer af synergy assay (skakternet array og tid-kill) er ikke altid overensstemmende, og da mest udgivne synergi artikler bruger én metode eller den anden stedet for begge sammen, det kan være svært at vide, hvordan man kan integrere data fra de to typer af assays. Fordi den automatiserede Skaktern array metode vi udviklede er enkel og høj overførselshastighed, vi har brugt det i realiteten som en slags skærm til at teste kombinationer mod et større antal isolater og at afgøre, hvilken koncentration kombinationer var synergistisk. Vi udførte derefter et mindre antal tid-kill undersøgelser, udvælgelse af kombinationer og koncentrationer, der havde været effektiv i matrixen skakternet. Af note, fordi skakternet assay er typisk udført på en microbroth fortynding skala, mens den tid-kill assay bruger større mængder (svarende til en macrobroth fortynding), fandt vi at FICs var undertiden forskellige mellem de to metoder, med højere koncentrationer i almindelighed kræves i tid-kill analysen at vise aktivitet. Dette fænomen er blevet bemærket tidligere, når macrobroth og microbroth fortynding MIC assay resultater sammenlignes for Gram-negative baciller26 og Hvornår større inocula (som bruges i tid-kill undersøgelser) sammenlignes med den standard inokulum anvendes i microbroth fortynding og skakternet array-undersøgelser,32. En specifik begrænsning af matrixen skakternet er den iboende variabilitet i microbroth fortynding MIC test22. Mens FICjeg cutoffs for synergy konto for denne variation matematisk6 sådanne variabilitet uundgåeligt giver anledning til bekymring om pålideligheden og konsistens af skakternet array resultater.
På grund af begrænsningerne for alle in vitro-synergy test metoder (herunder dyrkning af bakterier i en kunstig vækstmediet, statisk antibiotikaet koncentrationer og en begrænset tidsforløb), resultaterne af disse metoder skal bekræftes og yderligere vurderes ved hjælp af supplerende teknikker. Disse metoder omfatter in vitro-farmakokinetiske/farmakodynamiske (PK/PD) undersøgelser (fx den hule fibre infektion model40), dyremodeller, og i sidste ende, menneskelige PK/PD og effekt studier. Den automatiserede Skaktern array metode beskrevet her, ved at give en hurtig metode med som til skærm kombinationer for potentielle synergistisk aktivitet, giver mulighed for mere målrettet udnyttelse af disse teknikker. Yderligere automatisering af alle disse metoder, som godt som mere systematisk undersøgelse af forholdet mellem in vitro-parametre og kliniske resultater, vil være vigtigt i skalering op brugen af synergi test og øge dens kliniske anvendelighed.
Disclosures
D300 Digital Dispenser og tilknyttede forbrugsvarer blev leveret af Tecan (Morrisville, NC). Tecan spillede ingen rolle i undersøgelse design, data indsamling/fortolkning, manuskript forberedelse eller beslutningen om at offentliggøre.
Acknowledgments
Thea Brennan-Krohn blev støttet af en Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og menneskelig udvikling pediatric infektionssygdomme forskning uddannelse grant (T32HD055148), en National Institute for allergi og infektionssygdomme uddannelse grant ( T32AI007061), en Boston children's Hospital Office af fakultet udvikling Fakultet karriereudvikling stipendium, og en National Institute for allergi og infektionssygdomme karriere udvikling award (1K08AI132716). J.E.K. blev støttet af det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme af National Institutes of Health under award nummer R33 AI119114. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Escherichia coli strain ATCC 25922 | ATCC | 25922 | QC strain |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
| 1 L 0.22 µm bottle-top filter | Thermo Scientific Nalgene | 597-4520 | |
| 12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Fisherbrand | 14-961-26 | |
| 15 mL conical tubes | Phenix | SS-PH15 | |
| 15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates | Thermo Scientific | R01620 or R04050 | |
| 25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes | Bellco | 2005-02512 | |
| 25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Bellco | 2011-25150 | |
| 348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids | Greiner Bio-One | 781186 | |
| 50 mL conical tubes | Phenix | SS-PH50 | |
| 50 mL sterile reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells | Fisherbrand | 12-566-612 | |
| 96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids | Evergreen | 222-8032-01R | |
| Cation adjusted Mueller Hinton broth | BD Diagnostics | 212322 | |
| Colistin sulfate | Alfa Aesar | J60915 | |
| D300e Control Software | HP/Tecan | ||
| DensiCHEK Plus McFarland reader | bioMérieux | 21250 | |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | ||
| Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
| HP D300 digital dispenser | HP/Tecan | ||
| HP D300 T8+ cassettes | HP/Tecan | 30097370 | |
| Minocycline hydrochloride | Chem-Impex | 14302 | |
| Picus 12-channel 10-300 µL pipette | Sartorius | 735461 | |
| Polysorbate 20 | Fisher Bioreagents | BP-337 | Brand name: Tween 20 |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271 | |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 PRO | |
| Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette | Eppendorf | 2231000328 |
References
- Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management. Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).
- Spellberg, B. The future of antibiotics. Critical Care. 18 (3), (2014).
- Spellberg, B., et al. The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).
- Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).
- Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).
- Zusman, O., et al. Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).
- Clock, S. A., et al. In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).
- Hirsch, E. B., et al. Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae. Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).
- Tängdén, T., et al. Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).
- Tascini, C., et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).
- Paul, M., et al. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).
- Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).
- Smith, K. P., Kirby, J. E. Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).
- Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology. J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).
- Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).
- Nation, R. L., Li, J. Colistin in the 21st century. Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).
- Ah, Y. -M., Kim, A. -J., Lee, J. -Y. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).
- Bratu, S., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).
- Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).
- MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing. Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).
- Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance. Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).
- Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
- CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
- CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 7 (1999).
- Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests. Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).
- Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
- Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology. Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).
- Smith, K. P., Kirby, J. E. The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
- Leber, A. L. Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.16.1-5.16.23 (2016).
- Leber, A. L. Time-Kill Assay for Determining Synergy. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.14.3.1-5.14.3.6 (2016).
- Hindler, J. A., Humphries, R. M. Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).
- Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls. Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).
- Fuchs, P. C., Barry, aL., Brown, S. D. Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine. European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).
- Leber, A. L. Minimum Bactericidal Concentration Testing. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , 5.14.1.11 (2016).
- Cai, Y., et al. In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).
- Bulman, Z. P., et al. Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era. mBio. 8 (4), (2017).
