Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Антимикробной Синергия испытаний струйный принтер с помощью автоматизированных клетчатый массив и ручной метод время kill

Published: April 18, 2019 doi: 10.3791/58636
Automatic Translation
1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Тестирования антимикробной взаимодействия используется для оценки эффекта два или больше антибиотиков, используемых в комбинации и обычно выполняется одним из двух способов: Шахматная доска массив или время убить assay. Здесь мы представляем автоматизированной, струйный принтер помощь клетчатый массив синергии технику и классические время убить синергизма исследования.

Abstract

Как ставки возбудителей с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) продолжают расти, опережает развитие новых противомикробных препаратов, новые подходы к лечению МЛУ бактерий становится необходимостью. Один из таких подходов является комбинированной терапии, в которой два или более антибиотики используются вместе для лечения инфекции, против которого один или оба из препаратов могут оказаться неэффективными одиночку. Когда два препарата, в сочетании, оказывают более чем аддитивный эффект, они считаются синергизма. In vitro исследования синергизма деятельности является важным первым шагом в оценке возможных эффективность комбинации препаратов. Были разработаны два основных в пробирке синергии методы тестирования: массив шахматной доски и убить время исследования. В этой статье, мы представляем метод массива автоматизированных шахматной доски, который использует технологию струйной печати увеличить эффективность и точность этой техники, а также метод Стандартный ручной время убить синергии. Автоматизированный клетчатый массив может служить пробирного высокопроизводительного скрининга, в то время как ручной исследование времени убить предоставляет дополнительные, дополнительные данные о синергетический активности и убийства.

Шахматная доска массив является модификацией стандартной минимальной концентрации тормозной (MIC) тестирование, в котором бактерии инкубировали с антибиотиками в концентрации различных комбинаций и оценены для ингибирования роста после ночи инкубации. Ручной производительность массива шахматной доски требует кропотливого и подверженных ошибкам серии расчетов и разведения. В методе автоматизированных представлены здесь, расчет и дозирования требуемый антибиотик запасов решение, которое томов автоматизированы с помощью струйного принтера технологии. В assay время убить синергии бактерии инкубировали с антибиотиками интерес, как вместе, так и индивидуально и отведать интервалами в течение 24 ч для количественных культуры. Результаты можно определить ли сочетание синергических и является ли это бактерицидными и представить данные о торможении и уничтожение бактерий с течением времени.

Introduction

Распространение с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) бактериальных патогенов, особенно МЛУ грамотрицательных бактерий как carbapenem устойчивостью Enterobacteriaceae (КРР), оставил клиницисты все более ограниченные возможности для успешного антибактериальные терапия 1, проблема усугубляется медленными темпами Роман антибактериальным препаратом открытие2,3. Антимикробной синергии, в котором два препарата, используемые в сочетании оказывают эффект больше, чем добавка, предлагает возможность спасения существующие антибиотики для использования в лечения МЛУ бактерий, даже когда эти бактерии устойчивы к одной или обеих антибиотики индивидуально. Методы, описанные в настоящем документе предоставляют два взаимодополняющих методов экстракорпорального синергии, тестирование, что, когда используются вместе, позволяют следователям эффективно экран антимикробных комбинаций интереса для доказательства синергизма деятельности (автоматизированная клетчатый метод массива) и затем для дальнейшей оценки Кинетика ингибирования и убийства, продемонстрировал многообещающие комбинации, выявленных на стадии отбора (ручной метод время kill).

Один из наиболее часто используемых методов тестирования в лабораторных условиях синергизма является шахматным массив assay, модификация испытаний минимальная концентрация тормозной (MIC) в котором изолировать ингибиторная активность двух различных антибиотиков против бактериальных тестируются в диапазоне концентрации комбинации4,5. Если два препараты оказывают более чем добавка активность, когда используются вместе, комбинация считается синергетический6. Однако Настройка массива клетчатый вручную включает серию вычислений и разбавления и дозирования шаги, которые уязвимы для человеческой ошибки и трудоемким. Эти ограничения имели эффект ограничения использования синергии, тестирование прежде всего к ретроспективной оценки небольшого числа антибиотиков комбинаций и бактериальных изолятов, и результаты не всегда были последовательными среди исследований7, 8,9,10,11. Кроме того сложность взаимодействия тестирования способствует его отсутствия в лаборатории клинической микробиологии и практически полное отсутствие в пробирке синергии проверочных данных клинических исследований сочетание терапии12, 13.

В целях повышения эффективности и пропускную способность метода массив шахматной доски, мы сделали использовать автоматизированные методики тестирования MIC ранее разработанных в нашей лаборатории, которая использует технологии струйной печати для точно и последовательно отказаться от небольших объемов антибиотик запасов раствора в скважины в микротитровальных пластины14. Платформа устраняет необходимость для сложных вычислений и дозирования несколько шагов. Соответствующее программное обеспечение вычисляет и распределяет соответствующие объемы антибиотиков для создания двумерных клетчатый массива, если пользователь просто вводит диапазон желаемых концентраций и Стоковый раствор концентрации антибиотиков. Мы изначально проверили этот метод к коллекции CRE изолятов15 и впоследствии были сосредоточены на тестирование колистина содержащих комбинаций для деятельности с колистина устойчивостью изолятов16. Колистин является препарат последней инстанции, как правило, зарезервированы для использования в лечении МЛУ грамотрицательных патогенов17,18и колистину сопротивления преобразоватям уже МЛУ бактерий почти Пан стойкие19, что делает их идеальными кандидаты для развития новых терапевтических стратегий с использованием наркотиков, к которым они нечувствительны к индивидуально. Мы обнаружили, что сочетание колистина и антибиотик миноциклин ингибитор синтеза белка очень высокий уровень взаимодействия, даже против штаммов, которые были устойчивы к каждому из этих препаратов индивидуально, предположительно, потому что колистина оказывает subinhibitory permeabilizing эффект на даже колистина резистентных бактерий. Мы выбрали эту комбинацию, чтобы использовать в качестве примера в этой статье. Следует отметить тестирование взаимодействия может также использоваться для оценки для повышения эффективности двух препаратов, которые оба эффективные индивидуально.

Метод массива автоматизированных клетчатый способствует быстрой и высок объём синергии тестирования. Однако метод массива шахматной доски имеют ограничения. Изменение пробирного MIC он предоставляет данные только на ингибирование роста бактерий и не убийство, а он не предоставляет данные по воздействию антибиотиков со временем. Напротив ручной производительность времени убить синергии анализов является более трудоемким, но предоставляет информацию о торможении и убийства за 24 ч время курс20,21. Мы использовали время убить анализа на меньшее количество изолятов для подтверждения нашей шахматной массив результатов и определить, являются ли синергетических комбинаций, которые мы определили также бактерицидное.

Оба клетчатый массив и время убить синергии методы предоставляют ценную информацию о деятельности комбинации препаратов и особенно полезны в оценке потенциальных роман терапевтических вариантов высокой устойчивостью бактериальных патогенов. Методы также имеют внутренние ограничения. Метод разбавления MIC Стандартный microbroth имеет ряд известных ожидаемые ошибки 1 два раза разрежения22, которая увеличивается, когда два препараты тестируются вместе в массиве шахматной доски. Стандартное определение синергии, которая считает, что сочетание синергетический только если препараты действуют вместе в одной четверти их соответствующих ОПГВ6, учитывает это ожидалось изменчивости, но такой изменчивости (который, как полагают, в результате от комбинации биологических и технических колебаний23) неизбежно генерирует неуверенно о надежности результатов синергии. Отсутствие установленных стандартов контроля качества для тестирования взаимодействия также является ограничение тока. Возможно наиболее существенное ограничение всех методов тестирования взаимодействия является отсутствие установленной корреляции между результаты in vitro и клинических исходов при комбинации используются для лечения пациентов24. Проще и более быстрого взаимодействия тестирования методов, например метод массива автоматизированных шахматной доски, описанных здесь, может способствовать интеграции в пробирке синергии, тестирование в рамках клинических испытаний или других оценок исходы для того, чтобы лучше характеризовать отношения между в vitro и in vivo последствия в будущем.

Автоматизированный клетчатый массива метод, который мы представляем здесь предлагает вариант для высокопроизводительного скрининга различных комбинаций и позволяет для быстрой оценки комбинаций необычных, «высокого риска высокая награда» без крупных инвестиций времени и ресурсы. Время убить метод, который мы впоследствии доказать, может обеспечить дополнительную вспомогательную информацию о синергических деятельности комбинации и может помочь, характеризовать его бактерицидная активность и антибактериальные кинетики.

Protocol

ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Используйте процедуры безопасности при работе с бактериями. Надевайте перчатки и лаборатории пальто на все времена. Выполняет работу в области биобезопасности, кабинета министров, если будут создаваться аэрозоли или с высоким риском патогенов.

Примечание: Двадцать до 24 ч до начала экспериментов, полоска, бактериальный isolate(s) тестируемых (из колонии очищенный, минимально пассированный запасов, заморожены на-80 ° C в tryptic соевый бульон с глицерина 50% акций) на пластину крови агар. Инкубируйте пластину на 35 ° C в атмосферном воздухе.

1. при содействии струйный принтер автоматизированных клетчатый массив Синергия

  1. Сделайте антимикробной акций решения (колистина и миноциклин).
    1. Определите Антибиотик раствор концентрации основаны на растворимость антибиотиков и желаемого окончательный концентрации в массиве шахматной доски. Сделайте 10 мг/мл запасы колистина и миноциклин для этого примера. Использование CLSI М100 документа, чтобы определить соответствующие растворители для каждого антибиотик25. Колистин и миноциклин растворимы; потому что D300 струйный принтер требует добавления ПАВ для надлежащего водный жидкими средами, Растворите антибиотиков в сверхчистого деионизированную воду с 0,3% Полисорбат 20.
    2. Весят вне антибиотик порошок, используя аналитический баланс и вычислить объем растворителя, необходимых для получения запасов концентрация цели.
      1. Если антибиотик поставляется как соль (например, колистина сульфат, миноциклин гидрохлорид) или в виде гидратированных (например меропенем тригидрат), или если он сообщает производителя иметь меньше чем 100% чистоты, выполняют расчет потенции26 - Определите количество растворителя требуется.
      2. Следуйте этому примеру миноциклин гидрохлорида с заявленной чистотой 900 мг/мг:
        Assay чистоты: 900 мг/мг
        Содержание воды: нет
        Активная фракция: 0,926 (полученные путем деления молекулярная масса миноциклин (457.48 Da), молекулярная масса миноциклин гидрохлорид (493.94 Da)).
        Потенция = (Assay чистоты) * (1-содержание воды) * (активная фракция)
        = (900 мг/мг) * (1) * (0,926) = 833.4 мг/мг или 83.34%
        Затем определите объем растворителя требуется следующее:
        Объем (мл) = [вес (мг) * потенции (мг/мг)] ÷ [концентрация (мг/мл)]
        Так например, если отвесил 34.7 мг порошка миноциклин гидрохлорид, используйте следующий расчет для определения объема растворителя, необходимых для решения 10 мг/мл:
        Объем = (34.7 мг) * (833.4 мг/мг) = 2,89 мл
        10000 мг/мл
    3. Налить антибиотик порошок в 15 мл Конические трубки и добавить соответствующий объем воды плюс 0,3% Полисорбат 20. Вихрь до растворения.
    4. Аликвота Антибиотик раствор в 0,5 мл microcentrifuge трубы и хранить при температуре-80 ° C до готовности для использования.
  2. Выполнение контроля качества (КК) антимикробной запасов для использования в шахматном массив эксперименты по крайней мере за один день до взаимодействия тестирования, так что QC результаты можно оценить перед использованием запасов для тестирования взаимодействия.
    ПРИМЕЧАНИЕ:    КК метод, описанный здесь идентична технику, которая будет использоваться для минимальной ингибирующее концентрации (MIC) тестирования отдельных препаратов и может использоваться как таковой с любого штаммов интерес к следователю.
    1. Подготовьте бактериальных подвеска.
      1. Возьмите Алиготе каждый антибиотик акций из морозильник-80 ° C, чтобы начать размораживание при подготовке бактериальных подвеска. Вихрь после размораживания для обеспечения того, чтобы антибиотик в растворе.
      2. Выберите соответствующий штамм КК и определить допустимый диапазон MIC для наркотиков проходит проверку на основе таблицы 5A-1 в CLSI М10025. Для наркотиков здесь, использовать E. coli ATCC 25922; MIC диапазоны для этого штамма, 0,25-1 мг/мл для миноциклин и 0,25-2 мг/мл для колистину.
      3. Выберите диапазон концентрации антибиотиков для тестирования, которые будут включать в себя весь диапазон КК. Используйте диапазон 0.0156 мг/мл до 8 мг/мл для миноциклин и колистина для ATCC 25922.
      4. Добавьте 1 мл 0,9% хлорида натрия в 12 мм x 75 мм вокруг нижней стеклотрубки культуры. Выберите один или два колоний от ночи пластины ATCC 25922 и вихревой мягко приостановить.
      5. Проверьте концентрация бактерий с помощью читатель МакФарланд. Корректировать по мере необходимости, добавив больше 0,9% хлорида натрия или больше бактерий для достижения 0.5 МакФарланд мутность чтения.
      6. Сделайте разведение 1: 300 0.5 МакФарланд подвески путем добавления 30 мл катион скорректирована бульон Мюллер Хинтон (CAMHB) в 50 мл Конические трубки для достижения окончательного клеток плотность 5 x 105 кое/мл, 100 мл суспензии, как рекомендованный CLSI27.
      7. С помощью стерильных пересевать цикла, изоляции полоска падение отправной посевным материалом на пластину агар крови для подтверждения чистоты посевным материалом и Инкубируйте на 35 ° C в атмосферном воздухе.
    2. Добавьте противомикробных препаратов с плоским дном, площадь Ну, ясно, неочищенные 384-ну пластину, используя D300. Выполните этот шаг сразу же после подготовки бактериальных подвески, так что подвеска могут быть добавлены к пластинам в течение 15 минут о подготовке26.
      1. Включите принтер струйный D300 и связанных компьютер. Откройте программу.
      2. Запустите новый файл. Выше изображение сетки плиты щелкните правой кнопкой мыши на пластине 1 и выберите редактировать пластины. Выберите соответствующие пластины типа (384 хорошо) и дополнительный объем (50 мл).
      3. Добавьте жидкости (т.е., антибиотик запасов) к протоколу, щелкнув знак «плюс» рядом с жидкости на панели слева. Добавьте две жидкости (колистина и миноциклин).
        1. Наведите на панели, которая появилась для жидкости 1 и нажмите на карандаш для редактирования. Имя жидкость «Колистин», измените класс , чтобы «водный + анимации 20», изменения концентрации до 10 000 человек и изменить единицы концентрации в мг/мл (Обратите внимание, что запасов концентрация составляет 10 мг/мл, то есть, 10000 мг/мл). Оставьте дозировки by на концентрации и оставить остальные поля в их значения по умолчанию. Нажмите кнопку ОК.
        2. Повторите выше для жидкости 2 (Миноциклин.).
        3. Перейдите на вкладку Текущий протокол в верхней части экрана и изменить концентрации (массового) g/mL mдля определения единицы, используемые для окончательного концентрации хорошо антибиотиков.
      4. В сетке выберите 10 скважин, щелкнув и перетащив, а затем нажмите кнопку титров в верхней части экрана. Укажите титрования с помощью выберите Высокая концентрация, для жидкости выберите Колистин, Высокая концентрация введите 8 (убедитесь, что единицы являются мг/мл) и для распространения Выбор 1:2 (50%). Оставьте по умолчанию значения в место для остальной части окна и нажмите кнопку ОК.
      5. Повторите выше для миноциклин для создания миноциклин титрования.
      6. Сохраните протокол и затем нажмите кнопку запустить в левом верхнем углу.
      7. Нажмите кнопку Пуск . Загрузить 384-ну плиты (со снятой крышкой) в держатель пластины и нажмите загружен под «Load пластина 1 – Синергия» оперативно.
        Примечание: Этот запрос выбирает программное обеспечение и не указывают, что Синергия тестирование выполняется. Поместите Т8 + кассету в кассетный слот и нажмите загружен под нагрузкой Т8 + кассета оперативно.
      8. При появлении запроса, добавьте Антибиотик раствор в указанных водоемах на кассету. Следуйте инструкциям на экране для правильной загрузки и обойтись тщательно, чтобы избежать попадания любые пузыри в решении. После добавления каждого решения, нажмите кнопку заполнены .
      9. Как только струйный принтер добавил, что антибиотик складе в надлежащих объемах каждой скважины и поле Запуск завершенных появляется, нажмите кнопку Закрыть, удалить пластину и выключить D300.
    3. Добавьте бактериальных суспензий 384-ну пластины и инкубировать пластины.
      1. Залейте ранее подготовленных бактериальных подвеска в резервуар стерильной реагента.
      2. Используйте многоканальные пипетки добавить 50 мл бактериальной подвески для всех скважин, содержащих антибиотик. Добавьте 50 мл CAMHB без бактерий пустой колодец; Это будет отрицательный контроль хорошо для подтверждения стерильности средств массовой информации.
      3. Установите пластину в инкубаторе окружающего воздуха 35 ° C и проинкубируйте 16-20 ч26.
        Примечание: Другой срок инкубации может потребоваться, если проверяются организмов других, чем Enterobacteriaceae ; обратитесь к CLSI М10025 для организма конкретные рекомендации.
    4. Читать пластины на Считыватель микропланшетов на оптической плотности 600 (600ОД) и анализировать результаты.
      1. Используя программу электронных таблиц, затенение ячейки со значением600 ОД зеленый ≥0.07, указывающее, роста и ячейки со значением < 0,07 красный, указывая никакого роста.
        Примечание: Эти значения были определены на основе визуального осмотра роста против без роста и корреляции с ОД чтений для этих экспериментов; ОД600 чтений из скважин, содержащие только средства массовой информации были последовательно ниже 0,07. Соответствующие предохранители могут отличаться с различными пластины читателей и бактерий.
      2. Определите микрофон для каждого препарата. MIC является низкая концентрация препарата, на которой тормозится рост бактерий. Если микрофон находится в пределах ожидаемого КК согласно CLSI М100 документ25, Стоковый раствор подходит для использования.
  3. Подготовьте бактериальных подвеска для массива шахматной доски.
    1. Возьмите Алиготе каждый антибиотик акций из морозильник-80 ° C, чтобы начать размораживание при подготовке бактериальных подвеска. Вихревой раз талой обеспечить антибиотика в решении.
    2. Добавьте ~ 1 мл 0,9% хлорида натрия в 12 мм x 75 мм вокруг нижней стеклотрубки культуры. Выберите один или два колоний от ночи пластины бактерий (в этот случай, штамм E. coli FDA-CDC 0494) и вихревой мягко, чтобы приостановить их в 0,9% хлорида натрия.
    3. Проверьте концентрация бактерий с помощью читатель МакФарланд. Корректировать по мере необходимости, добавив больше 0,9% хлорида натрия или больше бактерий для достижения 0.5 МакФарланд мутность чтения.
    4. Сделайте разведение 1: 300 0.5 подвески МакФарланд, добавив 100 мл суспензии 30 мл CAMHB в 50 мл Конические трубки для достижения окончательного клеток плотность 5 x 105 кое/мл27.
  4. Добавьте противомикробных препаратов с плоским дном, площадь Ну, ясно, неочищенные 384-ну пластину, используя D300.
    Примечание:     этот шаг выполнять сразу же после подготовки бактериальных подвески, так что подвеска могут быть добавлены к пластинам в течение 15 минут о подготовке26.
    1. Включите принтер струйный, запустите новый файл и добавьте жидкости к протоколу как шаги 1.2.2.1-1.2.2.3.
    2. Создание сетки синергии.
      1. Щелкните значок синергии в верхней части экрана и выполните шаги. Для типа выберите два или больше жидкости, учитываться вместе. Для плитыэто не необходимо исключить любые скважин; Нажмите кнопку Далее на этот шаг без внесения изменений.
      2. На вкладке титрования введите концентрации антибиотиков и размещения.
        1. Для того чтобы добавить миноциклин в уменьшении вдвое разведениях от 32 до 0,031 мг/мл, помимо негативных колодец не антибиотик, вниз ось y , введите 12 для титрования уровней на левой панели. Укажите титрования с помощьювыберите Высокая концентрация; Выберите для жидкости, миноциклин; Высокая концентрациявведите 32 (убедитесь, что устройство устанавливается на мг/мл; если это не, закройте диалоговое окно синергии и изменить на вкладке Текущий протокол ). Убедитесь, что установлен флажок включить 0 значение. Изменить распределение 1:2 (50%).
        2. Повторите эти шаги для колистина на правой панели, используя 12 уровней титрования и высокая концентрация 16. Нажмите кнопку Далее.
      3. На вкладке Макет выберите уровни титрования первые 2 жидкости определяют количество строк и столбцов в сетке макета. Нажмите кнопку Далее. Если сетка отображается, как ожидалось, нажмите кнопку Готово.
    3. Сохранить протокол, а затем нажмите кнопку запустить в левом верхнем углу.
    4. Нажмите кнопку Пуск . Загрузить 384-ну плиты (со снятой крышкой) в держатель пластины и нажмите загружен под нагрузку плиты 1 – Синергия оперативно. Поместите Т8 + кассету в кассетный слот и нажмите загружен под нагрузкой Т8 + кассета оперативно.
    5. При появлении запроса, добавьте Антибиотик раствор в указанных водоемах на кассету. Следуйте инструкциям на экране для правильной загрузки и обойтись тщательно, чтобы избежать попадания любые пузыри в решении. После добавления каждого решения, нажмите кнопку заполнены .
    6. После того, как распределитель D300 добавил что антибиотик складе в надлежащих объемах каждой скважины и поле Запуск завершенных появляется, нажмите кнопку выход, удалить пластину и выключить D300.
  5. Добавьте бактериальных суспензий 384-ну пластины и инкубировать пластины.
    1. Залейте ранее подготовленных бактериальных подвеска в резервуар стерильной реагента.
    2. Используйте многоканальные пипетки добавить 50 мл суспензии для всех скважин в массиве шахматной доски. Добавьте 50 мл CAMHB без бактерий пустой колодец; Это будет отрицательный контроль хорошо для подтверждения стерильности средств массовой информации. Инкубируйте в инкубатор окружающего воздуха 35 ° C для 16-20 ч26.
  6. Читать пластины на Считыватель микропланшетов ОД600 и анализировать клетчатый массив результатов.
    1. Во-первых проверьте чистоту пластины и обеспечить изолированной колонии одного морфологии, что согласуется с ожидаемой морфологии организма проходит испытания.
    2. Используя программу электронных таблиц, затенение ячеек для указания и рост в не как шаг 1.2.4.1.
    3. Определите микрофон для каждого препарата. Для наркотиков, которое не подавляет рост бактерий в самую высокую концентрацию испытания MIC считается масштаба.
    4. Для каждой скважины, в котором рост ингибируется, определения фракционного ингибирующее концентрации (FIC) для каждого антибиотиками, на основании этого антибиотика MIC (см. Рисунок 1B и Рисунок 2B).
      Примечание: FIC является отношение концентрации антибиотика в колодец, в котором рост ингибируется его микрофон; так препарата с микрофоном 8 мг/мл, хорошо содержащие 8 мг/мл этого наркотика имеет FIC 1, а также содержащий 4 мг/мл FIC 0.5.
    5. Вычислить значение индекса (FICя) дробная ингибирующее концентрации для каждой скважины, в котором рост ингибируется как сумма FICs каждого из препаратов в этом хорошо.
    6. Определите, что низкие FICя на которой является рост тормозится (минимум FICя). Если минимальный FICя £0.5, рассмотреть сочетание синергизма; Если 0,5-4, рассмотреть сочетание равнодушным; и если > 4, рассмотреть сочетание антагонистических. Если комбинация синергетический на некоторые концентрации комбинации но антагонистических на других, обратите внимание, этот результат, но рассмотреть сочетание целом антагонистических.

2. время убить синергии тестирование

  1. Сделайте антимикробной акций решения. Если этот шаг выполняется впереди эксперимент, заморозить запасы на-80 ° C до готовы к использованию.
    1. Определите концентрации антибиотиков Стоковый раствор на основе растворимость антибиотиков и желаемого окончательный концентрации в времени убить исследования. В этом примере сделайте колистина и миноциклин запасов в концентрации 1 мг/мл. Использование CLSI М100 документа, чтобы определить соответствующие растворители для каждого антибиотик25. Используйте воду, как это рекомендовано, Колистин и миноциклин.
    2. Весят вне антибиотик порошок, используя аналитический баланс и вычислить объем растворителя, необходимых для получения запасов концентрация цели. При необходимости, выполните вычисления потенции до определения количества растворителя требуется, как описано в шаге выше 1.1.2.1.
    3. Налить антибиотик порошок в 15 мл конические трубы и добавить соответствующий объем воды. Вихрь до растворения.
  2. С помощью метода microdilution ручной бульон, описанного в CLSI M0726, выполняют КК антимикробные запасов для использования в время убить синергии экспериментов. Выполните этот шаг, по крайней мере за один день до синергии, тестирования, так что QC результаты могут пересматриваться перед использованием запасов.
    1. Выберите соответствующий штамм КК и определить допустимый диапазон MIC для наркотиков проходит проверку на основе таблицы 5A-1 в CLSI М10025. Для наркотиков здесь, использовать E. coli ATCC 25922; MIC диапазоны для этого штамма, 0,25-1 мг/мл для миноциклин и 0,25-2 мг/мл для колистину.
    2. Готовят отвар, содержащие антибиотик microdilution пластины.
      1. Выберите самую высокую концентрацию антибиотиков тестирование, поэтому весь диапазон КК могут быть включены. Используйте диапазон 0.016 до 8 мг/мл для миноциклин и колистина для ATCC 25922.
      2. Разбавьте антибиотик запасов для рабочего раствора в CAMHB в два раза высокая концентрация, нужно (потому что это будет разбавленных 1:1 с подвеской бактерий). В этом примере развести обе акции от 10 мг/мл до 16 мг/мл.
      3. С помощью многоканальных дозаторов, добавить 100 мл каждого из 2 x антибиотик суспензий хорошо в первом столбце ясно, раунд снизу, неочищенные 96-луночных пластины и добавить 50 мл простого отвара (т.е. без антибиотика) в каждой скважине последующих столбцов.
      4. Удаление 50 мл, содержащих антибиотик отвара от каждой хорошо в первом столбце и добавить в колодцы во втором столбце. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать содержимое, генерации антибиотик концентрации половину что концентрации в первом столбце.
      5. Повторите шаг 2.2.2.4 с каждым столбцом, так что подготовлен ряд серийных разведений в два раза, каждый объемом 50 мл. Изменение пипеткой советы между каждый шаг в разбавления при необходимости устранить возможность антибиотик уноса. Обратите внимание, что результирующая концентрация все еще 2 x окончательного концентрации, как они впоследствии будут разбавленных 1:1 с бактериальной подвеска.
      6. Не добавляйте любой антибиотик последние два столбца, как они будут негативные и роста управления столбцами.
    3. Подготовьте бактериальных подвеска.
      1. Подготовьте 0.5 МакФарланд подвеска от ночи пластины E. coli ATCC 25922 в 0,9% натрия хлорида, как описано в шагах 1.2.1.5-1.2.1.6.
      2. Сделайте разведение 1: 150 0.5 МакФарланд подвески, добавляя 50 мл суспензии до 7,5 мл CAMHB.
        Примечание: Окончательный бактериальных подвеска будет разбавленных 1: 300 после того, как он смешивается с антибиотик раствор, достигнув плотность клеток, CLSI-рекомендуется 5 x 105 кое/мл271:1).
    4. Добавление микроплиты бактерий и инкубировать.
      1. Добавьте 50 мл бактериальной подвески для каждой скважины, за исключением в столбце 11тыс . Добавьте 50 мл CAMHB 11й столбец (отрицательный контроль).
      2. Инкубируйте пластины при 35 ° C для 16-20 ч.
        Примечание: Другой срок инкубации может потребоваться, если проверяются организмов других, чем Enterobacteriaceae ; обратитесь к CLSI М10025 для организма конкретные рекомендации.
      3. Читать пластина для роста, визуально с помощью света и, для каждого антибиотик, определить низкие концентрации, в котором нет никакого роста; Это микрофон. Ознакомиться с документом CLSI M07 для получения дополнительной информации по визуальной интерпретации MIC26. Если микрофон находится в пределах ожидаемого КК, Стоковый раствор подходит для использования.
  3. Запустите первоначальной культуры.
    1. Сделать 0.5 МакФарланд подвеска тест организма в стерильного 0,9% NaCl, как описано выше.
    2. Добавьте 100 мл 0,5 МакФарланд подвеска до 5 мл CAMHB в стакане 25 мм x 150 мм круглая труба внизу культуры с закрытием из нержавеющей стали и вихревой мягко, чтобы смешать.
    3. С помощью стерильных пересевать цикла, изоляции полоска капля разбавленного подвеска на пластину агар крови для подтверждения чистоты посевным материалом и Инкубируйте на 35 ° C в атмосферном воздухе.
    4. Заменить закрытия на трубе и инкубировать в пробирку стойку на шейкер на 35 ° C в атмосферном воздухе по крайней мере 3 часа, до логарифмической фазы роста (см. шаг 2.6.1). Перейдите к шагу 2.4, в то время как культура находится в инкубаторе.
  4. Подготовьте антимикробной решения в 25 мм x 150 мм стеклянных трубок культуры.
    1. Вывезти антимикробной запасов аликвоты от-80 ° C морозильник таять. Вихревой раз талой обеспечить антибиотика в решении.
    2. В то время как первоначальные культуры инкубации, добавить 10 мл CAMHB пяти газобетона 25 мм x 150 мм стекла культуры трубы и добавить антимикробной акций решения следующим.
      Примечание: Для исследования взаимодействия, должны быть по крайней мере один препарат в концентрации, которая не влияет на рост кривой индивидуально28; Это может быть определено путем оценки воздействия концентраций отдельных наркотиков до изучения синергизма.
      1. Труба 1: Добавьте соответствующее количество антибиотиков #1 для получения целевой конечной концентрации антибиотиков. В этом случае добавьте 1 мг/мл колистина акций для получения окончательного колистина концентрации 1 мг/мл, 10 мл, как это концентрации, которая является неэффективным против штамма, используемые в этом примере.
      2. Труба 2: Добавьте соответствующее количество антибиотиков #2 для получения окончательного антибиотик концентрации испытываемого. В этом случае добавьте 10 мл 1 мг/мл миноциклин акций для получения конечной концентрации 1 мг/мл, концентрация, которая является неэффективным против штамма, используемого в этом примере.
      3. Труба 3: Добавьте такое же количество антибиотиков #1 и антибиотик #2, используемые в трубы 1 и 2. В этом случае добавьте 10 мл бульона миноциклин 1 мг/мл и 10 мл, 1 мг/мл колистина запасов.
      4. Трубка 4: Добавление не антибиотики; Это будет роста управления трубки.
      5. Трубка 5: Добавление не антибиотики; Это будет отрицательный контроль труб.
  5. Подготовьте 96 глубинно полипропиленовых плит с 2 мл скважин для серийных разведений путем добавления строк B-H колонок 1-5 с многоканальные пипетки 900 мкл стерильного 0,9% натрия хлорида.
  6. Подготовка начиная посевным материалом и добавить в пробирки.
    1. После того, как первоначальный культура достигла фазы логарифмического роста (~ 3 h для Klebsiella pneumoniae, организм, используемые в этом примере), снять трубку культуры от шейкер, вихревой мягко, передачи ~ 1 мл суспензии культуры 12 мм x 75 мм стеклянной трубки, и Проверка плотности с читателем МакФарланд.
      1. Если это меньше, чем 1.0 МакФарланд, возвращение трубки в шейкере и инкубировать и больше. Если это больше, чем 1.0 МакФарланд, добавьте CAMHB к трубе, вихревой мягко и повторной выборки, повторяя этот процесс до приостановления в 1.0 МакФарланд.
    2. Добавьте 100 мл 1.0 МакФарланд подвески труб 1-4 и вихревой мягко.
  7. Образец аликвоты от каждой культуры и выполнять серийный десятикратный разведениях.
    1. В момент времени 0 (сразу после добавления бактерий трубы) и на 1, 2, 4, 6 и 24 h удалите 150 мл аликвота из каждой культуры трубки, наклоняя трубку так, что только кончик стерильной пипеткой вводит трубку и не дозаторов нестерильные вала во время аликвота вывода. Добавьте аликвоты, соответственно, подряд скважин в первой строке ранее подготовленных 96 глубинно пластины. Возвращение трубы в пробирку стойку на шейкер в инкубаторе окружающего воздуха 35 ° C сразу же после удаления аликвоты в каждый момент времени.
    2. С помощью многоканальных дозаторов, удалите из строки A 100 мл, добавить строку B (которая содержит 900 мл 0,9% хлорида натрия) и Пипетка вверх и вниз 4 - 5 раз для смеси, создавая 1:10 разрежения. Выбросите советы после каждого шага разрежения для предотвращения уноса бактерий, которые могут привести к пунктам ложно повышенного колонии.
    3. Повторите шаг 2.7.2 для строк B-H с новые наконечники для каждой строки.
  8. Пластине разведен образцы для колонии графов с помощью раскрывающегося пластины метод29,30.
    1. Метки Мюллер Хинтон плиты агара с антибиотиком условий и разбавления покрываемые.
    2. Использование многоканальных дозаторов и удлиненными советы (чтобы убедиться, что советы достигают подвеска), удалите 10 мл из каждой скважины в первом столбце и тщательно распределять в ряд на пластину для соответствующей маркировкой. Если используются небольшие (диаметром 100 мм) пластины, обойтись 3 строк (состоящих из капель от строк A-H одного столбца) на пластину; на больших пластин (диаметр 150 мм) отказаться от 8 строк за тарелку.
    3. Разрешить капли полностью высохнуть (~ 15 мин).
    4. На 24 ч место 10 мл капли, взяты непосредственно из трубки отрицательный контроль в указанной области одной из пластин для проверки стерильности. Инвертировать пластины и инкубировать и всю ночь на 35 ° C в атмосферном воздухе.
  9. Подсчет колоний и рассчитать плотность клеток. Марк колоний с штраф наконечник перманентный маркер на обратной стороне пластины, чтобы избежать двойного учета или отсутствующие колоний.
    1. Во-первых проверьте чистоту пластины и обеспечить изолированной колонии одного морфологии, что согласуется с ожидаемой морфологии организма проходит испытания.
    2. Для каждой серии разрежения определите капли с 3-30 колоний (обычно одна капля за разбавления серии). Подсчет колоний в эти капли и записать число наряду с коэффициент разрежения.
      1. Если есть без капли в серии разрежения с 3-30 колоний, подсчета колоний в последней капли с > 30 колоний и первое падение с < 3 колоний (они должны быть смежными капли).
    3. Для каждой серии разрежения, вычислить количество колонии, образуя единиц на миллилитр (кое/мл) в образце, основанный на количество колоний в падение, по следующей формуле: кое/мл = n(1 /d) (100) где n — это количество колоний, d является коэффициент разрежения (1 для неразбавленном образца (ряд А), 0,1 или 10-1 для первого 1:10 разрежения (строка B), 0,01 или 10-2 для второго 1:10 разрежения (ряд C) и так далее и постоянной 100 счетов тот факт, что общий объем падение я s 10 мл, в то время как окончательное значение выражается в кое/мл, то есть, кое/1000 мл. Используйте таблицы, содержащих формулы, которые вычисляют кое/мл из колонии рассчитывать упростить этот процесс.
      1. Для разбавления серии, когда более чем одна капля countable (или где две капли пришлось быть подсчитано, потому что ни капли упали в диапазоне) средняя окончательный кое/мл рассчитывает для всех подсчитанных капель.
      2. Потому что нижний предел обнаружения 300 кое/мл (3 колоний в неразбавленном падение), запись и участок колонии счетчик как £300 кое/мл для разбавления серии, в которой есть < 3 колоний в неразбавленном падение.
    4. Осмотрите падение контроля стерильности от времени 24; Если любой рост наблюдается в это падение, результаты эксперимента не должен использоваться.
  10. Граф и анализировать результаты.
    1. Наложение кривые роста от трех антибиотик содержащих культур и роста управления на одном графике. Печать времени на оси x и кое/мл, используя логарифмическую шкалу, на оси y .
    2. Вычисление разности кое/мл сочетание трубки на времени 24 и наиболее активных одного агента в момент 24. Если разница составляет ≥2 журнала10, рассмотреть сочетание синергизма. Затем вычислите разницу в кое/мл между сочетание трубки во время 24 и в момент времени 0. Если разница составляет ≥3 журнала10, рассмотреть сочетание бактерицидное.

Representative Results

Рисунок 1A представляет сетку из шахматной массив взаимодействия эксперимент, в котором миноциклин в концентрации 0-32 мкг/мл был в сочетании с колистина в концентрациях 0-16 мкг/мл и тестируются штамм E. coli 0494 FDA-CDC. Значения представляют собой спектрофотометрические чтений на оптической плотности 600 Нм (600OD). Колодцы с ОД600 значения ниже 0,07 (что соответствует никакого роста путем визуального осмотра) являются затененные красный, а скважин с ОД600 значений 0,07 (что соответствует росту путем визуального осмотра) тенистый зеленый. Для каждого препарата минимальный тормозной концентрация (MIC; жирным шрифтом) является низкая концентрация препарата, который подавляет рост бактерий. Для миноциклин это 32 мкг/мл, и для Колистин, это 8 мкг/мл. Затенение сохраняется на рисунке 1B, но значения в пределах скважин, в которых рост ингибируется заменяются значениями индекса (FICя) дробная ингибирующее концентрации. Они определяются следующим образом: в каждой скважине, индекс дробных ингибирующее концентрации (FIC) каждого препарата рассчитывается путем деления концентрация антибиотика в что хорошо наркотиков микрофон, и FICя рассчитывается путем суммирования двух FICs. Колодцы с ФИКя значение 0,5, который считается отсечки для синергии, указаны с сломанной линии границы, и колодец с ФИКя стоимостном (0.094) является полужирным. Потому что минимальное значение FICя в пределах синергетический, комбинация считается синергетический.

Рисунок 2A и 2B рисунок Показать сетки аналогичны в рисунке 1A и 1B рисунок, но в этом случае комбинация не демонстрируют синергии против испытания изоляции (K. pneumoniae изолировать BIDMC 4), потому что Минимальная FICя на котором рост ингибируется это 1, которая является > 0.5.

Рисунок 3 показывает показания оптической плотности сетки синергии шахматной доски, в которой несколько пропущенные скважин произошло (Enterobacter cloacae комплекс изолировать BIDMC 27). Пропущенные скважин, колодцев, в которых бактериальный рост ингибируется несмотря на присутствие бактерий на соседних скважинах с более высокими концентрациями антибиотика. Это явление, которое знаны, что происходит в стандартный микрофон тестирования также, вероятно, из-за биологической вариативности в характеристики роста бактерий от хорошо хорошо и чувствительность некоторых антибиотиков на небольшие различия в бактериальных посевным материалом23 , 31 , 32. Если более чем один пропущенных хорошо произошло в массиве шахматной доски, мы отброшены результаты и повторил assay.

Рисунок 4 представляет примеры результатов времени убить синергии трех комбинаций тестируются K. pneumoniae изолировать BIDMC 32. Колонии графов указаны на логарифмической шкале на y-оси и время в часах, на x-оси. Разница между начальной посевным материалом в пробирку, содержащую комбинации препарата и концентрация бактерий в трубку на 24 ч иллюстрируется красный бар и номер, а разница между концентрация бактерий на 24 часа между трубки содержащие комбинацию и трубка, содержащая наиболее активных только один агент иллюстрируется Голубой бар и номер. На рисунке 4A показано результаты с колистина и миноциклин; Эта комбинация была синергетический (разница между концентрации бактерий подвергаются комбинации и наиболее активных агента только ≥2 журнала10 кое/мл на 24 ч) и бактерицидным (сокращение от начиная с посевным материалом для концентрации на 24 h ≥3 журнала10 CFU/mL). Рисунок 4B показывает результаты с колистина и клиндамицин, сочетание, которое было синергетический но не бактерицидное. Эта комбинация препятствует росту бактерий, которые ни наркотиков сделал самостоятельно, но не убить их. Рисунок 4 c показывает результаты от комбинации колистина и эритромицин, который был бактерицидной ни синергетический.

Figure 1
Рисунок 1: Шахматная доска массив результатов демонстрации синергизма (Миноциклин + колистина тестируются E. coli штамм 0494 FDA-CDC). (A) спектрофотометрические индикации и роста интерпретации массива шахматной доски. Значения в ячейках, оптическая плотность чтений на 600 Нм (600OD). Клетки с ОД600 значения ниже 0,07 (соответствующий рост не путем визуального осмотра) являются затененные красный, в то время как клетки с ОД600 значений 0,07 (соответствует росту путем визуального осмотра), тенистый зеленый. Расчет индекса, (FICя) дробная ингибирующее концентрации (B). Затенение, указывающий роста или рост не был сохранен. Значения для колистина и миноциклин вдоль x- и y-оси, соответственно, теперь представляют дробных ингибирующее концентрации (ФИК), или отношение концентрации препарата в этом столбце или строке (минимальная концентрация тормозной MIC) этого наркотика в одиночку. В каждой ячейке значение FICя, или сумма FICs двух препаратов в этом хорошо. Большой сломанной граничит с линии поле заключает скважин с ФИКя 0.5. Граничит с толстым ячейки указывает колодец с низким FICя в котором рост ингибируется, или минимум FICя. Поскольку минимальная FICя 0,5, комбинация считается синергетический. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Результаты массив шахматной комбинации, которые не демонстрируют синергии (Миноциклин + колистина тестируются K. pneumoniae изолировать BIDMC 4). (A) оптическая плотность значения на 600 Нм и роста интерпретации клетчатый массив результатов, как указано на рисунке 1A. (B) дробная ингибирующее концентрации расчет индекса (FICя) как указано на рисунке 1A. Потому что минимальный FICя > 0.5, сочетание не считается синергизма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Шахматная доска массив результатов, которые нечитаемое из-за пропущенных скважин (Миноциклин + колистина тестируются энтеробактер cloacae комплекс изолировать BIDMC 27). Оптическая плотность значения на 600 Нм и роста интерпретации клетчатый массив результатов, как указано на рисунке 1A. Демонстрируются некоторые пропущенные скважин, в которых бактериальный рост ингибируется несмотря на присутствие роста в соседних скважин с более высокими концентрациями антибиотика. Результаты не поддаются интерпретации и эксперимент должен быть повторен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Время убить синергизма результаты трех комбинаций тестируются K. pneumoniae изолировать BIDMC 32. Колонии графов указаны на логарифмической шкале на y-оси и время в часах, на x-оси. Разница между концентрация бактерий в комбинации в 24 ч и начальный посевным материалом в трубе иллюстрируется красный бар и номер. Если сокращение от начиная с посевным материалом для концентрации на 24 ч ≥3 журнала10 кое/мл, комбинация считается бактерицидное. Разница между концентрация бактерий на 24 часа между трубка, содержащая сочетание и трубка, содержащая наиболее активных только один агент иллюстрируется Голубой бар и номер; Если есть ≥2 журнала10 кое/мл сокращения, комбинация считается синергетический. (A) колистина (КНТ) + миноциклин (мин), сочетание, синергетический и бактерицидным. (B) колистина + Клиндамицин (CLI), сочетание, синергетический, но не бактерицидное. (C) колистина + Эритромицин (ERY), сочетание, что бактерицидной ни синергетический. Эти результаты были первоначально опубликованы в рамках исследования синергизма деятельности с колистина комбинации с колистина устойчивостью Enterobacteriaceae, в котором мы показали, что колистина был синергетический с рядом антибиотики, которые активны в отдельности только (например, клиндамицин) или главным образом (например, эритромицин) против грамположительных бактерий16. (Обратите внимание, что эритромицин синергетический, шахматная доска массив против штамма показано, но не по времени убить, поэтому он был выбран здесь как пример сочетании.) Мы предположили, что Колистин, который известен действовать permeabilization грамотрицательных наружной мембраны, оказывает sub-inhibitory permeabilizing эффект на Колистин устойчивых грамотрицательных бактерий, позволяя запись таких наркотиков, как Клиндамицин, обычно нельзя ввести грамотрицательные клетки. Панель (A) этот показатель был изменен с Бреннан-Krohn, Pironti и Кирби 201816, copyright © Американское общество микробиологии, антимикробным агентам и химиотерапии, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Двух методов, описанных здесь оба предоставляют информацию о деятельности противомикробных препаратов, используемых в комбинации по сравнению с их индивидуальной деятельности. Автоматизированный, струйный принтер с помощью цифровой дозирования метод является адаптация метода, описанного в клинической микробиологии процедур руководства33, в то время как метод kill время более внимательно следит за соответствующий протокол от того же Ссылка34.

В методе массив шахматной доски автоматизирован вычисления, чтобы определить необходимый объем акций противомикробные для добавления каждой скважины, а также выдачи этих томов, таким образом устраняя некоторые из основных потенциальных источников ошибок, возникших в руководстве Шахматная доска массив. По-прежнему важно, однако, что следователь определяет, что оригинальный запасов на предполагаемой концентрации и что цель окончательного концентрации вступил в D300 программное обеспечение правильно. Добавление антимикробной подвеска скважин в 384-ну плита может быть сложной на первый взгляд и требует ухода для обеспечения что пипетки советы введите соответствующие скважин и что жидкость не всплеск краев лунки. Обработчик автоматизированных жидкость может использоваться вместо ручной многоканальные пипетки увеличить скорость и точность, с которой бактериальной подвеска добавляется скважин. Как описано в протоколе, D300 требует добавления ПАВ, полисорбат 20 (P-20), для правильной обработки жидких. Различные ПАВ, Полисорбат 80, в концентрации 0,002%, было отмечено снижения ОПГВ колистина для организмов с колистина ОПГВ в < 2 мкг/мл в стандартных бульон microdilution анализов. 35 , 36 нашей лаборатории ранее показали, что P-20 в концентрациях до 0.0015% имели никакого влияния на результаты при содействии D300 микрофон в сравнении с ссылка про14. В этом примере пробирного, представленные здесь максимальная P-20 является концентрация 0,0014%.

Одна из проблем, мы столкнулись с некоторых анализов массив клетчатый было большое количество пропущенных скважин. Это произошло на несоразмерное ставка с некоторых антибиотиков. В частности на экране комбинаций против коллекции carbapenem устойчивостью Enterobacteriaceae, мы обнаружили, что во время 49 521 испытаний (9,4%) было непригодным для использования из-за нескольких пропущенные скважин, 2 12 антибиотиков тестирование (Фосфомицин и Цефепим) приходилось 46 этих испытаний (94%). Такое увеличение ставки могут быть более вероятно, наркотиков, которые особенно чувствительны к посевным материалом эффект31,,3237. Следует отметить CLSI не рекомендую тестирования фосфомицина в бульон разрежения25 из-за озабоченности по поводу надежности результатов с помощью этого метода, который может объяснить ненадежные результаты, наблюдаемые с этим препаратом. Некоторые изменения могут быть сделаны автоматизированных клетчатый метода согласно предпочтению следователь. Противомикробных препаратов может обойтись в пластины, уже содержащий бактериальных подвеска, а не в пустых скважины, если это предпочтительно по причинам рабочего процесса в пределах лаборатории. Хотя 384-ну пластины были использованы здесь, метод может также осуществляться в 96-луночных пластины анализов с соответствующей модификации хорошо тома. Использование формата 96-луночных пластины может помочь в снижение пропущенные скважин для антибиотиков, которые особенно чувствительны к малым изменениям в посевным материалом. При расчете ФИК,я, могут существовать ситуации, когда микрофон-шкала (то есть, выше, чем тестирование), включая ситуации, когда препарат проходит испытания не деятельность индивидуально против тип проверяемого организма. В этих случаях сии может быть рассчитываются на основе при условии, что микрофон находится один разрежения, выше, чем самая высокая концентрация испытания. Это наиболее консервативной стратегией, как это предполагает максимальное возможное значение FIC для любого разбавления, где наблюдается торможение при тестировании взаимодействия. Например если фактические MIC были вместо этого два удвоение разведений выше самая высокая концентрация испытания, то соответствующий FICs бы два раза ниже, чем на консервативной назначений и так далее.

Для того, чтобы точно оценить бактерицидная активность препаратов в assay время убить, важно что культур в логарифмической фазы роста, особенно, когда антибиотики активной клеточной стенки в настоящее время испытания28. Для быстро растущих бактерий, используемые в этом примере (K. pneumoniae), 3 часа инкубации с встряхивания было целесообразно достичь этой фазы роста, но различное количество времени может потребоваться для различных организмов. В целом культура должна появиться заметно, но не сильно мутная. Достаточное количество времени можно определить путем построения кривой роста с колонии рассчитывает на серийный время точек (например, каждые 30 мин для 4-6 ч)38. Важно также предполагаемого начала посевным материалом в исследовании время убить. Концентрация целевого начиная посевным материалом составляет приблизительно 5 x 105 до 1 x 10-6 кое/мл. Описанные здесь разрежения (100 мкл 1.0 подвески МакФарланд в 10 мл средства массовой информации) генерирует этот посевным материалом Klebsiella pneumoniae и других видов Enterobacteriaceae , на котором мы проверили его. Если плотность начального инокуляты в ходе эксперимента с использованием различных организмов является значительно выше или ниже, чем это, могут потребоваться различные разрежения. (Соответствующие разрежения, необходимых для данного вида можно определить, выполнив пластины, количество 0,5 или 1,0 МакФарланд подвеска определить как многих организмов, это замутненности представляет, затем расчета суммы, по которому должен быть начальный подвеска разбавляют до достижения соответствующей конечной концентрации). Если на обзоре графов пластины из касающегося синергизма исследования, начиная посевным материалом любого из трубок, содержащих антибиотик обнаруживается были значительно ниже, чем начальная посевные роста управления, это может указывать либо антибиотиком уноса или очень быстрое уничтожение бактерий в короткое время между добавлением бактерий к антибиотикам содержащих трубке и удаление Алиготе для обшивки. Если фактическое количество колоний в неразбавленном падение в серии меньше чем количество колоний в последующих разведениях, это предполагает антибиотик переходящий эффект. Для предотвращения этого эффекта, включая распространение одного Алиготе над всей пластине38 или спиннинг вниз образца, удаление супернатант и повторного приостановления в стерильного физиологического раствора до обшивки39были описаны различные варианты. В каждый момент времени в методе убить время это также важно для следователя эффективно, но точно удалить Алиготе из каждой культуры трубки и выполнять серийных разведений. Задержки в ходе этого процесса, особенно во время раннего момента времени, которые происходят в быстрой последовательности, может привести к длительных периодов, в течение которых культуры являются не были инкубировали и потряс, тогда как небрежно дозирования и серийных разведений может привести к неточной пластины отсчеты. По сравнению с распространение пластины метод подсчета пластины, в котором 100 мкл каждого разведения распространяется на весь агар пластины, падение пластины методом, описанным гораздо более быстрый, требует гораздо меньшее количество плиты агара и позволяет для быстрый подсчет, как максимум Счётное количество колоний для каждой капли-30, в то время как вплоть до 300 колоний обычно могут быть подсчитаны с распространением плиты. Однако метод распространения пластины также является альтернативой, если следователи более комфортно с этой техникой. Если капли друг в друга после отказа многоканальные пипетки, могут выполняться отдельные приложения более широко расставленными капель с Одноканальные Пипетки. В нашем опыте охлаждение пластины на 4 ° C до выдачи капли казалось для сокращения чрезмерного распространения.

Одно ограничение методов, описанных здесь, что результаты двух типов пробирного синергии (клетчатый массив и время убить) не всегда совпадают, и так как большинство опубликованных статей синергии использовать один метод или другой, а не оба вместе, она может будет трудно понять, как интегрировать данные из этих двух видов анализов. Поскольку метод массива автоматизированных шахматной доски, которую мы разработали простой и высок объём, мы использовали его в силу как своего рода экран для проверки комбинации против большего числа изолятов и определить, какие комбинации концентрации были синергетический. Затем мы провели меньшее количество времени убить исследований, выбор комбинаций и концентрации, которые оказались эффективными в массиве шахматной доски. Следует отметить, потому что шахматная доска обычно генотипирования в microbroth масштабе разрежения, в то время как время убить assay использует большие объемы (аналогично macrobroth разрежения), мы обнаружили, что FICs иногда отличаются между двумя методами, с более высокой концентрации, обычно требуется в assay убить время проявить активность. Это явление было отмечено ранее, когда macrobroth и microbroth разрежения MIC пробирного результаты сравниваются для грамположительных бацилл26 и когда большие инокуляты (как в времени убить исследований) сравниваются с стандартным посевным материалом, используемых в microbroth разведение и Шахматная доска массив assays32. Конкретные ограничением клетчатый массива является присущие изменчивость в microbroth разрежения MIC тестирования22. Хотя FICя предохранители синергии счета для этой изменчивости математически6 такой изменчивости неизбежно вызывает озабоченность по поводу надежности и последовательности клетчатый массив результатов.

Из-за ограничений, присущих всем в пробирке синергии тестирования методов (включая культивирование бактерий в искусственный рост среднего, статические концентрации антибиотиков и ограниченного времени курс), должны быть подтверждены результаты, полученные этими методами и Далее вычисляется с использованием дополнительных методов. Такие методы включают в пробирке фармакокинетические/фармакодинамических (PK/PD) исследования (например, полые волокна инфекции модель40), Животные модели и, в конечном счете, человеческие исследования Фармакологических и эффективность. Автоматизированных шахматной массив метод, описанный здесь, предоставляя быстрый метод с которой экран комбинации для потенциального синергизма деятельности, позволяет для более целенаправленных использования этих методов. Дальнейшей автоматизации всех этих методов, как также более систематическое исследование связи между параметрами в пробирке и клинические исходы, будет иметь важное значение в масштабирования вверх использование синергии тестирования и повышения его клинического применения.

Disclosures

D300 цифровой дозатор и связанные материалы были предоставлены Текан (Morrisville, NC). Текан имел никакой роли в дизайна исследования, сбор/интерпретация данных, подготовка рукописи или решение опубликовать.

Acknowledgments

Thea Бреннан-Krohn было поддержано, Юнис Кеннеди Шрайвер национального института здоровья ребенка и детских инфекционных заболеваний человеческого развития исследований обучения Грант (T32HD055148), Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (Грант) обучение T32AI007061), Бостон Детская больница управления из факультет Факультет карьеры развития стипендий и Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний карьеры премии в области развития (1K08AI132716). J.E.K. была поддержана национального института аллергии и инфекционных заболеваний национальных институтов здоровья под номером R33 AI119114 премии. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management. Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).
  2. Spellberg, B. The future of antibiotics. Critical Care. 18 (3), (2014).
  3. Spellberg, B., et al. The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).
  4. Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).
  5. Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).
  6. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).
  7. Zusman, O., et al. Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).
  8. Clock, S. A., et al. In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).
  9. Hirsch, E. B., et al. Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae. Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).
  10. Tängdén, T., et al. Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).
  11. Tascini, C., et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).
  12. Paul, M., et al. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).
  13. Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).
  14. Smith, K. P., Kirby, J. E. Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).
  15. Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology. J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).
  16. Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  17. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).
  18. Nation, R. L., Li, J. Colistin in the 21st century. Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).
  19. Ah, Y. -M., Kim, A. -J., Lee, J. -Y. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).
  20. Bratu, S., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).
  21. Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).
  22. MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing. Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).
  23. Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance. Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).
  24. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  25. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  26. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).
  27. Clinical and Laboratory Standards Institute. M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  28. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 7 (1999).
  29. Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests. Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).
  30. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  31. Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology. Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).
  32. Smith, K. P., Kirby, J. E. The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  33. Leber, A. L. Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.16.1-5.16.23 (2016).
  34. Leber, A. L. Time-Kill Assay for Determining Synergy. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.14.3.1-5.14.3.6 (2016).
  35. Hindler, J. A., Humphries, R. M. Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).
  36. Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls. Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).
  37. Fuchs, P. C., Barry, aL., Brown, S. D. Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine. European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).
  38. Leber, A. L. Minimum Bactericidal Concentration Testing. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , 5.14.1.11 (2016).
  39. Cai, Y., et al. In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).
  40. Bulman, Z. P., et al. Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era. mBio. 8 (4), (2017).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 146 противомикробные синергии антибиотик синергии синергии устойчивости к противомикробным препаратам Колистин сопротивления carbapenem устойчивостью Enterobacteriaceae время убить синергии шахматная доска массив Автоматизация струйной печати
Антимикробной Синергия испытаний струйный принтер с помощью автоматизированных клетчатый массив и ручной метод время kill
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E.… More

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter