Antigen-specifika T-celler är svårt att karakterisera eller utnyttja i terapier på grund av sin extremt low-frekvens. Häri, vi tillhandahåller ett protokoll för att utveckla en magnetiska partikel som kan binda till antigen-specifika T-celler för att berika dessa celler och sedan expandera dem flera gånger för både karakterisering och terapi.
Vi har utvecklat ett verktyg för att både berika och utöka antigen-specifika T-celler. Detta kan vara användbart i fall A) upptäcka förekomsten av antigen-specifika T-celler, B) sond dynamiken i antigen-specifika svaren, C) förstå hur antigen-specifika svar påverka sjukdomstillstånd såsom autoimmunitet, D) avmystifiera heterogena Svaren för antigen-specifika T-celler, eller E) utnyttja antigen-specifika celler för behandling. Verktyget är baserat på en magnetiska partikel att vi konjugat antigen-specifika och T-cell co-stimulatory signaler och att vi termen som konstgjorda antigenpresenterande celler (aAPCs). Följaktligen, eftersom tekniken är enkel att tillverka, det kan lätt antas av andra laboratorier. Således är vårt syfte här att beskriva i detalj tillverkning och efterföljande användning av aAPCs. Vi förklarar hur man fäster antigen-specifika och co-stimulatory signaler i aAPCs, hur man utnyttjar dem att berika för antigen-specifika T-celler och hur att utöka antigen-specifika T-celler. Dessutom kommer vi att belysa engineering design överväganden baserad på experimentella och biologisk information om våra erfarenheter med kännetecknar antigen-specifika T-celler.
Med ökningen av många immunterapier finns det ett behov av att kunna karakterisera och styra immunsvar. I synnerhet är det adaptiva immunsvaret av intresse på grund av specificitet och hållbarhet av cellerna. Nyligen, chimär-antigen-receptor T cell terapier har godkänts för cancerbehandling; antigen-receptorerna baseras dock utanför den gemensamma cell ytantigen CD19, i stället för antigenerna som är specifika för cancer1. Bortom specificitet, kan immunterapier också lida av bristen på kontroll och begränsad förståelse dynamiska immunsvaret inom cancer eller autoimmunitet.
En av utmaningarna som studerar antigen-specifika svaren är deras extremt low-frekvens, t.ex., antigen-specifika T-celler är 1 av varje 104 106 T celler2,3. Således, för att undersöka vilka T celler är närvarande eller svarar, cellerna måste antingen vara berikad och expanderat eller deras signal behöver förstärkas. Det är dyrt och svårt att upprätthålla feeder cellerna med aktuella tekniker med fokus på expansion av antigen-specifika celler. Aktuella tekniker som fokuserar på att förstärka signalen för antigen-specifika T-celler, som den enzymkopplad immunospot (ELISPOT) assay, begränsa användningen av dessa T-celler4. Slutligen, på grund av låg känslighet, dessa två tekniker behöver ofta kombineras för antigen-specifika uppräkning.
För att lösa dessa frågor, har vi utvecklat den magnetiska nanopartiklar-baserade konstgjorda antigen presenterande cell (aAPC)5,6,7,8. AAPC kan vara functionalized med ett antigen-specifika signal-peptid laddade stora histocompatibility komplex (pMHC)- och co-stimulatory molekyler –t.ex., en anti-CD28 antikropp-både berika antigen-specifika T-celler och sedan därefter stimulera deras utvidgning (figur 1). Partiklarna kan alltså vara en kostnadseffektiv off-the-shelf produkt som kan vara både anpassas efter antigen-specifika stimuli ännu standardiserat över experiment och patienter. Utför den berikning och expansionen bearbeta resultaten i hundratals till tusentals gånger expansion av antigen-specifika CD8 + T-celler och kan resultera i frekvenser upp till 60 procent efter bara en vecka, aktivera den karakterisering eller terapeutiska användningen av de stora antalet celler. Häri, vi beskriva hur man gör nanopartiklar aAPCs, vissa kritiska designöverväganden att välja nanopartiklar egenskaper, och visar några typiska resultat från att använda dessa partiklar i isolera och expanderar sällsynta antigen-specifika CD8 + T-celler.
Vi har skapat en roman antigen-specifika T-cell isolering teknologien baserat på nanopartiklar konstgjorda antigenpresenterande celler (aAPCs). Nanopartiklar aAPCs har peptid-laddat MHC på ytan som gör att antigen-specifika T-cell bindning och aktivering tillsammans med co-stimulatory aktivering. aAPCs är också paramagnetiska och därmed kan användas för att berika sällsynta antigen-specifika T-celler med hjälp av ett magnetfält. Vi har optimerat och studerade nyckel nanopartiklar egenskaper storlek, ligand den…
The authors have nothing to disclose.
J.W.H. tack av NIH Cancer nanoteknik Training Center vid Johns Hopkins Institutet för nanobioteknik, National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) och stiftelsen bågar för gemenskap stöd. Detta arbete finansierades av stöd från National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovation Initiative och den Coulter Foundation (JPS).
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |