Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Antimikrobiella Synergy tester av bläckstråleskrivare-assisted automatiserade schackrutiga Array och den manuella tid-döda-metoden

Published: April 18, 2019 doi: 10.3791/58636
Automatic Translation
1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Antimikrobiella synergy tester används för att utvärdera effekten av två eller flera antibiotika som används i kombination och utförs vanligtvis av en av två metoder: Schackrutor matrisen eller tid-kill analysen. Här presenterar vi ett automatiserat, bläckstråle skrivare-assisted schackrutiga array synergy teknik och en klassisk tid-kill synergy studie.

Abstract

Priser av multiresistenta (MDR) patogener fortsätter att stiga snabbare än utvecklingen av nya antimikrobiella medel, blir nya metoder för behandling av MDR bakterier alltmer en nödvändighet. Ett sådant tillvägagångssätt är kombinationsbehandling, i vilka två eller flera antibiotika används tillsammans att behandla en infektion mot vilka ett eller båda av droger kan vara ineffektiva ensam. När två läkemedel, i kombination, utöva en större än additiv effekt, de anses synergistisk. In vitro-undersökning av synergistisk aktivitet är ett viktigt första steg i att utvärdera möjliga effekten av läkemedelskombinationer. Två huvudsakliga in vitro-synergy testmetoder har utvecklats: Schackrutor matrisen och tid-kill studien. I detta papper, vi presentera en automatiserad schackrutiga array metod som använder sig av teknik för inkjet utskrifter för att öka effektiviteten och precisionen av denna teknik, liksom en standard manuell tid-kill synergy metod. Automatiserad schackrutiga matrisen kan fungera som en high-throughput screening test, medan manuell tid-kill studien ger ytterligare, kompletterande uppgifter om synergistisk aktivitet och dödande.

Schackrutiga matrisen är en modifiering av standard minsta hämmande koncentration (MIC) testning, där bakterier inkuberas med antibiotika vid olika koncentration kombinationer och utvärderas för tillväxthämning efter natten inkubation. Manuell prestanda i schackrutiga matrisen kräver en mödosam och tidskrävande serie beräkningar och spädningar. I den automatiserade metoden presenteras här, beräkning och dispensering av krävs antibiotika stamlösning volymer är automatiserade genom användning av bläckstråle skrivare teknik. I tid-kill synergy-analysen, bakterier inkuberas med antibiotika av intresse, både tillsammans och individuellt, och provtas mellanrum under loppet av 24 h för kvantitativa kultur. Resultaten kan avgöra huruvida en kombination är synergistiska och om det är bakteriedödande, och lämna uppgifter om hämning och dödandet av bakterier över tid.

Introduction

Spridningen av multiresistenta (MDR) bakteriella patogener, särskilt MDR Gramnegativa bakterier såsom karbapenemresistenta Enterobacteriaceae (CRE), har lämnat kliniker med alltmer begränsade alternativ för framgångsrik anti-infektiösa terapi 1, ett problem som förvärras av trög takten i romanen antibakteriella drug discovery2,3. Antimikrobiella synergi, där två läkemedel som används i kombination utöva en större-än-additiva effekt, erbjuder möjligheten att rädda befintliga antibiotika för användning i behandling av MDR bakterier, även när dessa bakterier är resistenta mot en eller båda av de antibiotika individuellt. De tekniker som beskrivs i detta dokument ger två kompletterande metoder för in vitro-synergy testning som, när de används tillsammans, tillåta utredarna att effektivt skärmen antimikrobiella kombinationer av intresse för belägg för synergistisk aktivitet (den automatiserade schackrutiga array metoden) och sedan att ytterligare utvärdera kineticsen av hämning och dödande visat lovande kombinationer identifieras i screening scenen (manuell tid-kill metoden).

En av de vanligaste metoderna för in vitro-synergy testning är den schackrutiga array analysen, en ändring av minsta hämmande koncentration (MIC) testning där isolera den hämmande effekten av två olika antibiotika mot en bakterie testas över en rad koncentration kombinationer4,5. Om de två läkemedlen utöva större än additiv aktivitet när de används tillsammans, anses kombinationen synergistisk6. Dock innebär att inrätta en Schackrutor matrisen manuellt en rad beräkningar och att späda och pipettering steg som är mödosam och sårbara för mänskliga fel. Dessa begränsningar har haft begränsar användningen av synergy testning främst till retroaktiva utvärderingen av litet numrerar av antibiotika kombinationer och bakteriell isolat, och resultaten har inte alltid varit konsekvent mellan studier7, 8,9,10,11. Dessutom har komplexiteten i synergy testning bidragit till dess otillgänglighet i klinisk mikrobiologi laboratoriet och den faktiska frånvaron av in vitro-synergy testdata från kliniska studier av kombination terapi12, 13.

För att öka effektiviteten och genomströmning av metoden schackrutiga array, gjord vi använda av en automatiserad testning MIC-teknik som tidigare utvecklats i vårt laboratorium som använder inkjet trycktekniken till just och konsekvent avstå små volymer av antibiotika stamlösning i brunnar i en mikrotiter plattan14. Plattformen undanröjer behovet av komplexa beräkningar och flera pipettering steg. Den tillhörande programvaran beräknar och doserar lämpliga volymer av antibiotika för att skapa en tvådimensionell schackrutiga matris om användaren helt enkelt ingångar intervallet önskad koncentration och stamlösningens koncentration av antibiotika. Vi testat inledningsvis denna metod mot en samling CRE isolat15 och därefter har fokuserat på tester kolistin-innehållande kombinationer för aktivitet mot kolistin-resistenta isolat16. Kolistin är ett läkemedel som sista utväg vanligen reserverad för användning i behandling av MDR gramnegativa patogener17,18, och kolistin motstånd gör redan MDR bakterier nästan pan-resistenta19, vilket gör dem idealiska kandidater för utvecklingen av nya terapeutiska strategier använder droger som de är okänsliga individuellt. Vi fann att kombinationen av kolistin och den proteinsyntes hämmare antibiotika minocyklin hade en mycket hög frekvens av synergi, även mot stammar som var resistenta mot var och en av dessa droger individuellt, förmodligen eftersom kolistin utövar en subinhibitory permeabilizing effekt på ens kolistin-resistenta bakterier. Vi har valt denna kombination att använda som exempel i detta dokument. Notera, kan synergy testning också användas att utvärdera för förstärkt effekt av två mediciner som är både effektiva individuellt.

Automatiserad schackrutiga array metoden underlättar snabb, hög genomströmning synergy testning. Den schackrutiga array metoden har dock begränsningar. Det ger data bara på hämning av bakterietillväxt och inte på avlivning som en modifierad MIC analys, och det ger inte data på antibiotika effekter över tid. Däremot manuell prestanda av tid-kill synergy analyser är mer arbetskrävande men ger information om både hämning och dödande över en 24 h tid kursen20,21. Vi använde tid-kill analys på ett mindre antal isolat bekräfta vår schackrutiga array resultat och för att avgöra huruvida de synergistiska kombinationer som vi identifierade var också bakteriedödande.

Både schackrutiga array och tid-kill synergy metoder ger värdefull information om aktiviteten av läkemedelskombinationer och är särskilt användbart för att värdera potentiella nya behandlingsalternativ för högresistent bakteriella patogener. Metoderna har också inneboende begränsningar. Metoden standard microbroth utspädning MIC har en känd beräknade fel rad 1 dubbel utspädning22, som ökas när två läkemedel testas tillsammans i en schackrutiga matris. Standarddefinitionen av synergi, som anser en synergistisk kombination endast om droger är aktiva tillsammans på en fjärde deras respektive MICs6, tar hänsyn till detta förväntade variationer, men sådana variabilitet (som är tänkt att leda från en kombination av biologiska och tekniska växlingar23) oundvikligen genererar osäkert om synergy Resultatens tillförlitlighet. Avsaknaden av etablerade kvalitetskontroll standarder för provning av synergy är också en strömbegränsning. Kanske är den mest betydande begränsningen av alla synergy testmetoder avsaknaden av etablerade korrelationer mellan in vitro-resultat och kliniska resultat när kombinationer används för att behandla patienter24. Enklare och snabbare synergieffekter som testar metoder, såsom den automatisera schackrutiga array metod som beskrivs här, kan underlätta integrationen av in vitro-synergy provning inom kliniska prövningar eller andra utvärderingar av behandlingsresultaten för att bättre prägla förhållandet mellan in vitro- och in vivo effekter i framtiden.

Den automatisera schackrutiga array metod som vi presenterar här erbjuder ett alternativ för high-throughput screening av olika kombinationer och möjliggör snabb utvärdering av ovanliga, ”hög risk-hög belöning” kombinationer utan en större investering av tid och resurser. Metoden tid-kill, som vi därefter demonstrera, kan ge ytterligare stödjande information på kombinationen synergistisk aktivitet och kan hjälpa för att karakterisera dess baktericida och antibakteriella kinetik.

Protocol

Varning: Använda lämpliga säkerhetsrutiner med bakterier. Använd skyddshandskar och en labbrock hela tiden. Utföra arbete i en biosäkerhet skåp om aerosoler ska genereras eller arbetar med hög risk patogener.

Obs: Tjugo till 24 h innan experiment, strimma ut den bakteriella isolate(s) ska testas (från en koloni-renat, minimalt överförda lager fryst vid-80 ° C i tryptic soy buljong med 50% glycerol lager) på blodagar plåt. Inkubera plattan vid 35 ° C i luften.

1. bläckstråleskrivare-assisted automatiserade schackrutiga Array Synergy

  1. Gör antimikrobiell lager lösningar (kolistin och minocyklin).
    1. Bestämma antibiotika stamlösning koncentrationer baserat på lösligheten av antibiotika och önskade slutliga koncentrationer i schackrutiga matris. Gör 10 mg/mL bestånd av kolistin och minocyklin för detta exempel. Använda CLSI M100 dokumentet för att avgöra lämpliga lösningsmedel för varje antibiotika25. Både kolistin och minocyklin är vattenlösliga; eftersom D300 inkjet skrivaren kräver tillägg av tensid för korrekt vattenfasen vätska hantering, lös antibiotika i ultrarent avjoniserat vatten med 0,3% polysorbat 20.
    2. Väg in antibiotika pulver med en Analysvåg och beräkna volymen spädningsvätska som krävs för att få målet lager koncentration.
      1. Om antibiotika levereras som ett salt (kolistin sulfat, minocyklin hydroklorid) eller i hydrerad form (t ex meropenem trihydrat), eller om det rapporteras av tillverkaren ha mindre än 100% renhet, utföra en potens beräkning26 till Bestäm mängden spädningsvätska som krävs.
      2. Följa detta exempel av minocyklin hydroklorid med en angivna renhetsgrad på 900 mg/mg:
        Assay renhet: 900 mg/mg
        Vattenhalt: ingen
        Aktiva fraktionen: 0.926 (erhålls genom att dividera molekylvikten för minocyklin (457.48 Da) av molekylvikten för minocyklin hydroklorid (493.94 Da)).
        Styrka = (Assay renhet) * (1-vatteninnehåll) * (aktiva fraktionen)
        = (900 mg/mg) * (1) * (0.926) = 833.4 mg/mg eller 83.34%
        Sedan bestämma volymen spädningsvätska som krävs enligt följande:
        Volym (mL) = [vikt (mg) * potens (mg/mg)] ÷ [koncentration (mg/mL)]
        Så, till exempel om 34,7 mg minocyklin hydroklorid pulver är invägda, använda följande beräkning för att bestämma volymen spädningsvätska som krävs för att göra en 10 mg/mL lösning:
        Volym = (34,7 mg) * (833,4 mg/mg) = 2,89 mL
        10,000 mg/mL
    3. Antibiotiskt pulver och häll i en 15 mL konisk slang lämplig volym av vatten plus 0,3% polysorbat 20. Vortex tills upplöst.
    4. Alikvotens antibiotika stamlösning till 0,5 mL mikrocentrifugrör och förvaras vid-80 ° C tills klar för användning.
  2. Utföra kvalitetskontroll (QC) antimikrobiell lager för användning i schackrutiga array experiment minst en dag före synergy tester så att QC-resultat kan utvärderas innan du använder beståndet för synergy testning.
    OBS:    Den QC-teknik som beskrivs här är identisk med den teknik som skulle användas för minsta hämmande koncentration (MIC) testning av enskilda läkemedel och kan användas som sådana med några stammar av intresse för utredaren.
    1. Förbereda bakteriesuspensionen.
      1. Ta en alikvot av varje antibiotika lager ur frysen-80 ° C för att starta upptining medan du förbereder bakteriesuspensionen. Vortex tinade en gång för att antibiotika är i lösning.
      2. Välj en lämplig QC-stam och avgör intervallet godtagbar MIC för läkemedel testas utifrån tabell 5A-1 i CLSI M10025. Använd för droger här, E. coli ATCC 25922; MIC spänner för denna stam är 0,25-1 mg/mL för minocyklin och 0,25-2 mg/mL för kolistin.
      3. Välj en rad antibiotiska koncentrationerna att testa som kommer att omfatta hela QC sortimentet. Använda intervallet 0.0156 mg/mL till 8 mg/mL för minocyklin och kolistin för ATCC 25922.
      4. Tillsätt 1 mL 0,9% natriumklorid till ett 12 x 75 mm rund botten kultur glasrör. Välj en eller två kolonier från en övernattning platta av ATCC 25922 och vortexa försiktigt för att avbryta.
      5. Kontrollera koncentrationen av bakterier med hjälp av en McFarland läsare. Justera efter behov genom att lägga till fler 0,9% natriumkloridlösning eller mer bakterier att uppnå en 0.5 McFarland grumlighet läsning.
      6. Gör en 1:300 utspädning av 0.5 McFarland suspensionen genom att 30 mL katjon-justerade Mueller-Hinton buljong (CAMHB) i en 50 mL konisk röret för att nå en slutlig cell densiteten av 5 x 105 CFU/mL, 100 mL av suspensionen som rekommenderas av CLSI27.
      7. Använda en steril inoculating loop, isolering streak en droppe av den start inokulatet på blodagar plåt att bekräfta inokulum renhet och inkubera vid 35 ° C i luften.
    2. Lägg till antimikrobiella medel till en platt botten, torget-well, tydlig, obehandlade 384-well platta med D300. Utför det här steget om du omedelbart efter att förbereda bakteriesuspensionen så att suspensionen kan läggas till plattorna inom 15 min förberedelse26.
      1. Slå på den D300 bläckstråleskrivare och associerade datorn. Öppna programmet.
      2. Starta en ny fil. Ovanför bilden av rutnätet plattan, högerklicka på plattan 1 och välj Redigera plattan. Välj lämplig plåt typ (384 väl) och ytterligare volym (50 mL).
      3. Lägg vätskor (dvs antibiotika lager) protokollet genom att klicka på plustecknet bredvid vätskor på den vänstra panelen. Lägg till två vätskor (kolistin och minocyklin).
        1. Hovra över panelen som dykt upp vätska 1 och klicka på pennan att redigera. Namn vätskan ”kolistin”, ändra klass till ”vattenlösning + Tween 20”, ändra koncentrationen till 10.000 och ändra koncentrationen enheter till mg/mL (Observera att lager koncentrationen 10 mg/mL, dvs, 10,000 mg/mL). Lämnar dispensering by vid koncentration och lämna resten av fälten på standardinställningarna. Klicka på OK.
        2. Upprepa proceduren ovan för vätska 2 (minocyklin).
        3. Klicka på fliken Aktuella protokollet överst på skärmen och ändra koncentrationen (massa) till mg/mL att avgöra de enheter som används för slutlig väl antibiotiska koncentrationerna.
      4. Välj 10 brunnar i rutnätet genom att klicka och dra, klicka på titrering överst på skärmen. För Ange titrering med Välj högsta koncentration, för vätska välja kolistin, för Högsta koncentrationen ange 8 (kontrollera att enheterna är mg/mL), och för Distribution Välj 1:2 (50%). Lämna standard värdena i resten av fönstret och klicka på OK.
      5. Upprepa proceduren ovan för minocyklin att generera minocyklin titreringen.
      6. Spara protokoll, och klicka på knappen kör överst till vänster.
      7. Klicka på knappen starta . Lägg en plattan med 384 brunnar (med locket tas bort) i plåt hållaren och tryck Loaded under ”ladda plattan 1 – samverkan” snabb.
        Obs: Denna prompt väljs av programvaran och tyder inte på att synergy testning utförs. Placera en T8 + kassett på kassett kortplatsen och tryck Loaded under belastning en T8 + kassett prompt.
      8. När du uppmanas lägga till antibiotika stamlösning till de indikerade reservoarerna på kassetten. Följ instruktionerna på skärmen för korrekt lastning och fördela noggrant för att undvika att få eventuella bubblor i lösningen. Efter varje lösning läggs, tryck på knappen fyllda .
      9. När bläckstråleskrivare har lagt antibiotika lager i lämpliga volymer till varje brunn och rutan kör slutförda visas, klicka på Stäng, ta bort plattan och stänga av D300.
    3. Lägga till bakteriell suspensioner i plattan med 384 brunnar och inkubera plattan.
      1. Häll tidigare beredda bakteriesuspensionen i en steril reagens reservoir.
      2. Använd en flerkanalspipett för att lägga 50 mL av bakteriesuspensionen till alla antibiotika innehållande brunnar. Tillsätt 50 mL CAMHB utan bakterier till en tom brunn; Detta blir den negativa kontrollen väl att bekräfta sterilitet av media.
      3. Placera plattan i en inkubator med 35 ° C i luften och inkubera i 16-20 h26.
        Obs: En annan inkuberingens varaktighet kan krävas om organismer än Enterobacteriaceae testas; konsultera CLSI M10025 för organismen landsspecifika rekommendationer.
    4. Läs plattan på en microplate reader på en optisk densitet på 600 (OD600) och analysera resultaten.
      1. Använda ett kalkylbladsprogram, skugga celler med ett OD600 värde av ≥0.07 grön, vilket indikerar tillväxt och celler med värdet < 0,07 röd, vilket betyder ingen tillväxt.
        Obs: Dessa värden bestämdes baserat på visuell inspektion av tillväxt vs. ingen tillväxt och korrelation med OD avläsningar för dessa försök. OD600 mätvärden från brunnar som innehåller media ensam var genomgående lägre 0,07. Lämpliga cutoffs kan variera med olika plattan läsare och bakterier.
      2. Bestämma MIC för varje läkemedel. Mikrofonen är den lägsta koncentrationen av läkemedlet som bakterietillväxt hämmas. Om MIC är inom det förväntade intervallet QC enligt CLSI M100 dokument25stamlösning är lämpliga för användning.
  3. Förbereda bakteriesuspensionen schackrutiga array.
    1. Ta en alikvot av varje antibiotika lager ur frysen-80 ° C för att starta upptining medan du förbereder bakteriesuspensionen. Vortex tinade en gång för att säkerställa antibiotikum är i lösning.
    2. Lägga till ~ 1 mL 0,9% natriumklorid till ett 12 x 75 mm rund botten kultur glasrör. Välj en eller två kolonier från en övernattning platta av bakterier (i detta fall, E. coli -stam FDA-CDC 0494) och vortexa försiktigt för att upphäva dessa i 0,9% natriumklorid.
    3. Kontrollera koncentrationen av bakterier med hjälp av en McFarland läsare. Justera efter behov genom att lägga till fler 0,9% natriumkloridlösning eller mer bakterier att uppnå en 0.5 McFarland grumlighet läsning.
    4. Gör en 1:300 utspädning av 0.5 McFarland suspensionen genom att lägga till 100 mL av suspensionen CAMHB 30 mL i en 50 mL konisk röret för att nå en slutlig cell densiteten av 5 x 105 CFU/mL27.
  4. Lägg till antimikrobiella medel till en platt botten, torget-well, tydlig, obehandlade 384-well platta med D300.
    Obs:     utföra detta steg omedelbart efter att förbereda bakteriesuspensionen så att suspensionen kan läggas till plattorna inom 15 minuter från beredning26.
    1. Slå på bläckstråleskrivare, starta en ny fil och lägga till vätskor i protokollet som i steg 1.2.2.1-1.2.2.3.
    2. Generera synergi rutnätet.
      1. Klicka på ikonen Synergy överst på skärmen och gå igenom stegen. Välj två eller flera vätskor vägas tillsammansför typ . För plattanär det inte nödvändigt att utesluta eventuella brunnar; Klicka på Nästa på detta steg utan att göra ändringar.
      2. Ange den antibiotiska koncentrationerna och placering på fliken titrering .
        1. För att lägga till minocyklin i fallande fördubbling spädningar från 32 till 0,031 mg/mL, förutom en negativ brunn med inget antibiotikum, ner med y -axeln, ange 12 för titrering nivåer på den vänstra panelen. För att Ange titrering med hjälp, Välj högsta koncentrationen; för vätska, Välj minocyklin; för högsta koncentrationen, ange 32 (kontrollera att enheten är inställd på mg/mL; om det inte, stänga dialogrutan Synergy och ändra under fliken Aktuella protokoll ). Kontrollera att rutan Inkludera 0 värde är markerad. Ändra fördelning till 1:2 (50%).
        2. Upprepa dessa steg för kolistin på den högra panelen, med 12 titrering nivåer och en högsta koncentration av 16. Klicka på Nästa.
      3. På fliken Layout väljer du titrering nivåer av 2 första vätskor bestämma antalet rader och kolumner i en layoutrutnätet. Klicka på Nästa. Om rutnätet visas som förväntat, klicka på Slutför.
    3. Spara protokoll och sedan klicka på kör -knappen överst till vänster.
    4. Klicka på knappen starta . Lägg en plattan med 384 brunnar (med locket tas bort) i plåt hållaren och tryck Loaded under belastning tallrik 1 – Synergy prompt. Placera en T8 + kassett på kassett kortplatsen och tryck Loaded under belastning en T8 + kassett prompt.
    5. När du uppmanas lägga till antibiotika stamlösning till de indikerade reservoarerna på kassetten. Följ instruktionerna på skärmen för korrekt lastning och fördela noggrant för att undvika att få eventuella bubblor i lösningen. Efter varje lösning läggs, tryck på knappen fyllda .
    6. När D300 dispensern har lagt antibiotika lager i lämpliga volymer till varje brunn och rutan kör slutförda visas, klicka på Avsluta, ta bort plattan och stänga av D300.
  5. Lägga till bakteriell suspensioner i plattan med 384 brunnar och inkubera plattan.
    1. Häll tidigare beredda bakteriesuspensionen i en steril reagens reservoir.
    2. Använd en flerkanalspipett för att lägga 50 mL av suspensionen till alla brunnar i matrisen Schackrutor. Tillsätt 50 mL CAMHB utan bakterier till en tom brunn; Detta blir den negativa kontrollen väl att bekräfta sterilitet av media. Inkubera i en 35 ° C luften inkubator för 16-20 h26.
  6. Läs plattan på en microplate reader på OD600 och analysera schackrutiga array resultat.
    1. Först, kontrollera renhet plattan och se till att de isolerade kolonierna av en enda morfologi som är konsekvent med den förväntade morfologin av organismen som testas.
    2. Använda ett kalkylbladsprogram, skugga celler för att indikera tillväxt och ingen tillväxt som i steg 1.2.4.1.
    3. Bestämma MIC för varje läkemedel. För en drog som inte hämmar bakterietillväxt vid den högsta koncentration som testats, anses MIC vara off-skalan.
    4. För varje brunn där tillväxten hämmas, bestämma fraktionerad inhibitoriska koncentrationen (FIC) för varje antibiotikum baserat på det antibiotikum MIC (se figur 1B och figur 2B).
      Obs: FIC är förhållandet mellan koncentrationen av antibiotika i en brunn där tillväxten hämmas till dess mikrofon; så för en drog med en mikrofon på 8 mg/mL, en väl innehållande 8 mg/mL av att drogen har en FIC 1, medan en väl innehåller 4 mg/mL har en FIC 0,5.
    5. Beräkna fraktionerad hämmande koncentration (FICjag) indexvärdet för varje brunn där tillväxten hämmas som summan av FICs av narkotika i den brunnen.
    6. Fastställa den lägsta FICjag där tillväxten är hämmad (minsta FICjag). Om den minsta FICjag är £0.5, överväga kombinationen synergistisk; om 0,5-4, överväga kombinationen likgiltig; och om > 4, överväga kombinationen antagonistiska. Om kombinationen är synergistiska på vissa koncentration kombinationer men antagonistiska på andra, observera detta resultat men tänk kombinationen övergripande antagonistiska.

2. tid-kill Synergy testning

  1. Gör antimikrobiell lager lösningar. Om det här steget utförs före experimentet, frysa bestånd vid-80 ° C tills klar för användning.
    1. Bestämma antibiotika stamlösning koncentrationer baserat på lösligheten av antibiotika och önskade slutliga koncentrationer i tid-kill studier. I det här exemplet gör kolistin och minocyklin bestånd på en koncentration av 1 mg/mL. Använda CLSI M100 dokumentet för att avgöra lämpliga lösningsmedel för varje antibiotika25. Använd vatten, som rekommenderas, för både kolistin och minocyklin.
    2. Väg in antibiotika pulver använder Analysvåg och beräkna volymen spädningsvätska som krävs för att få målet lager koncentration. Utför en potens beräkning före att fastställa mängden spädningsvätska som krävs, enligt beskrivningen i steg 1.1.2.1 ovan vid behov.
    3. Antibiotiskt pulver och häll i 15 mL koniska rör lämplig volym av vatten. Vortex tills upplöst.
  2. Med manuell buljong microdilution metoden som beskrivs i CLSI M0726, utföra en kvalitetskontroll av antimikrobiell lager för användning i tid döda synergy experiment. Utför det här steget minst en dag före synergy tester så att QC-resultat kan ses innan du använder beståndet.
    1. Välj en lämplig QC-stam och avgör intervallet godtagbar MIC för läkemedel testas utifrån tabell 5A-1 i CLSI M10025. Använd för droger här, E. coli ATCC 25922; MIC spänner för denna stam är 0,25-1 mg/mL för minocyklin och 0,25-2 mg/mL för kolistin.
    2. Förbereda antibiotikum innehållande buljong microdilution plattor.
      1. Välj den högsta koncentrationen av antibiotika ska testas så hela QC sortimentet kan ingå. Använda en rad 0,016 till 8 mg/mL för minocyklin och kolistin för ATCC 25922.
      2. Späd antibiotika bestånden till en fungerande lösning i CAMHB två gånger den högsta koncentration som behövs (eftersom det blir utspädd 1:1 med upphävandet av bakterier). I det här exemplet späd båda bestånden från 10 mg/mL till 16 mg/mL.
      3. Använda en flerkanalig pipett, tillsätt 100 mL av varje 2 x antibiotika suspensioner i en brunn i den första kolumnen i en tydlig, runda-botten, obehandlade plattan med 96 brunnar och tillsätt 50 mL vanlig buljong (dvs. utan antibiotikum) till varje brunn de efterföljande kolumnerna.
      4. Ta bort 50 mL antibiotikum innehållande buljong från varje väl i den första kolumnen och lägga till brunnarna i den andra kolumnen. Pipettera upp och ner flera gånger för att blanda innehållet, genererar en antibiotikakoncentrationen hälften som koncentration i den första kolumnen.
      5. Upprepa steg 2.2.2.4 med varje kolumn, så att en rad seriespädningar två gånger, med en volym på 50 mL, är beredd. Förändring pipett tips mellan varje utspädningssteg om önskas för att eliminera möjligheten av antibiotika överföring. Observera att de resulterande koncentrationerna är alla fortfarande 2 x de slutliga koncentrationerna, som de kommer därefter att utspädd 1:1 med bakteriesuspensionen.
      6. Lägg inte till något antibiotikum i de sista två spalterna, eftersom dessa kommer att vara negativa och tillväxt kontroll kolumnerna.
    3. Förbereda bakteriesuspensionen.
      1. Förbereda en 0.5 McFarland avstängning från en övernattning platta av E. coli ATCC 25922 i 0,9% natriumkloridlösning enligt beskrivningen i steg 1.2.1.5-1.2.1.6.
      2. Gör en 1:150 utspädning av 0.5 McFarland suspensionen genom att lägga till 50 mL av suspensionen 7,5 mL CAMHB.
        Obs: Slutliga bakteriesuspensionen blir utspädda 1:300 när den blandas 1:1 med antibiotika lösningen, att nå CLSI-Rekommenderad cell densiteten av 5 x 105 CFU/mL27).
    4. Lägga till bakterier i mikroplattan och inkubera.
      1. Tillsätt 50 mL bakteriesuspensionen till varje brunn, utom i kolumnenth 11. Tillsätt 50 mL av CAMHB till de 11th kolumnen (negativ kontroll).
      2. Inkubera plattan vid 35 ° C för 16-20 h.
        Obs: En annan inkuberingens varaktighet kan krävas om organismer än Enterobacteriaceae testas; konsultera CLSI M10025 för organismen landsspecifika rekommendationer.
      3. Läs plattan för tillväxt visuellt med hjälp av genomlysning och, för varje antibiotikum, bestämma den lägsta koncentration som där finns det ingen tillväxt. Detta är MIC. Konsultera CLSI M07 dokumentet för ytterligare information om visuell tolkning av MIC26. Om MIC är inom det förväntade intervallet QC, är stamlösning lämpliga för användning.
  3. Börja första kultur.
    1. Göra en 0.5 McFarland suspension av testorganismen i steril 0,9% NaCl som beskrivs ovan.
    2. Tillsätt 100 mL av den 0,5 McFarland suspension 5 ml av CAMHB i ett 25 x 150 mm glas runt botten kultur rör med rostfritt stål stängning och vortexa försiktigt för att blanda.
    3. Använda en steril inoculating loop, isolering streak en droppe av den utspädda suspensionen på blodagar plåt att bekräfta inokulum renhet och inkubera vid 35 ° C i luften.
    4. Ersätta stängning på röret och inkubera i ett provrör rack på en shaker vid 35 ° C i luften för minst 3 h, tills logaritmisk-fas tillväxt uppnås (se steg 2.6.1). Fortsätt till steg 2,4 medan kulturen är i inkubatorn.
  4. Förbereda antimikrobiella lösningar i 25 x 150 mm glasrör kultur.
    1. Ta ut antimikrobiell lager alikvoter från-80 ° C frys Tina. Vortex tinade en gång för att säkerställa antibiotikum är i lösning.
    2. Medan första kultur ruvning, tillsätt 10 mL av CAMHB till fem Ånghärdad 25 x 150 mm glasrör kultur och Lägg till antimikrobiell lager lösningar enligt följande.
      Obs: För en synergi studie, minst ett läkemedel bör vara i en koncentration som inte påverkar tillväxten kurva individuellt28; Detta kan bestämmas genom att utvärdera effekterna av enskilda läkemedelskoncentrationen före studien synergy.
      1. Rör 1: Tillsätt lämplig mängd antibiotika #1 att få målet slutligt antibiotikakoncentrationen. I det här fallet, tillsätt 10 mL av 1 mg/mL kolistin lager att erhålla en slutlig kolistin koncentration av 1 mg/mL, eftersom detta är en koncentration som är ineffektivt mot den stam som används i detta exempel.
      2. Rör 2: Tillsätt lämplig mängd antibiotika #2 att antibiotika slutkoncentration som ska testas. I det här fallet, tillsätt 10 mL av 1 mg/mL minocyklin lager att erhålla en slutlig koncentration av 1 mg/mL, en koncentration som är ineffektivt mot den stam som används i detta exempel.
      3. Rör 3: Lägga till samma mängd antibiotika #1 och antibiotikum #2 som används i rör 1 och 2. I det här fallet, tillsätt 10 mL av 1 mg/mL minocyklin lager och 10 mL av 1 mg/mL kolistin lager.
      4. Rör 4: Lägga till ingen antibiotika. det blir tillväxt kontroll röret.
      5. Tube 5: Lägga till ingen antibiotika. Detta kommer att vara negativ kontroll röret.
  5. Förbereda 96 djupt väl polypropylen plattor med 2 mL brunnar för seriespädningar genom att lägga till 900 µL steril 0,9% natriumkloridlösning B-H rader av kolumnerna 1-5 med en flerkanalspipett.
  6. Förbereda start inokulum och lägga till rören.
    1. När den ursprungliga kulturen har nått logaritmisk tillväxtfas (~ 3 h för Klebsiella pneumoniae, organismen används i detta exempel), ta bort kultur röret från shakern, överföra vortex försiktigt, ~ 1 mL suspension till ett 12 x 75 mm för kultur av glasrör, och Kontrollera täthet med en McFarland läsare.
      1. Om det är mindre än 1.0 McFarland, tillbaka röret till shaker och ruva längre. Om det är större än 1.0 McFarland, lägga till CAMHB till röret, vortex försiktigt, och åter prova, upprepa processen tills suspensionen är på 1.0 McFarland.
    2. Tillsätt 100 mL av 1.0 McFarland suspensionen rör 1-4 och vortexa försiktigt.
  7. Prova på alikvoter från varje kultur och utföra seriell tiofaldig utspädningar.
    1. Vid tidpunkt 0 (omedelbart efter att bakterier till rören) och vid 1, 2, 4, 6 och 24 h, ta bort en 150 mL alikvotens från varje kultur rör genom att vinkla röret så att endast sterila pipettspetsen skriver in röret och inte osterila vi rekommenderar axeln under alikvotens uttag. Lägga till alikvoter, respektive i rad brunnar i den första raden av tidigare beredda 96 djupt väl plattan. Tillbaka rören till ett provrör rack på en shaker i en inkubator med 35 ° C i luften omedelbart efter bort alikvoter vid varje tidpunkt.
    2. Med hjälp av en flerkanalspipett, avlägsna 100 mL från rad A, Lägg till rad B (som innehåller 900 mL 0,9% natriumklorid) och Pipettera upp och ner 4 - 5 gånger till mixen, skapa en 1:10 utspädning. Kassera tips efter varje utspädningssteg för att förhindra överföring av bakterier, vilket kan leda till falskt förhöjda kolonin räknas.
    3. Upprepa steg 2.7.2 för rader B-H med nya pipettspetsar för varje rad.
  8. Plattan utspädda prover för kolonin räknas använder de släppa platta metod29,30.
    1. Etiketten Mueller-Hinton agarplattor med antibiotika villkor och spädning till vara klädd.
    2. Med hjälp av en flerkanalspipett och extra långa tips (för att säkerställa att nå tips till suspension), ta bort 10 mL från varje brunn i kolumn ett och fördela försiktigt i rad på lämpligt märkta plattan. Om små (diameter 100 mm) plattor används, Dispensera 3 rader (varje bestående av droppar från A-H rader med en enda kolumn) per platta; på stora (150 mm diameter) tallrikar, fördela 8 rader per platta.
    3. Låt dropparna torka helt (~ 15 min).
    4. På 24 h, placera en 10 mL droppe tas direkt från negativ kontroll röret i en anvisad plats i en av plattorna att testa för sterilitet. Invertera plattorna och inkubera över natten vid 35 ° C i luften.
  9. Räkna kolonier och beräkna cell densiteten. Markera kolonier med en böter-tip permanent spritpenna på baksidan av plattan att undvika dubbelräkning eller saknas kolonier.
    1. Först, kontrollera renhet plattan och se till att de isolerade kolonierna av en enda morfologi som är konsekvent med den förväntade morfologin av organismen som testas.
    2. För varje utspädning serie, identifiera droppar med 3-30 kolonier (vanligtvis en droppe per Spädningsserien). Räkna kolonierna i dessa droppar och anteckna antalet tillsammans med utspädningsfaktorn.
      1. Om det finns inga droppar i en utspädning serie med 3-30 kolonier, räkna kolonierna i den sista droppen med > 30 kolonier och första droppe med < 3 kolonier (dessa bör intilliggande droppar).
    3. För varje utspädning serie, beräkna antal kolonibildande enheter per milliliter (CFU/mL) i urvalet baserat på antalet kolonier i rullgardinsmenyn med följande formel: CFU/mL = n(1 /d) (100) där n är antalet kolonier, d är utspädningsfaktorn (1 för outspädd prov (rad A), 0,1 eller 10-1 för den första 1:10 utspädning (rad B), 0,01 eller 10-2 för den andra 1:10 utspädning (rad C), och så vidare, och de konstant 100 kontona för faktumet som den totala volymen av tappar jag s 10 mL, medan det slutliga värdet uttrycks i CFU/mL, dvs, CFU/1000 mL. Använda ett kalkylblad som innehåller formler som beräknar CFU/mL från kolonin räknas att förenkla denna process.
      1. För utspädning serien där mer än en droppe var räknebart (eller där två droppar hade räknas eftersom ingen droppe föll i intervall), den genomsnittliga slutliga CFU/mL räkningarna för alla räknade droppar.
      2. Eftersom den lägre detektionsgräns är 300 CFU/mL (3 kolonier i den outspädda droppe), posten och tomt kolonin count som £300 CFU/mL för utspädning serie där det finns < 3 kolonier i den outspädda droppe.
    4. Inspektera de sterilitet kontroll droppe från tid 24; om någon tillväxt i detta släpp, bör resultaten av experimentet inte användas.
  10. Diagram och analysera resultaten.
    1. Rita tillväxtkurvor från tre antibiotikum innehållande kulturer och kontrollen tillväxt i samma graf. Rita tid på x -axeln och CFU/mL, använda en logaritmisk skala, på y -axeln.
    2. Beräkna skillnaden i CFU/mL mellan kombination röret på gång 24 och den mest aktiva monoterapi 24 som helst. Om skillnaden är ≥ 2 log10, överväga kombinationen synergistisk. Sedan beräkna skillnaden i CFU/mL mellan kombination röret helst 24 och tid 0. Om skillnaden ligger ≥3 log10, överväga kombinationen bakteriedödande.

Representative Results

Figur 1A visar ett rutnät från en schackrutiga array synergy experiment i vilka minocyklin i koncentrationer av 0-32 μg/mL var kombinerat med kolistin vid koncentrationer på 0-16 μg/mL och testats mot E. coli stam FDA-CDC 0494. Värdena representerar spektrofotometrisk avläsning vid optisk densitet 600 nm (OD600). Brunnar med OD600 värden under 0,07 (vilket motsvarar ingen tillväxt genom okulärbesiktning) är skuggade röda, medan brunnar med OD600 värden 0,07 (vilket motsvarar tillväxt genom okulärbesiktning) är skuggade green. För varje läkemedel är den minsta hämmande koncentrationen (MIC; fetstil) den lägsta koncentrationen av läkemedlet som hämmar bakterietillväxt. Detta är 32 μg/mL för minocyklin, och kolistin, är det 8 μg/mL. Skuggningen sparas i figur 1B, men värden inom brunnarna där tillväxten hämmas ersätts av fraktionerad hämmande koncentration (FICjag) indexvärden. Dessa bestäms enligt följande: i varje brunn, fraktionerad hämmande koncentration index (FIC) för varje läkemedel beräknas genom att dividera koncentrationen av antibiotika i det brunnen med drogens MIC och den FICjag beräknas genom att summera de två FICs. Brunnar med en FICjag värdet 0,5, som anses cutoff för synergi, indikeras med en bruten kantlinje, och brunnen med lägsta FICjag värdet (0.094) är i fetstil. Eftersom FICjag minimivärdet är i intervallet synergistisk, betraktas kombinationen synergistisk.

Figur 2A och figur 2B Visa stödraster motsvarande dem i figur 1A och figur 1B, men i detta fall kombinationen visar inte samverkan mot isolatet testade (K. pneumoniae isolatet BIDMC 4), eftersom den minsta FICjag där tillväxten hämmas är 1, vilket är > 0,5.

Figur 3 illustrerar Absorbansavläsningar från ett schackbräde synergy rutnät där inträffat flera överhoppade wells (Enterobacter cloacae komplex isolat BIDMC 27). Överhoppade brunnar är brunnar där bakterietillväxt hämmas trots närvaron av bakterietillväxt i intilliggande brunnar med högre koncentrationer av antibiotika. Detta fenomen, som kallas uppstå i MIC Standardtester samt, beror sannolikt på biologisk variabilitet i bakterietillväxt egenskaper från bra till väl och att känsligheten för vissa antibiotika till små skillnader i bakteriell inokulum23 , 31 , 32. om mer än en hoppade väl inträffade i en schackrutiga matris, vi resultaten och upprepade analysen.

Figur 4 presenterar exempel på tid-kill synergy resultaten av tre kombinationer prövats mot K. pneumoniae isolera BIDMC 32. Kolonin räknas anges i en logaritmisk skala på y-axeln och tid, i timmar, på x-axeln. Skillnaden mellan det start inokulatet i röret som innehåller kombinationen läkemedel och koncentrationen av bakterier i att röret vid 24 h illustreras av den röda stapeln och antal, medan skillnaden mellan koncentrationen av bakterier på 24 h mellan röret innehållande kombinationen och röret som innehåller mest aktiva enda agenten ensam illustreras av den blå stapeln och antal. Figur 4A visar resultat från kombinationen av kolistin och minocyklin; Denna kombination var synergistisk (skillnaden mellan koncentrationerna av bakterier som utsätts för kombination och mest aktiva agent ensam ≥2 log10 CFU/mL vid 24 h) och bakteriedödande (nedgång från start inokulum koncentrationen på 24 h ≥3 log10 CFU/mL). Figur 4B visar resultat från kombinationen av kolistin och klindamycin, en kombination som var synergistisk men var inte bakteriedödande. Denna kombination hämmade tillväxten av bakterier, som varken drogen gjorde ensam, men inte döda dem. Figur 4 c visar resultat från kombinationen av kolistin och erytromycin, som var varken bakteriedödande eller synergistisk.

Figure 1
Figur 1: Schackrutor array resulterar demonstrerande synergy (minocyklin + kolistin testats mot E. coli stam FDA-CDC 0494). (A) spektrofotometrisk avläsning och tillväxt tolkning av en schackrutiga array. Värden i cellerna är Absorbansavläsningar på 600 nm (OD600). Celler med OD600 värden under 0,07 (motsvarande ingen tillväxt genom okulärbesiktning) är skuggade röda, medan celler med OD600 värden 0,07 (motsvarande tillväxt genom okulärbesiktning) är skuggade green. (B) fraktionerad hämmande koncentration (FICjag) indexberäkning. Skuggning anger tillväxt eller ingen tillväxt har behållits. Värden för kolistin och minocyklin längs x- och y-axlarna, respektive nu representera fraktionerad inhibitoriska koncentrationen (FIC) eller förhållandet mellan koncentrationen av drogen i kolumnen eller raden till den minsta hämmande koncentration ( MIC) av detta läkemedel ensamt. Värdet i varje cell är den FICjag, eller summan av FICs av två droger i den brunnen. Den stora brutna linje-gränsas rutan omsluter brunnar med en FICjag 0,5. Tjock-gränsas cellen anger brunnen med den lägsta FICjag där tillväxten hämmas eller den minsta FICjag. Eftersom den minsta FICjag är 0,5, betraktas kombinationen synergistisk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schackrutor array resultat av en kombination som inte visar synergy (minocyklin + kolistin testats mot K. pneumoniae isolera BIDMC 4). (A) optiska densitet värden på 600 nm och tillväxt tolkning av schackrutiga array resultat enligt figur 1A. (B) fraktionerad hämmande koncentration (FICjag) indexberäkning enligt figur 1A. Eftersom den minsta FICjag är > 0,5, kombinationen anses inte synergistisk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schackrutor array resultat som är tack vare hoppade brunnar som är (minocyklin + kolistin testats mot Enterobacter cloacae komplexa isolera BIDMC 27). Optisk densitet värden på 600 nm och tillväxt tolkning av schackrutiga array resultat enligt figur 1A. Flera överhoppade brunnar, där bakterietillväxt hämmas trots närvaron av tillväxt i intilliggande brunnar med högre koncentrationer av antibiotika, demonstreras. Resultaten är inte tolkningsbara och experimentera behöver upprepas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Tid-kill synergy resultaten av tre kombinationer prövats mot K. pneumoniae isolera BIDMC 32. Kolonin räknas anges i en logaritmisk skala på y-axeln och tid, i timmar, på x-axeln. Skillnaden mellan koncentrationen av bakterier i kombinationen på 24 h och det börjar inokulatet i röret illustreras av den röda stapeln och antal. Om nedgången från start inokulum koncentrationen på 24 h är ≥3 log10 CFU/mL, anses kombinationen bakteriedödande. Skillnaden mellan koncentrationen av bakterier på 24 h mellan röret som innehåller kombination och röret som innehåller mest aktiva enda agenten ensam illustreras av den blå stapeln och antal; om det finns ≥2 log10 CFU/mL minskning, anses kombinationen synergistisk. (A) kolistin (CST) + minocyklin (MIN), en kombination som är både synergistisk och bakteriedödande. (B) kolistin + klindamycin (CLI), en kombination som är synergistiska men inte bakteriedödande. (C) kolistin + erytromycin (ERY), en kombination som är varken synergistisk eller bakteriedödande. Dessa resultat publicerades ursprungligen som en del av en studie av synergistisk aktivitet kolistin-innehållande kombinationer mot kolistin-resistenta Enterobacteriaceae, där vi visat att kolistin var synergistiskt med ett antal antibiotika som är aktiva individuellt endast (e.g. klindamycin) eller primärt (t.ex. erytromycin) mot grampositiva bakterier16. (Observera att erytromycin var synergistisk av schackrutiga array mot den stam som visas, men inte av tid-döda, så det har valts här som ett exempel på en icke-synergistisk kombination.) Vi hade en hypotes som kolistin, som är kända för att agera av permeabilisering av gramnegativa yttre membranet, utövar en sub-hämmande permeabilizing effekt på kolistin-resistenta Gramnegativa bakterier, att tillåta införsel av läkemedel såsom klindamycin som normalt kan inte ange gramnegativa cellen. Panel (A) av denna siffra har ändrats från Brennan-Krohn, Pironti och Kirby 201816, copyright © American Society for mikrobiologi, antimikrobiella medel och kemoterapi, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

De två metoder som beskrivs här ger båda information om aktiviteten av antimikrobiella medel i kombination jämfört med deras individuella aktivitet. Den automatiserade, bläckstråle skrivare-assisted digitalt dispensering metod är en anpassning av den metod som beskrivs i den klinisk mikrobiologi förfaranden handbok33, medan metoden tid-kill följer närmare motsvarande protokollet från samma referera till34.

I metoden schackrutiga array beräkningar för att bestämma volymen som behövs av antimikrobiell lager att lägga till varje brunn samt munstycket av dessa volymer är automatiserad, vilket eliminerar några av de stora potentiella källorna till fel i en handbok schackrutiga matris. Men är det fortfarande viktigt, att utredaren bestämmer att ursprungliga bestånd görs vid den planerade koncentrationen och att målet slutliga koncentrationer är korrekt angivna i programvaran D300. Lägga till antimikrobiell suspensionen till brunnar i en plattan med 384 brunnar kan vara svårt i början och kräver vård för att säkerställa att pipett tips ange lämpliga brunnar och att vätska splash upp inte kanterna av brunnarna. En automatiserad flytande hanterare kan användas istället för en handhållen flerkanalspipett för att öka hastighet och precision med vilken bakteriesuspensionen tillsätts brunnar. Som beskrivs i protokollet, kräver D300 tillägg av tensiden, polysorbat 20 (P-20), för rätt vätskehantering. En annan tensid, polysorbat 80, med en koncentration på 0,002%, har noterats för att sänka kolistin mikrofoner för organismer med kolistin mikrofoner av < 2 µg/mL i standard buljong microdilution analyser. 35 , 36 vårt laboratorium tidigare visat att P-20 vid koncentrationer upp till 0,0015% hade ingen effekt på D300-assisted MIC resultat i jämförelse med referera BMD14. I assay exempel presenteras här, är den maximala P-20 koncentration är 0,0014%.

Ett problem vi stött på med några Schackrutor array-analyser var ett stort antal överhoppade brunnar. Detta skedde i en oproportionerlig takt med vissa antibiotika. Specifikt, i en skärm av kombinationer mot en samling av karbapenemresistenta Enterobacteriaceaekonstaterade vi att medan 49 521 prövningar (9,4%) var obrukbar på grund av flera överhoppade brunnar, 2 12 antibiotika testats (fosfomycin och cefepime) svarade för 46 i dessa prövningar (94%). Sådana ökade priser kan vara vanligare i läkemedel som är särskilt mottagliga för de inokulum effekt31,32,37. Notera rekommenderar inte CLSI testning fosfomycin i buljong utspädning25 på grund av farhågor om resultatens tillförlitlighet med denna metod, vilket kan förklara de otillförlitliga resultat ses med detta läkemedel. Vissa ändringar kan göras till automatiserade schackrutiga metod enligt utredaren preferens. Antimikrobiella medel kan doseras i plattor som redan innehåller bakteriesuspensionen, snarare än i tomma brunnar, om detta är att föredra på grund av arbetsflöde inom laboratoriet. Medan 384 brunnar användes här, kan metoden också utföras i plattan med 96 brunnar analyser med lämplig modifiering av väl volym. Användning av ett plattan med 96 brunnar format kan hjälpa att minska överhoppade brunnar för antibiotika som är särskilt känslig för små förändringar i inokulum. Vid beräkning av FICjag, kan det finnas situationer där MIC off-skalan (dvs, högre än testas), inbegripet situationer där medlet prövas har ingen aktivitet individuellt mot typ av organismen som testas. I dessa fall kan FIC beräknas baserat på förutsatt att MIC är en spädning högre än den högsta koncentration som testats. Detta är den mest konservativa strategin, eftersom den förutsätter maximal möjlig FIC värdet för utspädning där hämning observeras under synergy testning. Till exempel om den faktiska MIC var istället två fördubbling utspädningar ovan den högsta koncentrationen testade, då de motsvarande FICs skulle vara två gånger lägre än den konservativa uppdrag, och så vidare.

För att korrekt bedöma baktericida aktiviteten av läkemedel i en tid-döda-analys, är det väsentligt att kulturer är logaritmisk-fas tillväxt, särskilt när cellväggen aktiv antibiotika testade28. För de snabbt växande bakterier används i detta exempel (K. pneumoniae), 3 timmars inkubation med skakningar var lämpligt att nå denna tillväxtfas, men olika lång tid kan behövas för olika organismer. I allmänhet bör kulturen visas synligt men inte kraftigt grumlig. Lämplig mängd tid kan bestämmas genom att konstruera en tillväxtkurva med kolonin räknas vid seriell tid punkter (t.ex. varje 30 min för 4-6 h)38. Det avsedda start inokulatet i tid-kill studien är också viktigt. Målet koncentrationen av de startande inokulatet är ca 5 x 105 till 1 x 106 CFU/mL. Den utspädning som beskrivs här (100 μL av en 1.0 McFarland suspension i 10 mL av media) genererar detta inokulum för Klebsiella pneumoniae och andra Enterobacteriaceae arter som vi har testat den. Om densiteten av de startande inokulat i ett experiment med olika organismer är betydligt högre eller lägre än detta, kan sedan en annan utspädning behövas. (Lämplig spädning krävs för en given art kan bestämmas genom att utföra ett antal av en 0,5 eller 1,0 McFarland suspension att avgöra hur många organismer denna grumlighet representerar, sedan beräkna det belopp som den ursprungliga suspensionen måste vara (utspädd för att nå lämpliga slutliga koncentration.) Om, på granskning av plattan räknas från synergy studien, det start inokulatet av någon av antibiotikum innehållande rören har varit betydligt lägre än det start inokulatet tillväxt kontroll, detta kan tyda på antingen antibiotika överföring eller mycket snabb avlivning av bakterier under den korta tid mellan tillägg av bakterier till antibiotikum innehållande röret och borttagning av alikvoten för plätering. Om det faktiska antalet kolonier i den outspädd droppe i en serie är lägre än antalet kolonier i efterföljande spädningar, föreslår detta antibiotikum kvarstående effekter. Olika alternativ har beskrivits för att förhindra denna effekt, inklusive sprida ett enda delprov över en hela plattan38 eller spinning ner provet, ta bort supernatanten och nytt uppehåll i steril koksaltlösning före plätering39. Vid varje tidpunkt i metoden tid-döda är det också avgörande för utredaren att effektivt men noggrant bort en alikvot från varje kultur rör och utföra seriespädningar. Förseningar under denna process, särskilt under tidig tidpunkter som förekommer i nära följd, kan leda till längre perioder under vilka kulturer inte är varit inkuberas och skakas, medan slarvig dispensering och seriespädningar kan leda till felaktig plattan räknar. Jämfört med plattan spridningsmetoden plattan räknar, där 100 μL av varje utspädning är spridda över en hela agarplatta, släppa plattan metoden som beskrivs är långt mer snabb, kräver ett mycket mindre antal agarplattor, och möjliggör snabbare räkna, som maximalt räknebart antal kolonier för varje droppe är 30, medan upp till 300 kolonier kan normalt räknas från en spridning tallrik. Men är plattan spridningsmetoden också ett alternativ om utredarna är mer bekväm med denna teknik. Om droppar sprids in i varandra efter dispensering med en flerkanalspipett, kan mottagarspecifik tillämpning av mer brett placerade droppar med en enkanalig pipett utföras istället. I vår erfarenhet verkade kylning plåtar vid 4 ° C före dispensering droppar minska överdriven spridning.

En begränsning av de tekniker som beskrivs här är att resultaten av de två typerna av synergy assay (schackrutiga array och tid-döda) är inte alltid samstämmiga, och eftersom mest publicerade synergy artiklar använder en metod eller andra snarare än båda tillsammans, det kan vara svårt att veta hur man kan integrera data från två typer av analyser. Eftersom den automatisera schackrutiga array metod vi utvecklat är enkel och hög genomströmning, vi har använt det i praktiken som en slags skärm att testa kombinationer mot ett större antal isolat och avgöra vilka koncentrationen kombinationer var synergistisk. Vi genomförde då ett mindre antal tid-kill studier, välja kombinationer och koncentrationer som hade varit effektiva i matrisen Schackrutor. Att notera, eftersom schackrutiga analysen utförs normalt i microbroth utspädning skala, medan tid-kill analysen använder större volymer (liknar en macrobroth utspädning), Vi hittade att FICs ibland var olika mellan de två metoderna, med högre koncentrationer som allmänt krävs i tid-döda-analysen att påvisa aktivitet. Detta fenomen har noterats tidigare när macrobroth och microbroth utspädning MIC analysens resultat jämförs för gramnegativa baciller26 och när större inokulat (som används i tid-kill studier) jämförs med den standard inokulum som används i microbroth utspädning och schackrutiga array-analyser32. En viss begränsning av schackrutiga matrisen är det inneboende variabilitet i microbroth utspädning MIC testning22. Samtidigt FICjag avbrytandear för synergy-konto för denna variation matematiskt6 sådana variabilitet oundvikligen väcker oro över tillförlitlighet och konsekvens av schackrutiga array resultat.

På grund av begränsningarna inneboende till alla in vitro-synergy testmetoder (inklusive odling av bakterier i ett artificiellt odlingsmedium, statisk antibiotiska koncentrationerna och en begränsad tid kurs), resultaten av dessa metoder måste bekräftas och vidare utvärderas med hjälp av kompletterande tekniker. Sådana metoder inkluderar in vitro-farmakokinetiska/farmakodynamiska (PK/PD) studier (t.ex. den ihålig fiber infektion modell40), djurmodeller, och, slutligen, PK/PD och effekt humanstudier. Den automatisera schackrutiga array metod som beskrivs här, genom att förse skärmen kombinationer för potentiella synergistisk aktivitet, en snabb metod som möjliggör mer riktad användning av dessa tekniker. Ytterligare automatisering av alla dessa metoder, som väl som mer systematisk undersökning av förhållandet mellan in vitro-parametrar och kliniska resultat, blir viktigt för skalning upp användningen av synergy testning och öka dess kliniska tillämpligheten.

Disclosures

De D300 Digital Dispenser och tillhörande förbrukningsvaror tillhandahölls av Tecan (Morrisville, NC). Tecan hade ingen roll i studiedesign, data insamling och tolkning, manuskript förberedelse eller beslut om att offentliggöra.

Acknowledgments

Thea Brennan-Krohn stöddes av en Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och mänsklig utveckling pediatric infektionssjukdomar forskning utbildning grant (T32HD055148), en nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar utbildning grant ( T32AI007061), en Boston Children's Hospital Office av fakulteten utveckling fakulteten karriärutveckling gemenskap och en nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar karriär utveckling award (1K08AI132716). J.E.K. stöddes av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar av det nationella Institutes of Health award nummer R33 AI119114. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management. Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).
  2. Spellberg, B. The future of antibiotics. Critical Care. 18 (3), (2014).
  3. Spellberg, B., et al. The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).
  4. Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).
  5. Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).
  6. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).
  7. Zusman, O., et al. Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).
  8. Clock, S. A., et al. In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).
  9. Hirsch, E. B., et al. Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae. Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).
  10. Tängdén, T., et al. Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).
  11. Tascini, C., et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).
  12. Paul, M., et al. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).
  13. Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).
  14. Smith, K. P., Kirby, J. E. Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).
  15. Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology. J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).
  16. Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  17. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).
  18. Nation, R. L., Li, J. Colistin in the 21st century. Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).
  19. Ah, Y. -M., Kim, A. -J., Lee, J. -Y. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).
  20. Bratu, S., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).
  21. Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).
  22. MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing. Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).
  23. Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance. Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).
  24. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  25. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  26. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).
  27. Clinical and Laboratory Standards Institute. M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  28. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 7 (1999).
  29. Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests. Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).
  30. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  31. Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology. Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).
  32. Smith, K. P., Kirby, J. E. The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  33. Leber, A. L. Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.16.1-5.16.23 (2016).
  34. Leber, A. L. Time-Kill Assay for Determining Synergy. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.14.3.1-5.14.3.6 (2016).
  35. Hindler, J. A., Humphries, R. M. Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).
  36. Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls. Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).
  37. Fuchs, P. C., Barry, aL., Brown, S. D. Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine. European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).
  38. Leber, A. L. Minimum Bactericidal Concentration Testing. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , 5.14.1.11 (2016).
  39. Cai, Y., et al. In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).
  40. Bulman, Z. P., et al. Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era. mBio. 8 (4), (2017).

Tags

Immunologi och infektion fråga 146 antimikrobiell synergieffekter antibiotika synergy synergy antibiotikaresistens kolistinresistens karbapenemresistenta Enterobacteriaceae tid-kill synergy schackrutiga array automation bläckstråleutskrifter
Antimikrobiella Synergy tester av bläckstråleskrivare-assisted automatiserade schackrutiga Array och den manuella tid-döda-metoden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E.… More

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter