Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

סינרגיה מיקרוביאלית בדיקות על ידי באמצעות מדפסת הזרקת דיו לוח שחמט אוטומטיות מערך ושיטת להרוג זמן ידנית

Published: April 18, 2019 doi: 10.3791/58636
Automatic Translation
1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

סינרגיה מיקרוביאלית בדיקות משמש כדי להעריך את ההשפעה של האנטיביוטיקה שניים או יותר שמשמשים במשולב, מבוצעת בדרך כלל על ידי באחת משתי שיטות: המערך לוח שחמט או וזמינותו להרוג זמן. כאן, אנו מציגים ממוכנת, הזרקת דיו מדפסת בסיוע לוח שחמט מערך סינרגיה טכניקה, מחקר קלאסי סינרגיה זמן-להרוג.

Abstract

כמו המחירים של פתוגנים (MDR) multidrug עמידים ממשיכים לעלות, משיגה את התפתחות antimicrobials חדש, רומן גישות טיפול של חיידקים MDR הופכים יותר ויותר הכרח. אחד גישה כזו היא טיפול משולב, אשר שניים או יותר אנטיביוטיקה משמשים יחד לטיפול זיהום נגד איזה אחת או את שתיהן תרופות עשוי להיות לא יעיל לבד. כאשר שתי תרופות, בשילוב, להפעיל גדול יותר אפקט תוסף, הם נחשבים סינרגטי. חקירה במבחנה של פעילות סינרגטיים היא צעד ראשון חשוב בהערכת יעילות אפשרית של שילובים תרופתיים. שתי שיטות בדיקה סינרגיה במבחנה הראשי פותחו: המערך לוח שחמט, המחקר להרוג זמן. בנייר זה, אנו מציגים שיטת מערך אוטומטי לוח שחמט זה עושה שימוש בטכנולוגיית הדפסה הזרקת דיו כדי להגביר את היעילות והדיוק של טכניקה זו, כמו גם שיטה סינרגיה להרוג זמן ידני רגיל. המערך האוטומטי לוח שחמט יכול לשמש וזמינותו ההקרנה תפוקה גבוהה, בעוד המחקר זמן-להרוג ידני מספק נתונים משלימים נוספים על פעילות סינרגטיים והרג.

המערך לוח שחמט הוא שינוי של תקן הריכוז המעכב המינימלי (MIC) בדיקות, שבו חיידקים מודגרות באנטיביוטיקה-שילובים שונים ריכוז ומוערכת עבור הצמיחה עיכוב לאחר דגירה בין לילה. ביצועים ידנית של המערך לוח שחמט דורש מפרך ומועדת לשגיאות סדרת דילולים וחישובים. בשיטה אוטומטית הציגו כאן, החישוב ואת dispensing נדרש פתרון מניות לאנטיביוטיקה אמצעי אחסון הן אוטומטיות באמצעות טכנולוגיית מדפסת הזרקת הדיו. ב וזמינותו סינרגיה להרוג זמן, חיידקים מודגרות עם האנטיביוטיקה של עניין, גם ביחד וגם בנפרד, שנדגמו במרווחי זמן במשך 24 שעות ביממה לתרבות כמותית. התוצאות ניתן לקבוע שילוב סינרגטי, בין אם זה אחרים, לספק נתונים על עיכוב ו הריגת חיידקים לאורך זמן.

Introduction

התפשטות multidrug עמידים (MDR) פתוגנים חיידקיים, במיוחד MDR חיידקים גראם שליליים כגון קרבפנם עמידים Enterobacteriaceae (CRE), הותירה קלינאים עם אפשרויות מוגבלות יותר ויותר על טיפול מוצלח anti-infective 1, בעיה מתעצמת על קצב איטי של הרומן לתרופות אנטיבקטריאליות-גילוי-2,-3. סינרגיה מיקרוביאלית, שבו שתי תרופות בשילוב להפעיל השפעה גדולה יותר-יותר-תוסף, מציע את האפשרות של להציל הקיים אנטיביוטיקה לשימוש בטיפול של MDR חיידקים, גם כאשר חיידקים אלו עמידים אחד או שני אנטיביוטיקה באופן אינדיבידואלי. השיטות המתוארות במאמר זה מספק שתי שיטות משלימות של סינרגיה במבחנה בדיקה זה כשמשתמשים יחד, לאפשר חוקרים כדי ביעילות מסך שילובים מיקרוביאלית של הריבית עבור עדות (אוטומטית סינרגטיים לפעילות שיטת מערך לוח שחמט) ואז להעריך עוד יותר את קינטיקה של עיכוב והרג שבאנדרטה שילובים המבטיחים שזוהו בשלב הסינון (שיטת זמן-להרוג ידנית).

אחת השיטות הנפוצות ביותר של סינרגיה במבחנה בדיקות וזמינותו מערך לוח שחמט, שינוי של הריכוז המעכב המינימלי (MIC) בדיקה שבה לבודד פעילות המעכבת של שני סוגי אנטיביוטיקה שונים נגד בקטריאלית נבדקים מעל טווח הריכוז שילובים4,5. אם התרופות שני מפעילים יותר פעילות מוספים כאשר נעשה שימוש יחד, נחשב השילוב סינרגטי6. עם זאת, הגדרת מערך לוח שחמט באופן ידני כולל סדרה של חישובים של צעדים המדללת ו pipetting מפרך ובלתי פגיע אנוש. אילוצים אלה היו את השפעת הגבלת השימוש של סינרגיה בדיקות בעיקר הערכה רטרוספקטיבי של מספר קטן של שילובים לאנטיביוטיקה, מבודד חיידקי, התוצאות לא תמיד היו עקביים בין מחקרים7, 8,9,10,11. יתר על כן, תרמה למורכבות של סינרגיה בדיקות שלו אי-זמינות במעבדה למיקרוביולוגיה קלינית, העדר וירטואלי של סינרגיה במבחנה בדיקות נתונים ממחקרים קליניים של שילוב טיפול12, 13.

על מנת להגביר את היעילות והתפוקה של השיטה מערך לוח שחמט, עשינו שימוש אוטומטי מיקרופון בדיקות טכניקה שפותחו בעבר במעבדה שלנו המשתמשת בטכנולוגיית הדפסה הזרקת דיו כדי בדיוק וכן בעקביות לוותר על אמצעי אחסון קטן בפתרון מניות לאנטיביוטיקה לתוך בארות צלחת microtiter14. פלטפורמת obviates לצורך חישובים מורכבים והשלבים pipetting מרובים. התוכנה המשוייכת מחשבת, dispenses אחסון המתאים של אנטיביוטיקה כדי ליצור מערך דו מימדי לוח שחמט, אם המשתמש פשוט כניסות הטווח הרצוי ריכוז וריכוז פתרון מניות של האנטיביוטיקה. בתחילה נבדק בשיטה זו נגד אוסף של CRE מבודד15 ואנו מכן התמקדו בדיקות colistin המכילות שילובים עבור פעילות נגד מבודד עמידים colistin16. Colistin היא תרופה של המוצא האחרון השמור בדרך כלל לשימוש בטיפול של MDR פתוגנים גראם שליליים17,18, ו colistin התנגדות רינדור כבר MDR חיידקים עמידים כמעט פאן19, הופכות אותה לאידיאלית מועמדים עבור הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות הרומן משתמש בסמים שלגביו הן רגישות בנפרד. מצאנו כי השילוב של colistin ו minocycline לאנטיביוטיקה מעכב סינתזה של חלבון היה שיעור גבוה מאוד של סינרגיה, אפילו נגד זנים שהיו עמידים לכל אחת מן התרופות הללו בנפרד, יש להניח כי colistin מפעילה את subinhibitory ההשפעה permeabilizing על אפילו colistin חיידקים עמידים. בחרנו שילוב זה להשתמש כדוגמה בעיתון הזה. ראוי לציין, סינרגיה בדיקות יכול לשמש גם כדי להעריך עבור יעילות משופרת של שתי תרופות שהן שתיהן יעיל באופן אינדיבידואלי.

שיטת מערך לוח שחמט אוטומטית מקלה על בדיקה מהירה, תפוקה גבוהה סינרגיה. עם זאת, שיטת מערך לוח שחמט יש מגבלות. כמו assay ששונה מיקרופון, הוא מספק נתונים רק על עיכוב של התפתחות חיידקים ולא על הריגה, אינה מספקת נתונים על השפעות אנטיביוטיות לאורך זמן. לעומת זאת, ידני הביצועים של מבחני זמן-להרוג סינרגיה יותר עמל רב, אך מספק מידע על עיכוב והרג מעל20,21קורס הזמן 24 שעות ביממה. השתמשנו להרוג זמן ניתוח על מספר קטן יותר של מבודד כדי לאשר את התוצאות מערך לוח שחמט שלנו וכדי לקבוע אם הצירופים סינרגטי זיהינו היו גם אחרים.

