Summary

Berika och utöka sällsynta Antigen-specifika T-celler med magnetiska nanopartiklar

Published: November 17, 2018
doi:

Summary

Antigen-specifika T-celler är svårt att karakterisera eller utnyttja i terapier på grund av sin extremt low-frekvens. Häri, vi tillhandahåller ett protokoll för att utveckla en magnetiska partikel som kan binda till antigen-specifika T-celler för att berika dessa celler och sedan expandera dem flera gånger för både karakterisering och terapi.

Abstract

Vi har utvecklat ett verktyg för att både berika och utöka antigen-specifika T-celler. Detta kan vara användbart i fall A) upptäcka förekomsten av antigen-specifika T-celler, B) sond dynamiken i antigen-specifika svaren, C) förstå hur antigen-specifika svar påverka sjukdomstillstånd såsom autoimmunitet, D) avmystifiera heterogena Svaren för antigen-specifika T-celler, eller E) utnyttja antigen-specifika celler för behandling. Verktyget är baserat på en magnetiska partikel att vi konjugat antigen-specifika och T-cell co-stimulatory signaler och att vi termen som konstgjorda antigenpresenterande celler (aAPCs). Följaktligen, eftersom tekniken är enkel att tillverka, det kan lätt antas av andra laboratorier. Således är vårt syfte här att beskriva i detalj tillverkning och efterföljande användning av aAPCs. Vi förklarar hur man fäster antigen-specifika och co-stimulatory signaler i aAPCs, hur man utnyttjar dem att berika för antigen-specifika T-celler och hur att utöka antigen-specifika T-celler. Dessutom kommer vi att belysa engineering design överväganden baserad på experimentella och biologisk information om våra erfarenheter med kännetecknar antigen-specifika T-celler.

Introduction

Med ökningen av många immunterapier finns det ett behov av att kunna karakterisera och styra immunsvar. I synnerhet är det adaptiva immunsvaret av intresse på grund av specificitet och hållbarhet av cellerna. Nyligen, chimär-antigen-receptor T cell terapier har godkänts för cancerbehandling; antigen-receptorerna baseras dock utanför den gemensamma cell ytantigen CD19, i stället för antigenerna som är specifika för cancer1. Bortom specificitet, kan immunterapier också lida av bristen på kontroll och begränsad förståelse dynamiska immunsvaret inom cancer eller autoimmunitet.

En av utmaningarna som studerar antigen-specifika svaren är deras extremt low-frekvens, t.ex., antigen-specifika T-celler är 1 av varje 104 106 T celler2,3. Således, för att undersöka vilka T celler är närvarande eller svarar, cellerna måste antingen vara berikad och expanderat eller deras signal behöver förstärkas. Det är dyrt och svårt att upprätthålla feeder cellerna med aktuella tekniker med fokus på expansion av antigen-specifika celler. Aktuella tekniker som fokuserar på att förstärka signalen för antigen-specifika T-celler, som den enzymkopplad immunospot (ELISPOT) assay, begränsa användningen av dessa T-celler4. Slutligen, på grund av låg känslighet, dessa två tekniker behöver ofta kombineras för antigen-specifika uppräkning.

För att lösa dessa frågor, har vi utvecklat den magnetiska nanopartiklar-baserade konstgjorda antigen presenterande cell (aAPC)5,6,7,8. AAPC kan vara functionalized med ett antigen-specifika signal-peptid laddade stora histocompatibility komplex (pMHC)- och co-stimulatory molekyler –t.ex., en anti-CD28 antikropp-både berika antigen-specifika T-celler och sedan därefter stimulera deras utvidgning (figur 1). Partiklarna kan alltså vara en kostnadseffektiv off-the-shelf produkt som kan vara både anpassas efter antigen-specifika stimuli ännu standardiserat över experiment och patienter. Utför den berikning och expansionen bearbeta resultaten i hundratals till tusentals gånger expansion av antigen-specifika CD8 + T-celler och kan resultera i frekvenser upp till 60 procent efter bara en vecka, aktivera den karakterisering eller terapeutiska användningen av de stora antalet celler. Häri, vi beskriva hur man gör nanopartiklar aAPCs, vissa kritiska designöverväganden att välja nanopartiklar egenskaper, och visar några typiska resultat från att använda dessa partiklar i isolera och expanderar sällsynta antigen-specifika CD8 + T-celler.

Protocol

Alla möss kvarstod per riktlinjer som godkänts av Johns Hopkins universitetets institutionella Review Board. 1. Ladda dimeriskt Major Histocompatibility Complex immunglobulin fusionsprotein (MHC-Ig) med önskad Antigen peptid sekvens. Obs: Om du använder H – 2Kb: Ig, sedan följa protokollet beskrivs i steg 1.1; Om du använder H-2Db:Ig och sedan följa protokollet anges i steg 1.2. Aktiv lastning av peptid sekvens i H – 2Kb: Ig. Förbereda nöd…

Representative Results

För att slutföra en lyckad anrikning och expansion av antigen-specifika T-celler, den peptid-loaded MHC-Ig och co-stimulatory molekyler bör framgångsrikt bifogas aAPC partikeln. Baserat på de 3 metoderna för partikel fastsättning, ger vi några representativa uppgifter för en framgångsrik konjugation procedur resultatet (figur 5a). Faktiskt om ligand densitet är för låg, då det inte blir effektiv stimulering av antigen-specifika CD8 + T celler d?…

Discussion

Vi har skapat en roman antigen-specifika T-cell isolering teknologien baserat på nanopartiklar konstgjorda antigenpresenterande celler (aAPCs). Nanopartiklar aAPCs har peptid-laddat MHC på ytan som gör att antigen-specifika T-cell bindning och aktivering tillsammans med co-stimulatory aktivering. aAPCs är också paramagnetiska och därmed kan användas för att berika sällsynta antigen-specifika T-celler med hjälp av ett magnetfält. Vi har optimerat och studerade nyckel nanopartiklar egenskaper storlek, ligand den…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.W.H. tack av NIH Cancer nanoteknik Training Center vid Johns Hopkins Institutet för nanobioteknik, National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) och stiftelsen bågar för gemenskap stöd. Detta arbete finansierades av stöd från National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovation Initiative och den Coulter Foundation (JPS).

Materials

DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. , ., et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

Play Video

Cite This Article
Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

View Video