שתי השיטות סינרגיה לוח שחמט מערך ולהרוג זמן לספק מידע חשוב על הפעילות של שילובים תרופתיים, הם שימושיים במיוחד להערכת פוטנציאל אפשרויות טיפוליות הרומן של פתוגנים חיידקיים עמידים מאוד. השיטות יש גם מגבלות הטבועות. שיטת הדילול מיקרופון רגיל microbroth יש טווח השגיאה הצפוי ידועים 1 כפולה דילול22, אשר הוא גדל כאשר שתי תרופות נבדקים יחד במערך לוח שחמט. ההגדה התקנית של סינרגיה, הרואה את שילוב סינרגטי רק אם הסמים אינם פעילים יחד רבע שלהם בהתאמה מיקרוגרם6, לוקח בחשבון זה צפוי השתנות, אבל כזה השתנות (אשר נחשב כתוצאה מכך משילוב של תנודות ביולוגי, טכני23) נמנע יוצר הנילון לגבי אמינות התוצאות סינרגיה. העדר סטנדרטים בקרת איכות הוקמה לבדיקת סינרגיה הוא גם מגבלה הנוכחי. אולי המגבלה המשמעותי ביותר של כל שיטות בדיקה סינרגיה הוא העדר מתאמים הוקמה בין התוצאות במבחנה ואת התוצאות הקליניות כאשר שילובים משמשים לטיפול בחולים24. סינרגיה פשוטה יותר ומהירה יותר בדיקות בשיטות, כגון לוח שחמט אוטומטיות מערך השיטה המתוארת כאן, עשוי להקל על השילוב של סינרגיה במבחנה בדיקות במסגרת ניסויים קליניים או אחרים הערכות של תוצאות המטופל כדי לאפיין את הקשר בין השפעות במבחנה של ויוו בעתיד.

שיטת מערך אוטומטי לוח שחמט שבה אנו מציגים כאן מציעה אפשרות להקרנה תפוקה גבוהה של מגוון שילובים ומאפשר הערכה מהירה של שילובים "גבוה סיכון גבוהה פרס" יוצא דופן, ללא השקעה גדולה של זמן, משאבים. השיטה להרוג זמן, אשר לאחר מכן נדגים, יכולים לספק מידע תומך נוסף על הפעילות סינרגטי של השילוב, יכול לעזור לאפיון שלה פעילות אחרים, קינטיקה אנטיבקטריאלי.

Protocol

התראה: השתמש נהלי הבטיחות המתאים כאשר עובדים עם חיידקים. ללבוש כפפות, חלוק מעבדה בכל עת. ביצוע עבודת אבטחה ארון אם ייווצר אירוסולים או עבודה עם פתוגנים בסיכון גבוה.

הערה: עשרים עד 24 h לפני תחילת הניסויים, פס החוצה isolate(s) חיידקי להיבדק (מתוך מלאי מטוהרים-המושבה, מינימלית passaged קפוא ב-80 מעלות צלזיוס ב tryptic סויה מרק עם גליצרול 50% מניות) על צלחת אגר דם. דגירה את הצלחת ב 35 מעלות צלזיוס באוויר פתוח.

1. מדפסת הזרקת דיו בסיוע האוטומטי לוח שחמט מערך סינרגיה

  1. להפוך פתרונות מניות מיקרוביאלית (colistin ו minocycline).
    1. לקבוע ריכוז ונעביר מניות מבוסס על מסיסות של אנטיביוטיקה והרצוי ריכוזים האחרון במערך לוח שחמט. להפוך את המניות 10 מ"ג/מ"ל של colistin ו minocycline בדוגמה זו. להשתמש את המסמך CLSI M100 לקביעת ממיסים המתאימה עבור כל אנטיביוטיקה25. שני colistin ו minocycline הם מסיסים במים; כי במדפסת הזרקת דיו D300 דורש התוספת של חומרים פעילי שטח עבור נוזל מימית נכונה, טיפול, לפזר את האנטיביוטיקה במים יונים הנדסה גנטית עם polysorbate 0.3% 20.
    2. שוקל את אבקת לאנטיביוטיקה באמצעות איזון האנליטי, חישוב נפח של הממס הנצרך ריכוז מניות המטרה.
      1. אם האנטיביוטיקה מסופק כמו מלח (למשל colistin סולפט, minocycline הידרוכלוריד) או בצורת hydrated (לדוגמה: meropenem trihydrate), או אם הוא דיווח על ידי היצרן יש פחות מ- 100% טוהר, לבצע חישוב העוצמה26 ל לקבוע את כמות הממס הנדרש.
      2. בצע זו דוגמה של minocycline הידרוכלוריד עם טוהר המוצהרת של 900 מ ג/מ ג:
        Assay טוהר: 900 מ ג/מ ג
        מים תוכן: אף אחד
        שבר פעיל: 0.926 (מתקבל על-ידי חלוקת משקל מולקולרי של minocycline (457.48 Da) על ידי המשקל המולקולרי של minocycline הידרוכלוריד (493.94 Da)).
        עוצמת = (Assay טוהר) * (1 – מים תוכן) * (שבר פעיל)
        = (900 מ ג/מ ג) * (1) * (0.926) = 833.4 mg/mg או 83.34%
        לאחר מכן לקבוע את עוצמת הקול של הממס הנדרשים כמפורט להלן:
        נפח (mL) = [משקל (מ ג) * עוצמה (מ ג/מ ג)] ÷ [ריכוז (mg/mL)]
        אז, לדוגמה, אם 34.7 מ ג של אבקת הידרוכלוריד minocycline מתנהל, השתמש את החישוב שלהלן כדי לקבוע את עוצמת הקול של הממס הנדרשות כדי ליצור פתרון 10 מ"ג/מ"ל:
        נפח = (34.7 מ ג) * (833.4 זg/mg) = mL-2.89
        10,000 מ"ג/מ"ל
    3. שופכים אבקת לאנטיביוטיקה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ולהוסיף את אמצעי האחסון המתאים של מים בתוספת 0.3% polysorbate 20. מערבולת עד התפרקה.
    4. Aliquot מניות ונעביר לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 mL, חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
  2. לבצע בקרת איכות (QC) של מניות מיקרוביאלית לשימוש בניסויים מערך לוח שחמט לפחות יום אחד לפני סינרגיה בדיקות כך ניתן להעריך תוצאות QC לפני השימוש המניה לבדיקת סינרגיה.
    הערה:    QC בטכניקה המתוארת כאן היא זהה הטכניקה אשר ישמש לבדיקת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) בתרופות בודדת יכולה לשמש ככזה עם כל זני מעוניין החוקר.
    1. להכין את ההשעיה חיידקי.
      1. מוציאים מהמקפיא-80 ° C כדי להתחיל להפשיר תוך כדי הכנת ההשעיה חיידקי של aliquot של כל מניה לאנטיביוטיקה. מערבולת הקרת פעם אחת כדי להבטיח כי האנטיביוטיקה בפתרון.
      2. בחר זן QC המתאים ולקבוע טווח מיקרופון מקובל עבור תרופות נבדק המבוסס על הטבלה 5A-1 CLSI M10025. לשימוש בתרופות כאן, e. coli בקרת האוויר 25922; הטווחים מיקרופון לנבג הם 0.25-1 mg/mL עבור minocycline ו- 0.25-2 mg/mL עבור colistin.
      3. בחר טווח של ריכוזים לאנטיביוטיקה כדי לבדוק את זה יכלול את כל הטווח QC. השתמש טווח 0.0156 מ"ג/מ"ל ל 8 מ"ג/מ"ל minocycline ו colistin עבור בקרת האוויר 25922.
      4. להוסיף 1 מ"ל של 0.9% נתרן כלורי 12 מ"מ x 75 מ"מ סביב תרבות התחתון מבחנה. בחר אחת או שתי מושבות צלחת לילה של בקרת האוויר 25922 מערבולת בעדינות כדי להשהות.
      5. בדוק את ריכוז החיידקים שימוש בקורא מקפרלנד. להתאים לפי הצורך על-ידי הוספת עוד 0.9% נתרן כלורי או חיידקים כדי להשיג של עכירות מקפרלנד 0.5 קריאה.
      6. לגרום לדילול 1:300 התליה מקפרלנד 0.5 על-ידי הוספת 100 מ של ההשעיה 30 מ של מנוכים הקטיון מולר-הינטון מרק בשר (CAMHB) 50 מ ל צינור חרוטי להגיע צפיפות תא הסופי של 5 x 105 CFU/mL, כמומלץ על ידי CLSI,27.
      7. באמצעות לולאה לחסן סטרילי, רצף בידוד טיפת inoculum ההתחלתי על צלחת אגר דם כדי לאשר את טוהר inoculum ולאחר דגירה ב 35 מעלות צלזיוס באוויר פתוח.
    2. להוסיף antimicrobials צלחת 384-ובכן שטוח התחתונה, כיכר-. ובכן, ברור, שלא טופלו באמצעות D300. לבצע שלב זה מיד לאחר הכנת ההשעיה חיידקי כך הבולם ניתן להוסיף את לוחיות הרישוי בתוך 15 דקות של הכנה26.
      1. הפעל D300 ראש דיו למדפסת ולמחשב המשויך. פתח את התוכנה.
      2. הפעל קובץ חדש. מעל לתמונה של צלחת רשת, לחץ לחיצה ימנית על צלחת 1 ובחר ערוך צלחת. בחר את סוג צלחות מתאימות (384 טוב) אחסון נוסף (50 מ"ל).
      3. להוסיף נוזלים (קרי, מניות לאנטיביוטיקה) הפרוטוקול על ידי לחיצה על סימן החיבור לצד נוזלים בלוח השמאלי. להוסיף שני נוזלים (colistin ו minocycline).
        1. רחף מעל לוח שהופיעו עבור נוזל 1 ולחץ על העיפרון כדי לערוך. שם הנוזל "Colistin", לשנות את הכיתה כדי "Aqueous + Tween 20 אינץ ', ריכוז עד 10,000, ולשנות לשנות ריכוז היחידות מ"ג/מ"ל (שים לב כי ריכוז מניות הוא 10 מ"ג/מ"ל, קרי, 10,000 מ"ג/מ"ל). נשאיר את y Dispense b ריכוז ולהשאיר את שאר השדות לקביעות ברירת המחדל שלהם. לחץ על אישור.
        2. בצע את ההליך לעיל עבור 2 נוזל (minocycline).
        3. לחץ על הכרטיסיה הפרוטוקול הנוכחי בחלק העליון של המסך ולשנות ריכוז (המוני) mg/mL כדי לקבוע את היחידות ל ריכוזים אנטיביוטי טוב הסופי.
      4. בחר ולס 10 ברשת על-ידי לחיצה וגרירה, ולאחר מכן לחץ על טיטור בחלק העליון של המסך. עבור ציין באמצעות טיטור בחר הריכוז הגבוה ביותר, עבור נוזל לבחור Colistin, עבור הריכוז הגבוה ביותר הזן 8 (לוודא יחידות מ"ג/מ"ל), ועבור הפצה בחר 1:2 (50%). השאר ברירת הערכים במקום למשך שארית החלון ולחץ על אישור.
      5. חזור על ההליך מעל minocycline ליצירת טיטרציה minocycline.
      6. שמור את הפרוטוקול ולאחר מכן לחץ על לחצן ' הפעל ' בפינה השמאלית העליונה.
      7. לחץ על לחצן התחל . לטעון צלחת 384-טוב (עם מכסה הסיר) לתוך לוחית והקש Loaded תחת "טען צלחת 1 – הסינרגיה" בקש.
        הערה: בקשה זו נבחר על ידי התוכנה, אינו מצביע כי סינרגיה בדיקה המבוצעת. מקם קלטת T8 + לתוך החריץ קלטת והקש Loaded תחת עומס קלטת T8 + בקשה.
      8. כאשר תתבקש, להוסיף ונעביר מניות המאגרים המצוין בקלטת. בצע את ההוראות על המסך עבור טעינת הנכונה, לוותר על בקפידה כדי להימנע מהצגת בועות בפתרון. לאחר כל פתרון נוסף, לחץ על לחצן מלא .
      9. ברגע במדפסת הזרקת דיו הוסיפה לאנטיביוטיקה מניות בכמויות המתאימות מכל קידוח, בתיבת הפעלה שהושלמו מופיע, לחץ על סגור, הסר את הלוחית, ולכבות D300.
    3. הוסף המתלים חיידקי צלחת 384-ובכן, דגירה צלחת.
      1. שופכים את המתלים חיידקי בעבר מוכן לתוך מאגר ריאגנט סטרילי.
      2. להשתמש פיפטה רב-ערוצי להוסיף 50 מ של השעיה חיידקי כל בארות המכילות אנטיביוטיקה. להוסיף 50 מ של CAMHB, ללא חיידקים ובכן ריק; . זה יהיה הפקד שלילי ובכן לאשר עקרות של המדיה.
      3. מניחים צלחת חממה הסביבתית 35 ° C, תקופת דגירה של 16-20 h26.
        הערה: משך שונה של דגירה עשוי להידרש. אם אורגניזמים אחרים מאשר Enterobacteriaceae נבדקות; עיין CLSI M10025 לקבלת המלצות ספציפיות האורגניזם.
    4. לקרוא את לוחית הזיהוי קורא microplate-צפיפות אופטית של 600 (OD600) וניתוח תוצאות.
      1. באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני, להצליל תאים עם ערך600 OD של גרין ≥0.07, צמיחה, ורק תאים עם ערך של < 0.07 לאדומה אין צמיחה.
        הערה: ערכים אלה נקבעו על סמך בדיקה ויזואלית של צמיחה לעומת אין וצמיחה של המתאם עם קריאות OD לניסויים אלה; קריאות OD600 מבארות המכיל מדיה לבד היו בעקביות מתחת 0.07. מכנסונים המתאימים עשויים להיות שונים עם צלחת שונים הקוראים וחיידקים.
      2. לקבוע את המיקרופון לכל סם. המיקרופון הוא הריכוז הנמוך ביותר של סמים שבה מעוכבת התפתחות חיידקים. אם המיקרופון נמצא בטווח QC הצפוי על פי מסמך CLSI M10025, הפתרון מניות מתאימה לשימוש.
  3. היכונו ההשעיה חיידקי מערך לוח שחמט.
    1. מוציאים מהמקפיא-80 ° C כדי להתחיל להפשיר תוך כדי הכנת ההשעיה חיידקי של aliquot של כל מניה לאנטיביוטיקה. מערבולת הקרת פעם אחת כדי להבטיח אנטיביוטיקה נמצא פתרון.
    2. להוסיף ~ 1 מ"ל של 0.9% נתרן כלורי 12 מ"מ x 75 מ"מ סביב תרבות התחתון מבחנה. בחר אחת או שתי מושבות צלחת לילה של חיידקים (ב זה במקרה, e. coli זן ה-FDA-ה-CDC 0494) ו מערבולת בעדינות להשעות את אלה 0.9% נתרן כלורי.
    3. בדוק את ריכוז החיידקים שימוש בקורא מקפרלנד. להתאים לפי הצורך על-ידי הוספת עוד 0.9% נתרן כלורי או חיידקים כדי להשיג של עכירות מקפרלנד 0.5 קריאה.
    4. לגרום לדילול 1:300 התליה מקפרלנד 0.5 על-ידי הוספת 100 מ של ההשעיה 30 מ של CAMHB 50 מ ל צינור חרוטי להגיע צפיפות תא הסופי של 5 x 105 CFU/mL27.
  4. להוסיף antimicrobials צלחת 384-ובכן שטוח התחתונה, כיכר-. ובכן, ברור, שלא טופלו באמצעות D300.
    הערה:     לבצע שלב זה מיד לאחר הכנת ההשעיה חיידקי כך ניתן להוסיף הבולם הצלחות תוך 15 דקות של הכנה26.
    1. להפעיל את מדפסת הזרקת דיו, להפעיל קובץ חדש ולהוסיף נוזלים בפרוטוקול כמו צעדים 1.2.2.1-1.2.2.3.
    2. ליצור סינרגיה הרשת.
      1. לחץ על הסמל ' סינרגיה ' בחלק העליון של המסך והמשך דרך השלבים. עבור סוג בחר שניים או יותר נוזלים פאקטור ביחד. על צלחת, זה לא הכרחי כדי לא לכלול כל בארות; לחץ על הבא על שלב זה מבלי לבצע שינויים.
      2. בכרטיסיה טיטור , הזן את ריכוזי לאנטיביוטיקה ואת המיקום.
        1. כדי להוסיף minocycline ומקטין דילולים ההכפלה מ- 32 עד 0.031 מ"ג/מ"ל, בנוסף גם שלילית עם אין אנטיביוטיקה, ציר y , הזן 12 רמות טיטור בלוח השמאלי. ציין באמצעות טיטור, בחר הריכוז הגבוה ביותר; עבור נוזל, בחר Minocycline; הריכוז הגבוה ביותר, הזן 32 (ודא יחידת מוגדר מ"ג/מ"ל; אם זה לא, סגור את תיבת הדו-שיח ' סינרגיה ' ולשנות תחת הלשונית הפרוטוקול הנוכחי ). ודא כי התיבה ערך כוללים 0 מסומנת. שנה הפצה ל- 1:2 (50%).
        2. חזור על שלבים אלה עבור colistin בלוח הימני, באמצעות 12 רמות טיטור הריכוז הגבוה ביותר של 16. לחץ על הבא.
      3. בכרטיסיה פריסה , בחר טיטור רמות של נוזלים 2 לקבוע את מספר השורות והעמודות רשת לפריסה. לחץ על הבא. אם הרשת מופיעה כצפוי, לחץ על סיום.
    3. להציל את הפרוטוקול, ולאחר מכן לחץ על לחצן ' הפעל ' בפינה השמאלית העליונה.
    4. לחץ על לחצן התחל . לטעון צלחת 384-טוב (עם מכסה הסיר) לתוך לוחית והקש Loaded תחת עומס צלחת 1 – סינרגיה בקש. מקם קלטת T8 + לתוך החריץ קלטת והקש Loaded תחת עומס קלטת T8 + בקשה.
    5. כאשר תתבקש, להוסיף ונעביר מניות המאגרים המצוין בקלטת. בצע את ההוראות על המסך עבור טעינת הנכונה, לוותר על בקפידה כדי להימנע מהצגת בועות בפתרון. לאחר כל פתרון נוסף, לחץ על לחצן מלא .
    6. ברגע מנפק D300 הוסיפה לאנטיביוטיקה מניות בכמויות המתאימות מכל קידוח, בתיבת הפעלה שהושלמו מופיע, לחץ על יציאה, הסר את הלוחית, ולכבות D300.
  5. הוסף המתלים חיידקי צלחת 384-ובכן, דגירה צלחת.
    1. שופכים את המתלים חיידקי בעבר מוכן לתוך מאגר ריאגנט סטרילי.
    2. השתמש פיפטה רב-ערוצי להוסיף 50 מ של ההשעיה כל בארות במערך לוח שחמט. להוסיף 50 מ של CAMHB, ללא חיידקים ובכן ריק; . זה יהיה הפקד שלילי ובכן לאשר עקרות של המדיה. דגירה ב חממה הסביבתית 35 ° C עבור h 16-2026.
  6. לקרוא את לוחית הזיהוי קורא microplate-OD600 ולנתח תוצאות מערך לוח שחמט.
    1. ראשית, שימו את הצלחת טוהר, להבטיח כי מושבות המבודד של מורפולוגיה יחיד התואם המורפולוגיה הצפוי של האורגניזם נבדק.
    2. באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני, להצליל תאים כדי לציין גדילה וצמיחה אין כמו שלב 1.2.4.1.
    3. לקבוע את המיקרופון לכל סם. עבור סם לא לעכב את התפתחות חיידקים על הריכוז הגבוה ביותר שנבדקו, נחשב את המיקרופון את סרגל.
    4. במשך כל בה התפתחות מעוכבת, קובעות את הריכוז המעכב החלקי (FIC) עבור כל אנטיביוטיקה המבוססת על מיקרופון והאנטיביוטיקה (ראה איור 1B , 2B איור).
      הערה: FIC הוא היחס בין הריכוז של אנטיביוטיקה בבאר שבו הצמיחה מעוכבת על המיקרופון שלו; אז עבור תרופה עם מיקרופון של 8 מ"ג/מ"ל, טוב המכיל 8 מ"ג למ"ל של התרופה יש FIC 1, ואילו טוב המכיל 4 מ"ג/מ"ל של FIC של 0.5.
    5. לחשב את ערך האינדקס (FICאני) הריכוז המעכב החלקי במשך כל בה הצמיחה מעוכבת כסכום של FICs של כל אחד הסמים בבאר.
    6. לקבוע הנמוך FICאני שבו הצמיחה היא עכבות (מינימום FICאני). אם המינימום FICאני £0.5, לשקול השילוב סינרגטי; אם 0.5-4, לשקול השילוב אדיש; ואם > 4, לשקול השילוב אויבת. אם השילוב סינרגטי-שילובים מסוימים ריכוז אבל אויבת באחרים, הערה תוצאה זו אך שקול השילוב הכולל אויבת.

2. זמן-להרוג סינרגיה בדיקות

  1. להפוך פתרונות מניות מיקרוביאלית. אם שלב זה מבוצע לפני הניסוי, הקפאת מניות ב- 80 ° C עד מוכן לשימוש.
    1. לקבוע ריכוזים ונעביר מניות מבוסס על מסיסות של אנטיביוטיקה והרצוי ריכוזים הסופי בלימודי להרוג זמן. בדוגמה זו, הופך colistin ו minocycline מניות-ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. להשתמש את המסמך CLSI M100 לקביעת ממיסים המתאימה עבור כל אנטיביוטיקה25. להשתמש במים, כמומלץ, הן colistin והן minocycline.
    2. שוקל את אבקת לאנטיביוטיקה באמצעות איזון האנליטי, חישוב נפח של הממס הנצרך ריכוז מניות המטרה. במידת הצורך, לבצע חישוב העוצמה לפני קביעת כמות הממס הנדרשים, כפי שמתואר בשלב מעל 1.1.2.1.
    3. שופכים אבקת לאנטיביוטיקה לתוך 15 מ"ל צינורות חרוט ומוסיפים נפח המים המתאימה. מערבולת עד התפרקה.
  2. באמצעות השיטה microdilution מרק הידני המתואר CLSI M0726, לבצע QC של נוגדי חיידקים מניות לשימוש בזמן להרוג סינרגיה ניסויים. לבצע שלב זה לפחות יום אחד לפני סינרגיה בדיקות כך QC תוצאות ניתן לסקור לפני השימוש המניה.
    1. בחר זן QC המתאים ולקבוע טווח מיקרופון מקובל עבור תרופות נבדק המבוסס על הטבלה 5A-1 CLSI M10025. לשימוש בתרופות כאן, e. coli בקרת האוויר 25922; הטווחים מיקרופון לנבג הם 0.25-1 mg/mL עבור minocycline ו- 0.25-2 mg/mL עבור colistin.
    2. להכין מרק המכיל אנטיביוטיקה צלחות microdilution.
      1. בחר את הריכוז הגבוה ביותר של אנטיביוטיקה להיבדק כך הטווח QC כולו יכול להיות כלול. שימוש במגוון של 0.016 8 מ"ג/מ"ל minocycline ו colistin עבור בקרת האוויר 25922.
      2. לדלל את המניות לאנטיביוטיקה הפתרון עובד ב- CAMHB פעמיים הריכוז הגבוה ביותר הדרוש (כי זה יהיה מדולל 1:1 עם ההשעיה של חיידקים). בדוגמה זו, לדלל שתי מניות של 10 מ"ג/מ"ל 16 מ"ג/מ"ל.
      3. באמצעות פיפטה של רב ערוצית, להוסיף 100 מ של כל אחד של 2 x המתלים לאנטיביוטיקה באר בעמודה הראשונה של צלחת 96-ובכן ברור, סיבוב המדרגה, לא מטופל ולהוסיף 50 מ ל מרק רגיל (כלומר, ללא אנטיביוטיקה) כל טוב של העמודות הבאים.
      4. להסיר 50 מ של אנטיביוטיקה המכילות מרק מכל טוב בעמודה הראשונה ולהוסיף הבארות בעמודה השניה. פיפטה לאורך מספר פעמים כדי לערבב התוכן, הפקת ריכוז לאנטיביוטיקה של חצי של ריכוז בעמודה הראשונה.
      5. חזור על שלב 2.2.2.4 עם כל עמודה, כך סדרת דילולים כפולה טורי, כל אחד עם נפח של 50 מל ', מוכן. שינוי פיפטה טיפים בין שלב לשלב דילול במידת הצורך כדי לשלול את האפשרות של דחויים לאנטיביוטיקה. שימו לב כי ריכוז תוצאות כל עוד 2 x ריכוז סופי, בו הם יופיעו לאחר מכן מדולל 1:1 עם חיידקי ההשעיה.
      6. לא להוסיף שום אנטיביוטיקה בשתי העמודות הסופי, כמו אלו יהיו העמודות שליטה שלילי וצמיחה.
    3. להכין את ההשעיה חיידקי.
      1. להכין השעיה מקפרלנד 0.5 מ צלחת לילה של בקרת האוויר e. coli 25922 ב- 0.9% נתרן כלורי כפי שמתואר שלבים 1.2.1.5-1.2.1.6.
      2. לגרום לדילול 1:150 התליה מקפרלנד 0.5 על-ידי הוספת 50 מ של ההשעיה 7.5 mL של CAMHB.
        הערה: המתלה חיידקי הסופי יהיה מדולל 1:300 רצוי 1:1 עם הפתרון לאנטיביוטיקה, להגיע הצפיפות תא CLSI-מומלץ של 5 x 105 CFU/mL27).
    4. הוספת חיידקים microplate, דגירה.
      1. להוסיף 50 מ של המתלה חיידקי כל טוב, למעט העמודהה 11. 50 מ של CAMHB להוסיף העמודהה 11 (עמודה שליטה שלילי).
      2. דגירה צלחת ב 35 ° C עבור h 16-20.
        הערה: משך שונה של דגירה עשוי להידרש. אם אורגניזמים אחרים מאשר Enterobacteriaceae נבדקות; עיין CLSI M10025 לקבלת המלצות ספציפיות האורגניזם.
      3. לוחית הצמיחה באופן חזותי באמצעות אור המשודרת וקריאה, עבור כל אנטיביוטיקה, לקבוע את הריכוז הנמוך ביותר שבו יש אין צמיחה; זהו המיקרופון. התייעץ עם המסמך CLSI M07 לפרטים נוספים על פרשנות ויזואלית של מיקרופון26. אם המיקרופון נמצא בטווח QC הצפוי, הפתרון מניות מתאימה לשימוש.
  3. התחל התרבות הראשונית.
    1. להפוך של 0.5 מקפרלנד השעיה של אורגניזם מבחן סטרילי 0.9% NaCl כפי שתוארו לעיל.
    2. להוסיף 100 מ של 0.5 ההשעיה מקפרלנד 5 מ של CAMHB בכוס 25 מ מ x 150 מ מ לעגל למטה צינור תרבות עם סגירת פלדת אל-חלד, מערבולת בעדינות כדי לערבב.
    3. באמצעות לולאה לחסן סטרילי, רצף בידוד טיפה של המתלה מדולל על צלחת אגר דם כדי שיאשרו inoculum טוהר דגירה ב 35 מעלות צלזיוס באוויר פתוח.
    4. להחליף את הסגר על הצינור, דגירה במעמד מבחנה על מטרף-35 ° C באוויר פתוח במשך לפחות 3 שעות, עד לוגריתמי-שלב הצמיחה (ראה שלב 2.6.1). המשך לשלב 2.4 בעוד התרבות הוא בחממה.
  4. להכין פתרונות מיקרוביאלית ב 25 מ מ x 150 מ מ צינורות תרבות זכוכית.
    1. להוציא מיקרוביאלית aliquots מניות מ-80 מעלות צלזיוס מקפיא להפשיר. מערבולת הקרת פעם אחת כדי להבטיח אנטיביוטיקה נמצא פתרון.
    2. ואילו התרבות הראשונית היא המקננת, להוסיף 10 מ של CAMHB חמישה צינורות תרבות של בלוק 25 מ מ x 150 מ מ זכוכית ולהוסיף פתרונות מניות מיקרוביאלית כדלקמן.
      הערה: עבור מחקר סינרגיה, סמים אחד לפחות צריך להיות בריכוז שאינה משפיעה על הגידול עקומת בנפרד28; זה יכול להיקבע על-ידי הערכת ההשפעות של ריכוז סמים בודדים לפני המחקר סינרגיה.
      1. צינור 1: להוסיף בכמות הנכונה לאנטיביוטיקה #1 להשגת המטרה הסופית ריכוז לאנטיביוטיקה. במקרה זה, להוסיף 10 מ של 1 מ"ג/מ"ל מניות colistin בריכוז colistin הסופי של 1 מ"ג/מ"ל, כמו זה ריכוז זה אינו יעיל נגד המתח בשימוש בדוגמה זו.
      2. צינור 2: להוסיף בכמות הנכונה לאנטיביוטיקה #2 כדי להשיג ריכוז לאנטיביוטיקה הסופי להיבדק. במקרה זה, להוסיף 10 מ של 1 מ"ג/מ"ל מניות minocycline בריכוז הסופי של 1 מ"ג/מ"ל, ריכוז זה אינו יעיל נגד המתח בשימוש בדוגמה זו.
      3. צינור 3: להוסיף באותה הכמות של אנטיביוטיקה #1 , אנטיביוטיקה #2 בצינורות 1 ו- 2. במקרה זה, להוסיף 10 מ של 1 מ"ג/מ"ל minocycline מניות ו 10 מ של 1 מ"ג/מ"ל colistin מניות.
      4. צינור 4: להוסיף שום אנטיביוטיקה; זה יהיה הצינור בקרת הצמיחה.
      5. צינור 5: להוסיף שום אנטיביוטיקה; זה יהיה הצינור שליטה שלילי.
  5. להכין 96 לוחות פוליפרופילן באר עמוקה עם 2 מ"ל וולס דילולים טורי על-ידי הוספת שורות בלזר עמודים 1-5 עם פיפטה רב-ערוצי µL 900 של סטרילי 0.9% נתרן כלורי.
  6. להכין inoculum ההתחלתי ולהוסיף צינורות.
    1. לאחר התרבות הראשוני הגיע שלב גידול לוגריתמי (~ 3 h עבור pneumoniae קלבסיאלה, האורגניזם השתמשו בדוגמה זו), להסיר את הצינור תרבות מהמכשיר ניעור, מערבולת בעדינות, להעביר ~ 1 מ"ל של השעיה צינור תרבות זכוכית 12 מ מ x 75 מ מ, ו בדוק עם קורא מקפרלנד צפיפות.
      1. אם זה פחות מ 1.0 מקפרלנד, לחזור ברכבת התחתית ניעור, דגירה יותר. אם הוא גדול מ- 1.0 מקפרלנד, להוסיף CAMHB ברכבת התחתית, מערבולת בעדינות, מחדש מדגם, חוזרים על התהליך עד ההשעיה מקפרלנד 1.0.
    2. להוסיף 100 מ של המתלה מקפרלנד 1.0 אל צינורות 1-4 ו מערבולת בעדינות.
  7. לטעום aliquots של כל תרבות ולבצע סדרתי דילולים ten-fold.
    1. בזמן 0 (מיד לאחר הוספת חיידקים הצינורות) ו- 1, 2, 4, 6 ו- 24 שעות ביממה, הסר aliquot 150 מ ל כל שפופרת תרבות בהטיית את הצינור כך רק את הטיפ פיפטה סטרילי מזין את הצינור, לא הפיר pipettor תקיימו במהלך גמילה aliquot. להוסיף aliquots, בהתאמה, בארות רצופים בשורה הראשונה של צלחת עמוקה טוב 96 מוכן בעבר. תשואה צינורות ארון מבחנה על מטרף ב חממה הסביבתית 35 ° C מיד לאחר הסרת aliquots בכל נקודה בזמן.
    2. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להסיר 100 מ ל row A להוסיף שורה B (המכיל 900 מל של 0.9% נתרן כלורי), פיפטה למעלה ולמטה 4 - 5 פעמים כדי לערבב, יצירת 1:10 דילול. לבטל עצות בעקבות כל שלב דילול כדי למנוע דחויים של חיידקים, אשר יכול להוביל ספירות המושבה מוגברות באופן כוזב.
    3. חזור על צעד 2.7.2 שורות B-H עם עצות פיפטה חדשות עבור כל שורה.
  8. צלחת מדולל הדוגמאות עבור ספירות המושבה באמצעות29,30שיטת צלחת טיפה.
    1. תווית מולר-הינטון פלטות אגר עם תנאים לאנטיביוטיקה ואת דילול כדי להיות מצופה.
    2. באמצעות פיפטה רב-ערוצי וטיפים ארוכות במיוחד (כדי להבטיח כי טיפים להגיע לתוך השעיה), להסיר 10 מ"ל מכל קידוח בעמודה אחת, לוותר על בקפידה ברציפות על צלחת שכותרתו כראוי. אם נעשה שימוש צלחות קטנות (100 מ מ קוטר), לוותר על 3 שורות (כל אחד המורכב טיפות משורות A-H של עמודה אחת) לכל צלחת; על צלחות גדולות (150 מ"מ קוטר), לוותר על 8 שורות לכל צלחת.
    3. לאפשר טיפות להתייבש לגמרי (~ 15 דקות).
    4. במקום 24 שעות ביממה, טיפה 10 מ"ל נלקח ישירות מהצינור שליטה שלילי באזור המצוין של אחד הלוחות כדי לבדוק את עקרות. היפוך צלחות, דגירה בין לילה ב 35 מעלות צלזיוס באוויר פתוח.
  9. לספור מושבות ולחשב תא צפיפות. סמן מושבות עם סמן קבוע בסדר-טיפ בצידו האחורי של הלוח כדי להימנע מושבות ספירת כפול או חסרים.
    1. ראשית, שימו את הצלחת טוהר, להבטיח כי מושבות המבודד של מורפולוגיה יחיד התואם המורפולוגיה הצפוי של האורגניזם נבדק.
    2. עבור כל סדרה דילול, לזהות טיפות עם 3-30 מושבות (בדרך כלל טיפה אחת עבור כל סדרה דילול). לספור את המושבות בטיפות אלה והקלטה של הרוזן יחד עם הגורם דילול.
      1. אם אין טיפות בסדרה דילול עם 3-30 מושבות, לספור את המושבות של הטיפה האחרונה עם > 30 מושבות, הירידה הראשונה עם < 3 מושבות (אלה צריך להיות טיפות סמוכים).
    3. עבור כל סדרה דילול, לחשב מספר המושבה יוצרי יחידות למיליליטר (CFU/mL) במדגם מבוסס על מספר מושבות בתיבה הנפתחת באמצעות הנוסחה הבאה: CFU/מ"ל = n(1 /d) (100) כאשר n הוא המספר של המושבות, d הוא הגורם לדילול (1 למדגם מדולל (row A), 0.1 או 10-1 עבור הראשונות 1:10 דילול (שורה B), 0.01 או 10-2 בשביל השני 1:10 דילול (C), שורה, וכן החשבונות 100 מתמדת על העובדה כי הנפח הכולל של הטיפה אני s 10 מ"ל, בעוד הערך הסופי מתבטאת CFU/mL, קרי, CFU/1000 מ. להשתמש בגליון עבודה המכיל נוסחאות שמחשבות CFU/mL מן המושבה count כדי לפשט את התהליך הזה.
      1. עבור סדרת דילול איפה אפשר לספור יותר טיפה אחת (או איפה שתי טיפות להיספר כי אין ירידה נפל בטווח), ממוצע הסעיפים CFU/mL הסופי עבור כל טיפות שנספרו.
      2. כי הגבול התחתון של זיהוי 300 CFU/mL (3 מושבות בתיבה הנפתחת מדולל), הרשומה עלילה המושבה מונה כ £300 CFU/mL עבור סדרת דילול, שבה ישנם < 3 מושבות בתיבה הנפתחת מדולל.
    4. בדוק את הירידה שליטה עקרות מעת 24; אם צמיחה היא נצפתה ירידה זו, יש התוצאות של הניסוי לא להשתמש.
  10. גרף וניתוח תוצאות.
    1. עקומות גדילה של שלוש התרבויות המכילות אנטיביוטיקה והפקד צמיחה בגרף באותו מגרש. מגרש זמן על ציר x ו CFU/mL, באמצעות לוגריתמי, על ציר y .
    2. חישוב ההפרש ב CFU/mL בין הצינור שילוב בזמן 24 סוכן יחיד הפעיל ביותר של הזמן 24. ההבדל הוא ≥2 יומן10, לשקול השילוב סינרגטי. ואז לחשב את הפרש CFU/mL בין הצינור שילוב בזמן 24 והן בזמן 0. אם ההבדל הוא יומן ≥ 310, לשקול השילוב אחרים.

Representative Results

איור 1A מציג רשת של לוח שחמט מערך סינרגיה ניסוי שבו minocycline בריכוזים של 0-32 μg/mL היה בשילוב עם colistin בריכוזים של 0-16 μg/mL, נבחנה נגד e. coli זן ה-FDA-ה-CDC 0494. הערכים מייצגים קריאות spectrophotometric-צפיפות אופטית 600 nm (OD600). וולס עם יתר הערכים600 מתחת 0.07 (אשר מקביל אין התפתחות על-ידי בדיקה ויזואלית) הם אדום מוצל, ואילו וולס עם יתר600 ערכים 0.07 (התואם את הצמיחה על ידי בדיקה חזותית) הם ירוקים מוצל. עבור כל תרופה, הריכוז המעכב המינימלי (מיקרופון; מודגש) הוא הריכוז הנמוך ביותר של סמים זה מעכב התפתחות חיידקים. עבור minocycline, זה 32 μg/mL, עבור colistin, זה 8 μg/mL. ההצללה נשמר באיור 1B, אך הערכים בתוך הבארות שבו הצמיחה מעוכבת מוחלפים בערכים אינדקס (FICאני) הריכוז המעכב החלקי. אלה נקבעים כדלקמן: כל היטב, האינדקס הריכוז המעכב החלקי (FIC) של כל תרופה מחושב על ידי חלוקת הריכוז של אנטיביוטיקה בתוך הבאר הזו על ידי MIC של התרופה ולא FICאני הוא מחושב על ידי סיכום של שני FICs. וולס עם FICאני ערך של 0.5, הנחשב החיתוך עבור סינרגיה, מסומנים על גבול שבור, גם עם הערך הנמוך ביותר FICאני (0.094) הוא מודגש. מכיוון FICאני הערך המינימלי הוא בטווח סינרגטי, נחשב השילוב סינרגטי.

איור 2A ו- 2B איור להציג רשתות מקבילים לאלה איור 1A , איור 1B, אך במקרה זה השילוב לא להפגין סינרגיה נגד בידוד נבדק (ק' pneumoniae המבודד BIDMC 4), כי מינימום FICאני שבה מעוכבת הצמיחה הוא 1, אשר הוא > 0.5.

איור 3 ממחיש את הקריאות צפיפות אופטית מרשת סינרגיה לוח שחמט שבה אירעה כמה בארות שהמערכת דילגה עליהם (Enterobacter cloacae מורכבים המבודד BIDMC 27). המערכת דילגה על בארות הן בארות שבהם מעוכבת התפתחות חיידקים למרות נוכחותם של התפתחות חיידקים בבארות סמוכים עם ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה. תופעה זו, אשר ידוע להתרחש במרחק של בדיקות מיקרופון רגיל כמו גם, הוא ככל הנראה בגלל השתנות הביולוגי במאפיינים התפתחות חיידקים מן שטוב יהיה היטב את מידת הרגישות של אנטיביוטיקה מסוימים להבדלים קטנים inoculum חיידקי23 , 31 , 32. אם יותר מפעם אחת תדלג על טוב ארעו מערך לוח שחמט, אנחנו נמחק את התוצאות וחזר וזמינותו.

איור 4 מציג דוגמאות סינרגיה זמן-להרוג שלושה שילובים נבחנה נגד ק' pneumoniae לבודד BIDMC 32. המושבה ספירות הם הצביעו על מידה לוגריתמי ב- y-ציר ובזמן, תוך שעות, על ה- x-ציר. ההבדל בין inoculum מתחיל בצינור המכילה שילוב התרופות, ריכוז חיידקים בצינור הזה ב 24 שעות מודגם על ידי בר אדום מספר, כאשר ההבדל בין ריכוז חיידקים ב 24 שעות בין הצינור המכיל השילוב של הצינור המכיל את הסוכן אחד הפעילים ביותר לבד מודגם על ידי פס כחול מספר. איור 4A מראה תוצאות משילוב של colistin ו minocycline; שילוב זה היה סינרגטי (ההפרש בין ריכוזים של החיידקים נחשפו שילוב וכדי הפעיל ביותר סוכן ≥2 לבד יומן10 CFU/mL-24 שעות), אחרים (ירידה מהחל inoculum כדי ריכוז 24 h ≥ 3 יומן10 CFU/mL). איור 4B מראה תוצאות מתוך השילוב של colistin ו clindamycin, שילוב סינרגטי אבל היה לא אחרים. שילוב זה עכבות צמיחה של החיידקים, אשר לא סמים עשו לבד, אבל לא הרגתי אותם. איור 4C מראה תוצאות משילוב של colistin ו אריתרומיצין, אשר היה לא אחרים ולא סינרגטי.

Figure 1
איור 1: מערך לוח שחמט תוצאות המפגינים סינרגיה (minocycline + colistin כנגדם e. coli זן ה-FDA-ה-CDC 0494). (א) Spectrophotometric readout וצמיחה פרשנות של מערך לוח שחמט. הערכים בתאים הם לפי הקריאה צפיפות אופטית של 600 nm (OD600). תאים עם יתר הערכים600 מתחת 0.07 (תואם לאין התפתחות על-ידי בדיקה ויזואלית) הם אדום מוצל, ואילו תאים המכילים ערכים600 OD 0.07 (תואם לצמיחה על ידי בדיקה חזותית) הם ירוקים מוצל. חישוב מדד (FICאני) (B) הריכוז המעכב החלקי. הצללה המציין הצמיחה או אין התפתחות סודרו. הערכים עבור colistin ו minocycline לאורך x- ו - y-צירים, בהתאמה, עכשיו לייצג הריכוז המעכב החלקי (FIC), או היחס בין ריכוז התרופה באותה עמודה או שורה (הריכוז המעכב המינימלי MIC) של התרופה לבד. הערך בכל תא FICאני, או סכום FICs של השני סמים בתוך הבאר הזו. תיבת גדול גובלת קו שבור יקיף וולס עם FICאני של 0.5. התא הגובלת עבה מציין הבאר את הנמוך FICאני שבה מעוכבת גדילה, או את המינימום FICאני. מכיוון המינימום FICאני 0.5, נחשב השילוב סינרגטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: לוח שחמט תוצאות מערך של שילוב זה לא להוכיח סינרגיה (minocycline + colistin כנגדם ק' pneumoniae לבודד BIDMC 4). (א) אופטי ערכי דחיסות-פרשנות 600 nm וצמיחה של לוח שחמט מערך תוצאות כמתואר באיור 1 א'. (B) חישוב של אינדקס (FICאני) הריכוז המעכב החלקי כמתואר באיור 1 א'. כי המינימום FICאני > 0.5, השילוב אינו נחשב סינרגטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: לוח שחמט מערך תוצאות שאינן uninterpretable בשל דילג וולס (minocycline + colistin כנגדם Enterobacter cloacae מורכבים לבודד BIDMC 27). ערכי צפיפות אופטית 600 nm וצמיחה פרשנות של תוצאות מערך לוח שחמט כמתואר באיור 1 א'. כמה בארות שהמערכת דילגה עליהם, שבו מעוכבת התפתחות חיידקים למרות נוכחותם של צמיחה בבארות סמוכים עם ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה, הם הפגינו. התוצאות אינן interpretable, ואת הניסוי צריך להיות חוזרות ונשנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: זמן-להרוג סינרגיה תוצאות של שלושה שילובים נבחנה נגד ק' pneumoniae ולבודד BIDMC 32. ספירות המושבה הם הצביעו על מידה לוגריתמי ב- y-ציר ובזמן, תוך שעות, על ה- x-ציר. ההבדל בין ריכוז חיידקים בשילוב ב 24 שעות של inoculum מתחיל בצינור מודגם על ידי בר אדום מספר. אם הירידה הפעלה inoculum כדי ריכוז ב 24 שעות של יומן ≥ 310 CFU/mL, השילוב הוא נחשב אחרים. ההבדל בין ריכוז חיידקים ב 24 שעות בין הצינור המכיל השילוב הצינור המכיל את הסוכן אחד הפעילים ביותר לבד מודגם על ידי פס כחול מספר; אם יש ≥2 יומן10 הפחתת CFU/mL, נחשב השילוב סינרגטי. (א) Colistin (CST) + minocycline (דקות), שילוב סינרגטי וגם אחרים. Colistin (B) + clindamycin (CLI), שילוב סינרגטי, אבל אחרים לא. Colistin (ג) + אריתרומיצין (ערבויות), שילוב זה לא סינרגטי ולא אחרים. תוצאות אלו פורסמו בתחילה כחלק ממחקר של פעילות סינרגטיים המכילות colistin שילובים נגד colistin עמידים Enterobacteriaceae, שבו הפגנו colistin הזה היה סינרגטי עם מספר אנטיביוטיקה הפעילים בנפרד בלבד (למשל. clindamycin) או בעיקר (למשל אריתרומיצין) נגד חיידקים גראם חיוביים16. (שים לב כי אריתרומיצין סינרגטי על ידי מערך לוח שחמט נגד המתח המוצג, אך לא על ידי זמן-להרוג, אז זה נבחר כאן כדוגמה של שילוב שאינו סינרגטי.) שיערנו כי colistin, אשר ידוע לפעול על-ידי permeabilization של הממברנה החיצונית גראם שליליים, מפעילה השפעה permeabilizing משנה המעכבת על חיידקים גראם שליליים עמידים colistin, המאפשר כניסה של תרופות כגון clindamycin זה בדרך כלל אין אפשרות להיכנס לתא גראם שליליים. פאנל (א) של דמות זו שונתה מ ברנן-קרון, Pironti ו- 2018 קירבי16, זכויות יוצרים © האמריקאי האגודה למיקרוביולוגיה, סוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה, 62(10), 2018, pii: e00873-18, דוי: 10.1128/AAC.00873-18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

שתי השיטות המתוארות כאן שני מספקים מידע אודות הפעילות של antimicrobials בשילוב בהשוואה פעילותם בודדים. הדיגיטלי באמצעות מדפסת הזרקת דיו אוטומטיות dispensing השיטה היא התאקלמות של השיטה המתוארת ב מדריך נהלים מיקרוביולוגיה קלינית33, בעוד השיטה זמן-להרוג מקרוב יותר עוקב אחר הפרוטוקול המתאים מאותו התייחסות34.

ב שיטת מערך לוח שחמט, חישובים כדי לקבוע את אמצעי האחסון הדרושים של מניות מיקרוביאלית כדי להוסיף מכל קידוח כמו גם מחלק של אמצעי אחסון אלה היא אוטומטית, וכך למנוע כמה מקורות פוטנציאליים העיקריים של שגיאה שאירעה במדריך למשתמש מערך לוח שחמט. זה עדיין חיוני, עם זאת, כי החוקר קובע כי מניות המקורי נעשים הריכוז המיועד, כי המטרה הסופית ריכוזים. מוזנים לתוך התוכנה D300 כהלכה. הוספת ההשעיה מיקרוביאלית כדי בארות בצלחת 384-טוב עשויה להיות מאתגרת בהתחלה ודורש טיפול כדי לוודא כי פיפטה טיפים הזן את הבארות המתאים ומעלה הנוזל הזה לא להתיז את הקצוות של הבארות מטפל נוזלי אוטומטי יכול לשמש במקום פיפטה רב-ערוצי ידניים כדי להגדיל את המהירות והדיוק שבה ההשעיה חיידקי מתווסף בארות. כמפורט בפרוטוקול, D300 דורש התוספת של חומרים פעילי שטח, polysorbate 20 (P-20), עבור טיפול בנוזלים נאותה. חומרים פעילי שטח שונים, polysorbate 80-ריכוז של 0.002%, נרשמה להורדת colistin מיקרוגרם עבור אורגניזמים עם colistin מיקרוגרם של < µg/mL 2 במבחני microdilution מרק רגיל. 35 , 36 המעבדה שלנו בעבר הראו כי P-20 בריכוזים עד 0.0015% לא השפיע על תוצאות מיקרופון בסיוע D300 בהשוואה הפניה BMD14. בדוגמה assay המובאת כאן, P-20 המרבי הוא ריכוז הוא 0.0014%.

בעיה אחת נתקלנו עם כמה מבחני מערך של לוח שחמט היה מספר רב של בארות שהמערכת דילגה עליהם. זה התרחש בקצב בלתי מידתית עם אנטיביוטיקה מסוימים. באופן ספציפי, על מסך של שילובים נגד אוסף של קרבפנם עמידים Enterobacteriaceae, מצאנו כי בעוד 49 של ניסויים 521 (9.4%) היו שמיש עקב מספר בארות שהמערכת דילגה עליהם, 2 12 אנטיביוטיקה נבדק (fosfomycin ו- cefepime) היוו 46 של ניסויים אלה (94%). לעלייה בשיעור כזה עשוי להיות סביר יותר סמים כי הם רגישים במיוחד ל32,3731,השפעה inoculum. ראוי לציין, CLSI אינה ממליצה על בדיקות fosfomycin מרק דילול25 עקב חששות לגבי האמינות של תוצאות באמצעות שיטה זו, אשר עשוי להסביר את התוצאות לא אמין עם תרופה זו. ניתן לבצע מספר שינויים לשיטה לוח שחמט אוטומטית בהתאם להעדפות החוקר. Antimicrobials יכול ובשמפו לוחות כבר המכיל חיידקי ההשעיה, ולא לתוך בארות ריק, אם זה עדיף מטעמים של זרימת העבודה בתוך המעבדה. בעוד 384-ובכן צלחות שימשו כאן, השיטה יכול גם להתבצע ב 96-ובכן צלחת מבחני בשינוי המתאים נפח טוב. השימוש של תבנית 96-ובכן צלחת עשויה לסייע בבארות שהמערכת דילגה עליהם תוך צמצום של אנטיביוטיקה רגישים במיוחד לשינויים קטנים ב- inoculum. בעת חישוב FICאני, ייתכנו מצבים המיקרופון איפה את סרגל (כלומר, מעל כל נבדק), כולל מצבים שבו התרופה הנבדקת יש אין כל פעילות בנפרד נגד הסוג של אורגניזם הנבדקת. במקרים אלה, FIC יכול להיות מחושב בהתבסס על בהנחה שהמיקרופון הוא גבוה יותר מאשר הריכוז הגבוה ביותר נבדק אחד דילול. זוהי האסטרטגיה הכי שמרנית, ההנחה היא ערך מקסימלי FIC אפשרי עבור כל דילול איפה עיכוב הוא ציין במהלך הבדיקה סינרגיה. לדוגמה, אם המיקרופון בפועל היו במקום שני ההכפלה דילולים לעיל הריכוז הגבוה ביותר נבדק, ואז FICs המתאים יהיה כפולה נמוך יותר הקצאות השמרני, וכן הלאה.

כדי להעריך באופן מדויק את פעילות אחרים של תרופות וזמינותו הזמן-להרוג, זה חיוני כי תרבויות להיות בצמיחה לוגריתמי-פאזי, במיוחד כאשר דופן התא הפעיל אנטיביוטיקה מתבצעת שנבדקו28. על החיידקים במהירות גוברת להשתמש בדוגמה זו (ק' pneumoniae), 3 שעות של דגירה ברעידות היה המתאים להגיע בשלב זה צמיחה, אבל כמויות שונות של זמן עשוי להיות נחוץ עבור אורגניזמים שונים. באופן כללי, התרבות צריכה להופיע בעליל אבל לא כבדה עכורים. משך הזמן המתאים יכול להיקבע על ידי בניית עקומת גדילה עם ספירות המושבה שצולמו זמן טורי נקודות (למשל, כל 30 דקות במשך 4-6 h)38. חשוב גם inoculum ההתחלתי המיועד במחקר להרוג זמן. הריכוז היעד של inoculum ההתחלה הוא כ 5 x 105 עונה 1 פרק 106 CFU/mL. דילול המתוארים כאן (100 μL של השעיה מקפרלנד 1.0 ב 10 מ"ל של מדיה) יוצר את inoculum הזה pneumoniae קלבסיאלה , מינים אחרים Enterobacteriaceae , שבו בדקנו אותו. אם הצפיפות של inocula המוצא בניסוי באמצעות אורגניזמים שונים באופן משמעותי גבוה יותר או נמוך יותר, ואז לדילול שונה עשוי להיות נחוץ. (דילול המתאימות הדרושות עבור זן נתון יכול להיקבע על ידי ביצוע ספירת צלחת של השעיה מקפרלנד 0.5 או 1.0 כדי לקבוע כמה אורגניזמים עכירות הזה מייצג, ואז לחשב את הסכום שלפיו ההשעיה הראשוני חייב להיות מדולל להגיע הריכוז הסופי המתאים). אם, על סקירה של צלחת ספירת מן המחקר סינרגיה, נמצא את inoculum המוצא של כל אחד הצינורות המכילים אנטיביוטיקה היה נמוך באופן משמעותי inoculum ההתחלתי של הפקד צמיחה, הדבר עשוי להעיד על דחויים או לאנטיביוטיקה או מאוד הריגה מהירה של חיידקים בזמן קצר בין תוספת של חיידקים כדי הצינור המכיל אנטיביוטיקה הסרת aliquot עבור ציפוי. אם המספר הממשי של מושבות בתיבה הנפתחת מדולל בסדרה הוא נמוך ממספר מושבות דילולים עוקבות, הדבר מצביע על אפקט אנטיביוטי דחויים. אפשרויות שונות תוארו למניעת את האפקט הזה, כולל שמתפשטת aliquot יחיד הצלחת38 או ספינינג לדגימה, הסרת את תגובת שיקוע של השעיית מחדש בתוך תמיסת מלח סטרילית לפני ציפוי39. נקודת הזמן השיטה להרוג זמן, חשוב גם עבור החוקר ביעילות אך במדויק להסיר aliquot של כל שפופרת תרבות ולבצע דילולים טורי. עיכובים במהלך תהליך זה, במיוחד במהלך המוקדמות עת נקודות המתרחשים ברצף קרובים, יכול להוביל תקופות ממושכות שבמהלכו תרבויות אינן מתפשט, מזועזע, ואילו dispensing רשלני, טורי דילולים יכול להוביל צלחת לא מדויק סופרת. לעומת השיטה צלחת כפולה של הצלחת לספור, שבה 100 μL של כל דילול משתרע על פני צלחת אגר כולו, שיטת צלחת ירידה המתוארת היא הרבה יותר מהירה, דורש מספר קטן יותר של פלטות אגר, ומאפשר עבור ספירה מהירה יותר, כמספר המרבי אפשר לספור מספר מושבות עבור כל טיפה היא 30, בעוד בדרך כלל ניתן לספור עד 300 מושבות מצלחת כפולה. עם זאת, שיטת צלחת כפולה זאת גם אופציה אם החוקרים נמצאים יותר נוח עם טכניקה זו. אם טיפות התפשט לתוך השני לאחר ומקבלים פיפטה רב-ערוצי, ניתן לבצע במקום יישומים בודדים של טיפות יותר כמרווחים עם פיפטה ערוץ אחד. מניסיוננו, קירור צלחות ב 4 ° C לפני dispensing טיפות דומה כדי לצמצם את התפשטות מוגזמת.

מגבלה אחת אחת מהטכניקות שתוארו כאן היא כי התוצאות של שני סוגי assay סינרגיה (מערך לוח שחמט, זמן-kill) אינם תמיד concordant, מאחר ביותר מאמרים סינרגיה משתמשות שיטה אחת או אחרת במקום שניהם ביחד, זה יכול יהיה קשה לדעת איך לשלב נתונים שני סוגים של מבחני. כי השיטה מערך אוטומטי לוח שחמט שפיתחנו היא פשוטה תפוקה גבוהה, השתמשנו בו בתוקף כסוג של המסך כדי לבדוק שילובים נגד מספר גדול יותר של מבודד וכדי לקבוע אילו שילובים הריכוז היו סינרגטי. ואז אנחנו לבצע מספר קטן יותר של הזמן-להרוג מחקרים, בחירת שילובים וריכוזי שהיה יעיל של מערך לוח שחמט. ראוי לציין, כי וזמינותו לוח שחמט מבוצעת בדרך כלל בקנה מידה דילול microbroth, בעוד assay זמן-להרוג משתמשת אחסון גדולים יותר (בדומה לדילול macrobroth), מצאנו כי FICs היו שונים בין שתי השיטות, לפעמים עם גבוה יותר ריכוזי נדרש בדרך כלל ב וזמינותו להרוג זמן להפגין פעילות. תופעה זו נרשמה בעבר כאשר macrobroth ו- microbroth של תוצאות וזמינותו של דילול מיקרופון מושווים עבור החיידקים גראם שליליים26 ומתי inocula גדולים (כמו שימוש במחקרים זמן-kill) לעומת את inoculum רגיל בשימוש מבחני מערך דילול, לוח שחמט microbroth32. מגבלה ספציפית של המערך לוח שחמט הוא ההשתנות הגלום ב microbroth דילול מיקרופון בדיקות22. בזמן FICאני המכנסונים של סינרגיה חשבון עבור ההשתנות מתמטית6 כאלה השתנות בלתי נמנע מעלה חשש הנאמנות ועקביות של לוח שחמט מערך תוצאות.

בגלל המגבלות הטבועות סינרגיה כל גופית בדיקות בשיטות (כולל טיפוח החיידקים של מדיום הגידול מלאכותי, בריכוזים אנטיביוטי סטטי ו קורס לזמן מוגבל), וחייבות להיות מאושרות התוצאות המתקבלות על ידי שיטות אלה, בהמשך הערכה באמצעות טכניקות משלימה. שיטות כאלה כוללים מחקרים במבחנה פרמוקוקינטיים/pharmacodynamic (PK/PD) (למשל, סיב חלול זיהום דגם40), מודלים, ו, בסופו של דבר, בבני PK/PD והיעילות. שיטת מערך אוטומטי לוח שחמט המתוארים כאן, על-ידי מתן שיטה מהירה שבה המסך שילובים לפעילות פוטנציאל סינרגטי, מאפשרת יותר ממוקד ניצול של טכניקות אלה. עוד יותר אוטומציה של כל השיטות האלה, כמו חקירה שיטתית כמו טוב יותר של הקשר בין פרמטרים במבחנה התוצאות הקליניות, יהיה חשוב ב קנה מידה למעלה את השימוש סינרגיה בדיקות והגברת את תחולתן קליניים.

Disclosures

מתקן דיגיטלי D300 חומרים מתכלים המשויך נמסרו בידי Tecan (Morrisville, NC). Tecan היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף/פרשנות הנתונים, הכנת כתב היד או ההחלטה לפרסם.

Acknowledgments

תיאה ברנן-קרון נתמכה על ידי יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי הילד לבריאות ומחקר בהתפתחות מחלות זיהומיות בילדים הכשרה גרנט (T32HD055148), המכון הלאומי לאלרגיה, מחלות זיהומיות (מענק הכשרה T32AI007061), מלגת החולים למשרד של הפקולטה פיתוח סגל פיתוח קריירה לילדים בבוסטון, ופרס של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות הקריירה פיתוח (1K08AI132716). J.E.K. נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס R33 AI119114. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management. Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).
  2. Spellberg, B. The future of antibiotics. Critical Care. 18 (3), (2014).
  3. Spellberg, B., et al. The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).
  4. Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).
  5. Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).
  6. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).
  7. Zusman, O., et al. Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).
  8. Clock, S. A., et al. In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).
  9. Hirsch, E. B., et al. Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae. Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).
  10. Tängdén, T., et al. Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).
  11. Tascini, C., et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).
  12. Paul, M., et al. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).
  13. Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).
  14. Smith, K. P., Kirby, J. E. Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).
  15. Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology. J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).
  16. Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  17. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).
  18. Nation, R. L., Li, J. Colistin in the 21st century. Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).
  19. Ah, Y. -M., Kim, A. -J., Lee, J. -Y. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).
  20. Bratu, S., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).
  21. Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).
  22. MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing. Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).
  23. Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance. Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).
  24. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  25. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  26. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).
  27. Clinical and Laboratory Standards Institute. M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  28. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 7 (1999).
  29. Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests. Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).
  30. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  31. Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology. Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).
  32. Smith, K. P., Kirby, J. E. The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  33. Leber, A. L. Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.16.1-5.16.23 (2016).
  34. Leber, A. L. Time-Kill Assay for Determining Synergy. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.14.3.1-5.14.3.6 (2016).
  35. Hindler, J. A., Humphries, R. M. Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).
  36. Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls. Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).
  37. Fuchs, P. C., Barry, aL., Brown, S. D. Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine. European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).
  38. Leber, A. L. Minimum Bactericidal Concentration Testing. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , 5.14.1.11 (2016).
  39. Cai, Y., et al. In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).
  40. Bulman, Z. P., et al. Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era. mBio. 8 (4), (2017).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 146 מיקרוביאלית סינרגיה אנטיביוטי סינרגיה סינרגיה עמידות מיקרוביאלית התנגדות colistin Enterobacteriaceae קרבפנם עמידים זמן-להרוג סינרגיה מערך לוח שחמט אוטומציה מדפסת הזרקת דיו
סינרגיה מיקרוביאלית בדיקות על ידי באמצעות מדפסת הזרקת דיו לוח שחמט אוטומטיות מערך ושיטת להרוג זמן ידנית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E.… More

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter