Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الآلي التحليل السلوكي لكبير C. ايليجانس السكان استخدام واسعة مجال-من-عرض "تتبع النظام الأساسي"

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58643
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2European Research Institute for the Biology of Aging, University Medical Centre Groningen

Summary

يصف لنا البروتوكولات لاستخدام منصة واسعة المجال لعرض تتبع السلكية (WF-NTP)، الذي يتيح لتوصيف عدد كبير من السكان من ايليجانس كاينورهابديتيسالمظهرية الفائق. يمكن استخدام هذه البروتوكولات لوصف التغييرات السلوكية خفية في سلالات متحولة أو استجابة للعلاج الدوائي بصورة تدرجية عالية.

Abstract

ايليجانس كاينورهابديتيس نموذج حيوان راسخة في مجال البحوث الطبية الحيوية، تستخدم على نطاق واسع في دراسات الشيخوخة وعلم الجينوم الوظيفي. لتقييم الصحة واللياقة البدنية من الحيوانات تحت الدراسة، واحد يعتمد عادة على قراءات حركية، مثل قياس عدد الانحناءات الجسم أو سرعة الحركة. وعادة ما تنطوي هذه القياسات العد اليدوي، مما يجعل صعوبة في الحصول على دلالة إحصائية جيدة، كالوقت والعمل القيود غالباً ما تحد من عدد الحيوانات في كل تجربة إلى 25 أو أقل. منذ عالية القدرة الإحصائية اللازمة الحصول على النتائج استنساخه والحد من النتائج الإيجابية والسلبية الكاذبة عند التحقيق في تأثيرات المظهرية ضعيفة، بذلت جهود مؤخرا وضع بروتوكولات الآلي التي ركزت على زيادة حساسية للكشف عن حركية والتنميط السلوكي متعدد حدودي. بغية تمديد المهلة للكشف إلى المستوى اللازم لالتقاط التغييرات المظهرية الصغيرة التي غالباً ما تكون حاسمة في الدراسات الوراثية واكتشاف الأدوية، يصف لنا هنا تنمية تكنولوجية التي تمكن من دراسة الحيوانات الفردية يصل إلى 5,000 في نفس الوقت، زيادة القوة الإحصائية للقياسات بحوالي 1,000-fold مقارنة مع الاختبارات اليدوية وحوالي معززات مقارنة بالأساليب الأخرى الآلي المتاحة.

Introduction

حوالي نصف قرن، قدم سيدني برينر ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كنظام نموذجي لدراسة التنمية وعلم الأعصاب، كهذا صغير (1 مم في الطول)، الدودة السلكية شفافة من السهل التلاعب وراثيا والاستمرار في مختبر1. اليوم، يتم استخدام C. ايليجانس لدراسة طائفة واسعة من العمليات البيولوجية بما في ذلك المبرمج، مما يشير إلى خلية، وطبيعة دورة الخلية، تنظيم الجينات، والايض، والشيخوخة2. وعلاوة على ذلك، تعقد الخلايا والأنسجة، أنماط التعبير البروتين والمحافظة على مسارات المرض بين C. ايليجانس والكائنات أعلى (80% جينات الفيروس المتنقل قد أورثولوجوي بشرية)، ترتبط بالبساطة و الفعالية من حيث التكلفة لزراعة وجعله كائن نموذج فعال في فيفو قابلة للفائق الوراثية3،،من45،، ،من67 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 والمخدرات عروض14،،من1516 . ولجميع هذه الأسباب، C. ايليجانس قد استخدمت لتوصيف المسارات الجزيئية العادية وذات الصلة بالمرض؛ في ميدان نيوروديجينيريشن، على سبيل المثال، قد مكن استكشاف آثار الشيخوخة على البروتين تجميع3،،من47،،من1517، 18، والتوصيف للمروجين ومثبطات البروتين تجميع3،،من45،،من67،14، 18.

اللياقة البدنية عموما من الديدان، ومعلمة سلوكية هامة لتعريف بهذا النوع من الدراسة، يمكن أن تقاس يدوياً في مجموعة متنوعة من الطرق، كما هو الحال بإحصاء عدد الانحناءات الهيئة الواحدة والدقيقة (BPM)4،6، 19، أو عن طريق قياس سرعة حركة20،،من21إلى22، وكذلك عن طريق قياس معدلات الشلل ومتوسط عمر. على الرغم من أن القياسات اليدوية من الانحناءات الجسم وسرعة الحركة وأدت إلى العديد من الأفكار الهامة في مجموعة متنوعة من المسارات الجزيئية والآليات3،4،،من1419، 20،23، الاختبارات اليدوي تظل منخفضة الإنتاجية حاليا وتتطلب عمالة مكثفة جداً وتستغرق وقتاً طويلاً حين يجري عرضه للأخطاء والتحيزات البشرية. هذه المسائل تحديات كبيرة في جمع البيانات مع قوة إحصائية كافية للتمييز بين التغيرات السلوكية خفية. هذا القيد ذات الصلة لا سيما للمخدرات الفحص كعلاجات مع المخدرات المحتملين الجزيئات التي غالباً ما تؤدي إلى التغيرات المظهرية الصغيرة24، ولذلك تتطلب دراسة عدد كبير من الحيوانات من أجل الحصول على النتائج استنساخه. ولتوضيح هذه النقطة، وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن قوة عالية للكشف عن (جراب) أمر ضروري لتحديد أية تغييرات هامة بالثقة في السلوك والحد من النتائج الإيجابية الكاذبة25. وقد أسفر هذا حافزا قويا في المجتمع C. ايليجانس ليحل محل العد اليدوي مع قياسات استنساخه، الآلي، وقت--وفعالة من حيث التكلفة. ولتلبية هذا الطلب، وضعت عدة مختبرات مؤخرا إلى أساليب لقياسات عالية الحساسية وتتبع دودة دقيقة لعدد أكبر من الديدان22،،من2627،28 ،،من2930،31،،من3233.

من أجل زيادة توسيع عملية التشغيل الآلي لافواج كبيرة من الحيوانات اللازمة لقياسات يعتد به إحصائيا، وقد وضعنا مؤخرا ديدان أسطوانية واسعة المجال لعرض تتبع منهاج (WF-NTP)15،34 ،،من3536، الذي يتيح التحقيق متزامنة متعددة قراءات المظهرية على السكان دودة كبيرة جداً، وعاملا رئيسيا في الكشف عن الشكلية إحصائيا ذات الصلة25. WF-NTP حاليا مراقبة الحيوانات تصل إلى 5,000 جنبا إلى جنب، بل قراءات المظهرية أيضا تضمين معلمات متعددة، بما في ذلك معدل والسعة الانحناءات الجسم، وسرعة الحركة، وجزء صغير من السكان التي هي بالشلل، حجم الحيوانات. ولذلك من الممكن سهولة الشاشة آلاف من الديدان بالتوازي، والجمع بين قراءات مختلفة في خارطة سلوكية لخلق بصمات الأصابع متعددة الأبعاد36. البرمجيات المفتوحة المصدر المرتبطة بها هو مكتوب في بيثون، مطلوب أيضا لتشغيله، وهو تماما للتخصيص. كما تتوفر واجهة مستخدم رسومية (GUI) لتمكين المستخدمين من اعتماد هذه التكنولوجيا.

وهنا، نقدم سلسلة من البروتوكولات التي توضح بعض التطبيقات المحتملة ل WF-معاهدة عدم الانتشار. على وجه الخصوص، نحن مناقشة إدارة المركبات، بدءاً من الجزيئات الصغيرة للمداواة البروتين، وتصف كيفية فحص آثارها مباشرة عبر عدد كبير من السكان من الديدان، وبالتالي فعالية إزالة الحاجة إلى أخذ عينة صغيرة السكان الفرعية. استخدام WF-معاهدة عدم الانتشار لهذا غرض قد حققت بالفعل مزايا كبيرة في إجراءات تهدف إلى تصميم برامج اكتشاف المخدرات مرض الزهايمر (AD)15،،من3435 ومرض باركنسون (PD)18 باستخدام البيانات الحية في تقييم المرشحين العلاجية35،37.

Protocol

1-إعداد مواد للبروتوكولات C. ايليجانس

  1. إعداد حلاً المخزن مؤقت x M9 10، إضافة 30 غ فوسفات البوتاسيوم مونوباسيك و 60 غرام من فوسفات الصوديوم مائي 50 جرام من كلوريد الصوديوم باستخدام زجاجة أوتوكلافابلي 1 لتر.
    1. إضافة 1 لتر من الماء النقي والاوتوكلاف في كاليفورنيا- 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. تمييع 10 مرات في تنقية المياه والاوتوكلاف في كاليفورنيا- 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. عندما يبرد، أضف 1 مل حل م 1 سلفات المغنيزيوم.
      ملاحظة: 1 فقط x M9 (M9) ينبغي أن تستخدم للدودة المناولة في الخطوات التالية.
  2. إعداد متوسط نمو السلكية (الغنية-NGM)، مزيج 2.7 غرام كلوريد الصوديوم، ز 15.75 لاجار، ز 5.75 الكازين، 900 مل من المياه النقية، والاوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    1. نقل متوسطة NGM الغنية إلى فرن الاحترار (ca. 70 درجة مئوية) في حالة عدم استعمالها فورا؛ الغنية-NGM يمكن الإبقاء على المنصهر في كاليفورنيا-70 درجة مئوية ليصل إلى 12 ساعة قبل أن يصبح غير قابل للاستخدام.
    2. للأغنياء-NGM مزيج، إضافة 900 ميليلتر لإيجاد حل لكلوريد الكالسيوم وميليلتر 900 حل سلفات المغنيزيوم م 1 ميليلتر 900 لإيجاد حل لنسبة الكولسترول في الدم 5 ملغ/مل م 1 في الإيثانول المطلقة.
      ملاحظة: نسبة الكولسترول في الدم لا تتطلب التعقيم قبل الاستخدام.
    3. إعداد لوحات التجريبية التي تحافظ على سكان متزامن بعمر، إضافة ميليلتر 92 من 2-5-مخفضات '--ديوكسيوريديني (فودر) في 812 ميكرومتر إلى 900 مل الأغنياء-NGM.
      ملاحظة: فودر السمية والمسببة للسرطان، ولذلك فمن الضروري ارتداء القفازات النتريل بالإضافة إلى مختبر معاطف ونظارات السلامة. عدم السماح للنفايات إدخال النفايات العامة تيار والتخلص منها بالحرق مع احتراق.
    4. صب 20 مل من الأغنياء-NGM يعقم في طبق بيتري معقمة 9 سم لتوليد صفيحة نمو (NGM الغنية باللوحة). صب 15 مل الأغنياء-NGM يعقم في طبق بيتري معقمة سم 9 جعل لوحة حركية (Mot اللوحة). من أجل 20 مل من الأغنياء-NGM مع فودر في طبق بتري معقمة 9 سم لتوليد صفيحة فودر.
      ملاحظة: حجم لوحة يذكره أجار منخفضة يسهل الكاميرا التركيز والدودة تتبع (راجع الخطوة 3.2.5).
  3. إعداد سلالة OP50 الإشريكيّة القولونية ، عن طريق التعقيم 1 لتر من مرق رطل في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وتلقيح مع ثقافة كاتب عندما يبرد.
    1. تسمح ثقافة البكتيرية تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية وتعقيم أنبوب لاستخدامها للطرد المركزي.
    2. نقل البكتيريا إلى أنابيب معقمة وأجهزة الطرد المركزي في 4,600 س ز لمدة 15 دقيقة.
    3. صب المادة طافية، واستخدام المياه المعقمة، تعليق في 10% الحجم الأصلي لإنشاء 10 الأسهم OP50 x (مركزة 10 مرات).
    4. تمييع 15 مل مخزون x OP50 10 إلى 150 مل لتوليد 1 x OP50، باستخدام الماء المعقم، قبل استخدامها للبذور لوحات NGM الغنية. الحل استخدام x 10 المتبقية إلى لوحات فودر البذور.
      ملاحظة: لوحات يذكره سيبقى المصنف وستستخدم فقط في الخطوة الحصول على الصورة.
  4. إلى لوحات البذور بالبكتريا، وفصل الأغنياء-NGM ولوحات فودر.
    1. تحت ظروف معقمة، إضافة 350 ميليلتر من 1 x OP50 إلى NGM الغنية بلوحات وتنتشر بشكل متساو.
      ملاحظة: لا تنتشر على حافة اللوحة كما سيتم الزحف الديدان حتى جانبي اللوحة ويموت.
    2. تحت ظروف معقمة، إضافة 350 ميليلتر من x 10 لوحات OP50 إلى فودر وتنتشر بشكل متساو.
    3. السماح لوحات لتجف واحتضان في 20 درجة مئوية لمد 2 قبل الاستخدام.

2-إعداد C. ايليجانس للاستخدام مع WF-معاهدة عدم الانتشار

  1. الحفاظ على C. ايليجانس على لوحات NGM الغنية أو بواسطة نقل كمية صغيرة من أجار تحتوي على الديدان ووجهة للأسفل على طبقة بكتيرية جديدة. الحفاظ على السلالات C. ايليجانس بهذه الطريقة قبل الشروع في البروتوكولات التجريبية.
  2. باستخدام تقنية نقل (راجع الخطوة 2، 1)، لوحات 20 بذرة لكل سلالة استخدام الديدان المرحلة جيدا تغذية، مختلطة، والسماح لهم تنمو لمد 2 في 20 درجة مئوية.
  3. يغسل 5 لوحات تحتوي على الديدان باستخدام 15 مل M9 وتجمع في أنبوب 15 مل واحد. كرر لكل ألواح 20 لكل سلالة.
  4. الطرد المركزي الديدان في 2,000 س ز 2 دقيقة وإزالة المادة طافية، وتعليق في 2 مل من محلول M9.
  5. إعداد 10 مل من محلول التبييض عن طريق خلط 13% هيبوكلوريت الصوديوم وهيدروكسيد الصوديوم م 4 بنسبة 3:2 المجلد/vol.
    ملاحظة: لا يتطلب هذا الحل التعقيم. المكونات والحل الناتجة عن التآكل وينبغي التعامل معها بعناية باستخدام قفازات النتريل. هيدروكسيد الصوديوم هو أقل ما يقال أكالة للزجاج، وينبغي أن تكون مخزنة في حاويات بلاستيكية.
  6. أضف 1 مل من محلول التبييض لكل أنبوبة الطرد المركزي واهتز بشدة لما يقرب من 3.5 دقيقة أو حتى بشرة قد حلت تماما.
  7. تحت ظروف معقمة، تمييع هذه العينات إلى 15 مل M9 وأجهزة الطرد المركزي في 2,000 س ز 2 دقيقة إزالة المادة طافية وتعليق في 15 مل من محلول M9.
  8. كرر الخطوة 2.7 6 مرات، حتى تظل فقط دودة البيض، والحل الذي لم يعد له رائحة الكلور.
  9. الطرد المركزي في عينات 2,000 س ز 2 دقيقة وإزالة المادة طافية، وتعليق في 2 مل من محلول M9.
  10. تحت ظروف معقمة، استخدم ماصة زجاجية معقمة نقل 2 مل M9 المحتوية على البيض في كل من لوحة زراعة الأنسجة 12-جيدا جيدا واحتضان في 20 درجة مئوية للحد ني ح 16.
    ملاحظة: استخدم لوحات منفصلة لكل سلالة لمنع حدوث التلوث المنتقل. الخطوة نقل من أنابيب الطرد المركزي ليساعدك على آبار متعددة لتجنب الاختناق دودة.
  11. نقل الديدان تحاك بين عشية وضحاها من لوحات 12-جيدا في أنابيب الطرد المركزي 15 مل. 3 قطرات من 5 ميليلتر من دودة الحل وحساب عدد الديدان الحالية في مرحلة اليرقات الأولى (L1).
  12. حساب عدد الديدان كل ميليلتر حل.
  13. الديدان على لوحات NGM الغنية في الديدان 3,000 كل لوح L1 البذور والسماح لهم بالنمو لمدة يومين في 20 درجة مئوية، حتى تصل إلى المرحلة الأخيرة مرحلة اليرقات (L4).

3-العامة بروتوكول WF NTP

  1. إضافة مل 2.2 من كل دواء مركب في تركيز مناسب (مثل هذا النحو 25 أو 10 ملم للمخدرات مثل سكوالاميني18 وبيكساروتيني15، على التوالي) إلى فودر 6 لوحات والسماح لتجف تحت ظروف معقمة لكل المطلوب سلالة الفيروس المتنقل.
    ملاحظة: يتم تكرار هذه الخطوة لكل مجمع قيد الدراسة، لكل تركيز وكل المذيبات المستخدمة.
    1. أغسل الديدان قبالة 5 لوحات NGM الغنية بإعدادها في الخطوة 2.13 15 مل M9 المخزن المؤقت باستخدام ونقل الديدان إلى أنبوب الطرد مركزي.
    2. الطرد المركزي في 2,000 س ز 2 دقيقة وإزالة المادة طافية، وتعليق في 3 مل M9. 3 قطرات من 5 ميليلتر من M9 الحل الذي يحتوي على الديدان وحساب عدد الديدان الحالي في آخر مرحلة اليرقات L4.
    3. حساب عدد الديدان كل ميليلتر من المخزن المؤقت M9.
  2. البذور 700 L4 اليرقات على 6 لوحات فودر الجافة المحتوية على مركب معين، كرر هذه العملية لكل تركيز لكل مجمع، والسماح لتجف تحت ظروف معقمة.
    1. احتضان الديدان في 24 درجة مئوية من L4 لهذه السلالات حيث هو الناجم عن الشلل الذي أصاب دودة فقط برفع درجة الحرارة، مثل سلالة الإعلانية38. عد في اليوم التالي مرحلة اليرقات L4 ك D0 من مرحلة البلوغ.
  3. قم بتشغيل أضواء المرحلة لتعقب.
    1. تنظيف مرحلة الزجاج مع الإيثانول 70% وضمان أن لا تظل بقايا مرئية، ثم قم بإزالة غطاء العدسة. تنظيف عدسة تصوير تستخدم خرقه هواء. التأكد من أن الكاميرا موصولة بشكل صحيح ومثبتة وبدء التسجيل مع برنامج التقاط الصور.
    2. ضبط إعدادات الكاميرا لتسجيل 20 إطارات/ثانية، مع 16 أحادية تسجيل إعداد معلمات; تسجيل الإطارات 1,200، حفظ في تنسيق MJPEG بمعدل ضغط 95%. استخدام فارغة 9 سم طبق بيتري للتأكد من أن المرحلة التي تم تعيينه إلى الطول الصحيح وتعديله إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: التأكد من أن حواف اللوحة مرئية في التسجيل كما سيسمح هذا الخوارزمية 'إبقاء الميت' لتعمل بشكل صحيح (الشكل 1a).
    3. تحت ظروف معقمة، تأخذ 2 لوحات معدّة مسبقاً في الخطوة 3، 2 بنفس الشروط ويذكره 1 فحص لوحة إعدادها في الخطوة 1.2.4. أضف 3 مل الحل M9 لوحة Mot. استخدام أخرى 2 مل M9 غسل 1/3 المساحة السطحية لألواح 2 إعدادها في الخطوة 3، 2 على لوح Mot.
    4. ضع لوحة Mot التي تحتوي على حوالي 5 مل الحل M9 وحوالي 600 من الديدان على خشبة المسرح المقتفي. وتركز الكاميرا باستخدام دودة فردية وبدء التسجيل.
    5. عند الانتهاء من التسجيل، تجاهل لوحة يذكره مع الديدان؛ وضع علامة على لوحات فودر أنها تستخدم مرة واحدة وإعادته إلى الحاضنة.
    6. كرر الخطوات من 3.3.3 إلى 3.3.5 لكل حالة تجريبية.
    7. كرر الخطوات من 3.3.3 إلى 3.3.6 لكل نقطة مرة في عمر الكبار.
      ملاحظة: إجراءات الفرز يمكن أن تنفذ في أي نقطة من دودة عمر الكبار (ca. 3 أسابيع). هذه البروتوكولات تيسير فحص نقاط زمنية تصل إلى 9؛ يوصي المؤلفون بفحص كل يومين ابتداء من اليوم الأول من مرحلة البلوغ.

4-الأمثل لدراسات الجرعة المنفصلة

  1. إعداد الديدان بتكرار الخطوات من 3.1.1 إلى 3.1.3.
    1. البذور ca. 1000 L4 الديدان على 5 لوحات فودر. احتضان اللوحات في 24 درجة مئوية حتى الديدان D3 لبلوغ سن الرشد، للتجارب التي تنطوي على الإعلان38 .
  2. استخدام ماصة زجاجية معقمة، نقل الديدان أعدت تحت ظروف معقمة من اللوحة إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل، أجهزة الطرد المركزي في 2,000 س ز لمدة 2 دقيقة وإزالة المادة طافية.
    1. تعليق حل الديدان في 1 مل من المخزن المؤقت M9. نقل الديدان إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي، أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 2 دقيقة، وإزالة المادة طافية.
  3. لتوصيل البروتين، إضافة 40 ميليلتر من الكاشف التسليم تعداء و 20 ميليلتر من البروتين الأصلي في التركيز المطلوب (عادة 40 ميكرومتر)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    1. تحت ظروف معقمة، استخدم ماصة زجاجية معقمة نقل الديدان من الخطوة 4.2.1 في أنبوب ميكروسينتريفوجي يحتوي على بروتين مغلفة لإعطاء حجم إجمالي 1060 ميليلتر. أنابيب المكان أفقياً ويهز لفة في الدقيقة 60 في 24 درجة مئوية تهز الحاضنة ح 8.
  4. تحت ظروف معقمة، إضافة 4 مل من محلول M9 لوح يذكره ونقل أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد من الديدان بالإضافة إلى المخدرات على لوح Mot.
    1. إعداد tracker بتكرار الخطوات من 3.3 إلى 3.3.2.
    2. تحت ظروف معقمة، إضافة 4 مل من محلول M9 لوح يذكره ونقل أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد من الديدان بالإضافة إلى المخدرات على لوح Mot.
    3. ضع لوحة يذكره على خشبة المسرح المقتفي، تركز الكاميرا على دودة فردية، وبدء التسجيل. عند الانتهاء، تسمية لوحة يذكره وتعيين إلى جانب واحد.
    4. كرر الخطوات من 4.4.1 و 4.4.3 لجميع العينات.
    5. استخدام ماصة زجاجية، نقل الديدان تحت ظروف معقمة من اللوحة يذكره بأنبوب الطرد مركزي 15 مل، والطرد المركزي في س 2,000 ز للحد الأدنى 2 إزالة طافية، نقل بيليه على صفيحة فودر، والسماح لتجف تحت ظروف معقمة.
    6. كرر الخطوة 4.4.5 لجميع العينات.
  5. احتضان الديدان في 24 درجة مئوية حتى D6 لمرحلة البلوغ.
    ملاحظة: متعددة الأجسام المضادة إينكوبيشنز أيضا ممكنة.
  6. أضف 3 مل من المخزن المؤقت M9 لوحة يذكره واستخدم 2 مل من محلول M9 لغسل جميع الديدان من صفيحة فودر على لوح Mot.
    1. إعداد tracker بتكرار الخطوات من 3.3 إلى 3.3.2.
    2. ضع لوحة يذكره على خشبة المسرح المقتفي وتركيز الكاميرا عند الاقتضاء، وبدء التسجيل. عند الانتهاء من التسجيل، تجاهل لوحة يذكره أو استعادتها لمزيد التحري إذا رغبت في ذلك.
    3. كرر الخطوات من 4.6 إلى 4.6.2 لجميع العينات.

5-تحليل بيانات الفيديو

  1. بعد الحصول على أشرطة الفيديو، حدد المعلمات المناسبة في البرنامج واجهة المستخدم الرسومية (الشكل 2) لتحليل البيانات.
    1. تحميل واحد أو العديد من أشرطة الفيديو عن طريق وظيفة التصفح . قم بتحديد مجلد وجهة إخراج. ضمان أن تستخدم إطارات 600 إلى 1,200 لتحليل s 30.
      ملاحظة: يمكن تحليل أي مجموعة من الإطارات.
    2. إدراج بكسل لمعامل التحويل مم، التي سوف تكون 0.029 للتصوير أطباق بيتري سم 9 الكامل في القرار. حدد خوارزمية التتبع 'إبقاء الميت'.
      ملاحظة: معامل التحويل سيتوقف على مجال الرؤية المستخدمة. يمكن استخدام الخوارزمية Z-التحويل أيضا كبديل لذلك.
    3. ملء المعلمات في المقطع العثور (الشكل 2): Z استخدام الصور = 100، حشوة Z = 3، الأمراض المنقولة جنسياً بكسل = 54، عتبة = 9، افتتاح = 1، إغلاق = 2. ضبط معايير التصفية الحد الأدنى للحجم = 20، الحد الأقصى لحجم = 180، مثل دودة = 0.94.
    4. لحن المعلمات تشكيل مسارات : نقل المسافة القصوى = 10؛ طول الحد الأدنى = 150، الذاكرة = 10.
    5. تعيين معلمات الانحناءات والسرعة . استخدم 1.8 عتبة ينحنيو 0 الانحناءات الحد الأدنى150 الإطارات لتقدير سرعة.
    6. لحن الإحصاءات دودة ميتة. استخدام 5.0 الحد الأقصى للفوز في الدقيقة الواحدة و 1.0 السرعة القصوى.
    7. اختر مجلد الإخراج. تعيين عدد إطارات الإخراج إلى 50. تعيين حجم الخط إلى 10.
      ملاحظة: اختيارياً، حدد واحد أو أكثر المناطق ذات الاهتمام (رويس).
  2. اختبار المعلمات باستخدام الدالة المثال . إخراج الصور مثلاً والتحقق من أن الديدان مرئية طوال 8 خطوات العتبة (الشكل 1).
  3. استخدم الدالة بدء المهمة .
  4. تحليل الملفات نتيجة النص عن طريق الجمع بين النتائج الفردية لمجموعة البيانات كاملة. استخدام التصدير إلى الدالة tsv في واجهة المستخدم الرسومية.
    ملاحظة: بشكل اختياري، يمكن أيضا اعتبار المقاييس الفردية من الديدان للدراسات السكانية.
    1. تحليل البيانات باستخدام حزمة برامج إحصائية.

Representative Results

سهولة التشغيل والتحليل مولتيباراميتريك، وإنتاجية عالية من بروتوكول WF NTP المصور (الأرقام 1 و 2) يجعل من الممكن تحديد تغييرات صغيرة جداً في سلوك دودة بطريقة دقيقة جداً. يستند منهاج التصوير ميكانيكا البصريات مصنوعة خصيصا، وأنه يمكن تجميعها باستخدام كاميرا أحادية اللون 6 MP جنبا إلى جنب مع البعد البؤري 16 مم عدسة عالية الدقة لأجهزة الاستشعار 1 ''، ومضيئة مع 8 '' 8 '' بيضاء الخلفية (انظر الجدول للمواد وأيضا الإشارة إلى36 للحصول على تفاصيل إضافية). هو مكتوب في بيثون البرمجيات WF NTP المرتبطة بها ووضعت لتشغيله على أنظمة تشغيل ويندوز. يتم تشغيله على جهاز كمبيوتر مجمع مخصص مع ثماني النواة 3.00 جيجاهرتز و 64 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM). كما كان تصميم البرنامج باراليليزي العمل وتحليل أشرطة الفيديو التي تستند إلى RAM ووحدة المعالجة المركزية للكمبيوتر; أي,، آلة ذات صلاحية حساب انخفاض سيؤدي إلى تشغيل أقل من أشرطة الفيديو في نفس الوقت. الإعداد ونستخدم حاليا هو الأمثل لتشغيل إلى ca. 16 أشرطة الفيديو في نفس الوقت ويمكن إكمال تحليل أشرطة الفيديو 100 ca. بين عشية وضحاها. وعلاوة على ذلك، يسمح ارتفاع مستوى التفاصيل المقدمة في واجهة المستخدم الرسومية من WF-NTP التخصيص سيطرة كبيرة على نوعية تحليل التصوير. ويمكن استخدام واجهة المستخدم الرسومية لمباشرة تحميل قواعد البيانات الكبيرة في أشرطة الفيديو موازية أو الفردية؛ يمكن أيضا تحديد أطر محددة لتحليل مفصل الفرعية، جنبا إلى جنب مع عامل تحويل بكسل، التي يمكن استخدامها لتقدير المقاييس السلوكية. ويمكن اختيار إحدى خوارزميات مختلفة تتبع اثنين (تبقى ميتة وتحويل Z) اعتماداً على أم لا يود المستخدم أن تنظر الحيوانات مشلولا في التحليل. يمكن أن تكون المعلمة العتبة جودة ضبطها تبعاً لذلك مع الفيديو والتجريبية. افتتاح واختتام معلمات تسمح للمستخدم بإزالة الضجيج، وكذلك تنفيذ وظائف مستوى العتبة. خوارزمية سكيليتونيزينج يوفر طريقة بديلة للتحليل. كائن حجم انقطاع (تصفية) يوفر عامل تصفية إضافية للضوضاء الخلفية والمعلمة مثل دودة يسمح للمستخدم بالنظر في الكائنات فقط الديدان بشكل بيضاوي، وبالتالي التمييز بين الكائنات الأخرى التي قد يكون لها نفس حجم بكسل الديدان. بعد هذه العمليات العتبة، يمكن تحديد جميع المناطق توسم الناتجة كالديدان الفردية ومواقف تلك المناطق ثم المخزنة لكل إطار للتحليل اللاحق والتعقب. الانحراف لكل دودة المتعقبة يستخدم لتقدير المقاييس دودة مثل مدى دودة الانحناء (BPM) كدالة للزمن. المستخدمين مسموح أيضا لتحديد عدد الإطارات المستخدمة للحفاظ على دودة في الذاكرة للبرنامج أثر الاصطدام، وعدد وحدات البكسل التي يمكن نقل الفيروس المتنقل بين الإطارات يمكن ضبطها أيضا للتمييز بين الحيوانات من الضوضاء. الخيار طول المسار الحد الأدنى يسمح للمستخدم للتخلص من الديدان التي قد تم تعقبها لإطارات قليلة فقط. البارامترات الرئيسية الأخرى، مثل المنعطفات والسرعة، تسمح للمستخدم بتحديد درجة الانحناء اللازمة تحسب كمنحنى جسم وعدد الإطارات التي تعتبر أن هناك حاجة إليها لتقدير سرعة الحيوانات. معلمات وقف إنتاج المواد الانشطارية يمكن ضبطها كذلك إدراج الحيوانات مشلولة. يظهر الإخراج تلقائياً في ملفات النتيجة. وتعتبر هذه القيم كالحدود العليا للتقييم لجزء صغير الحيوانات مشلولة. يمكن للمستخدم أيضا تحديد منطقة واحدة أو أكثر من الفائدة. هذه الميزة مفيدة بشكل خاص لتحليل الفئات السكانية الفرعية الديدان، ويتم فرز الإخراج تلقائياً في ملفات النتائج. خيار الإخراج يسمح للمستخدم بتحديد مجلد الإخراج وعدد الإطارات التي سيتم إنتاجها لأنها تتبع. يمكن أيضا استخدام مختلف أداة مجموعات لمزيد من التحليل البيانات، مثل الخرائط أداة مسار الأرض يوضح دودة كل المسارات وأداة أخذ البصمات التي تسمح للمستخدم لخلق بصمات الأصابع.

هذه المنهجية بتمكين النهج الجديد الذي سيعتمد، ليس فقط للدراسات البيولوجية من C. ايليجانس ، بل أيضا لأغراض البحوث الطبية والدوائية، مثل الفرز الفائق من التعديلات الوراثية والعلاج بالعقاقير. ونحن قد بينت هذه الإمكانات بوصف توصيف تعمل للدراسات السكانية الكبيرة (N > 1000) لمختلف نماذج دودة الأعصاب مرض الخرف (FTD) (frontotemporal39، مرض باركنسون (PD)7 ، مرض الزهايمر (AD)16،40، والتصلب العضلي الجانبي (المرض)19 (الشكل 3 ألف)، ووصف آثار جزيئات العلاجية المحتملة باستخدام نماذج دودة PD18 وإعلان 15،12 (الشكل 3b). اثنين من الجزيئات الصغيرة، سكوالاميني18 وبيكساروتيني15، كانت تدار بتركيزات تصل إلى 25 ميكرون إلى PD (الشكل 3b) و 10 ميكرون للإعلان38 (الشكل 3b) والديدان، على التوالي. وأظهر كل من المركبات واضحة آثار الجرعة تعتمد على أكثر من التركيزات اختبارها. وقد أظهرنا أن هذه الدقة العالية للقياسات هو يتحقق من خلال زيادة عدد الديدان التي يمكن تحليلها بالمقارنة بالطرق التقليدية (الشكل 3 ج). ونحن تبين أهمية حجم العينة (الشكل 3 جيم) في الفحص الجزيئي، وكذلك كما هو الحال في توصيف سلالات متحولة. الزيادة في درجة الحرارة من 20 درجة مئوية يؤدي إلى ما يقرب من نصف من الديدان الإعلانية أصبحت مشلولة بعد 3 أيام من بلوغه سن الرشد. تم فحص السكان دودة تحت ظروف مختلفة، مثل، عندما كانت تتعرض لتغيرات درجة حرارة خفية (الشكل 3 جيم، غادر (AD الديدان) الديدان الإفراط معربا عن شكل 42-بقايا الببتيد اميلويد بيتا (Aβ1-42) لوحة)، عندما أعرب Aβ1-42 في جميع الخلايا العصبية (الشكل 3 جيم، الفريق المركزي)، أو عندما تتعرض الديدان الإعلانية بيكساروتيني (الشكل 3 جيم، اللوحة اليمنى). كما جرى تحليل الديدان من رويس صغيرة تم اختيارها عشوائياً من مجال الرؤية الكاملة لأشرطة الفيديو المكتسبة مع WF-معاهدة عدم الانتشار (N < 50، الأصفر أشرطة) تسليط الضوء على المقارنة بين حركية هذه الديدان مع حركية متوسط السكان دودة كاملة (N < 1,000). في جميع اللوحات، الفرق تقاس على العموم دودة السكان يبدو أن يعتد به إحصائيا مع p ≤ 0.0001 (*).

يسمح بروتوكول WF NTP الموصوفة هنا أيضا التسجيل المتزامن لمعلمات متعددة (الشكل 1b) لدعم، على الوجه أمثل، التحقق من الصحة الداخلية ووضع بصمة شاملة لمجموعة واسعة من الظروف بالنسبة إلى مراقبة عينة، مما يتيح إجراء مقارنات مفيدة عبر دراسات متعددة. ويشمل هذا النهج متعدد حدودي تحليل السمات السلوكية المتعددة، بما في ذلك الانحناء التردد والسرعة ومعدل الشلل، الحجم، السعة ينحني وبيند تشريد36المتزامنة. وهذا يسمح لآلاف حيوانات التي يتعين رصدها بقدر كبير من التفصيل، وفي حساسية عالية جداً ودلالة إحصائية ويوفر فرصاً للدراسات إعداد كبيرة من السكان. ويمتاز هذا الإجراء تتبع أيضا السماح للدراسات الشلل يجب القيام بها بالتوازي مع قياسات سلوكية أخرى، سمة رئيسية في دراسات الفحص الجزيئي.

النتائج التي تحققت حتى الآن في إعلان15،،من3435 واكتشاف الأدوية18 PD تبرهن على أهمية اكتساب واسعة المجال لعرض البيانات زيادة كبيرة في عدد الحيوانات التي يمكن أن تكون رصد في تجربة واحدة، إلى حد كبير تقليل الأخطاء التجريبية وإلى حد كبير تحسين صحة الدراسات الإحصائية. وبناء على هذه النتائج، ونحن نتوقع أن بروتوكول WF NTP، الذي نحن متاحة ل المجتمع36، سوف تمتد بشكل كبير استخدام C. ايليجانس.

Figure 1
رقم 1: خطوات تحليل WF NTP ومثال لبصمات الأصابع. () 1. الفيديو الأصلي. 2-خلفية الصورة. 3-خلفية طرح الصورة. 4-6-خطوات العتبة. 7-9-وضع العلامات واحدة من الديدان. (ب) تعمل متعددة ترد مع بصمات الأصابع للديدان البرية من نوع ودوده نماذج PD والإعلانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: واجهة المستخدم الرسومية (GUI) من WF-NTP. يمكن تحديد ملفات الفيديو المحددة والإطارات المحددة في واجهة المستخدم الرسومية للتحليل، ويمكن إدراج عامل تحويل بكسل، بعدها يجري التحليل مع إحدى خوارزميات معينة تتبع اثنين. فمن الممكن لتحديد درجة الانحناء اللازمة للاعتماد كمنحنى جسم، فضلا عن العدد من الإطارات اللازمة لتقدير سرعة الحيوانات. هيئة الانحناءات ويمكن تحديد عتبات سرعة الإحصاءات دودة مشلولة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: أمثلة لتطبيقات تم تمكينها بواسطة الأسلوب WF NTP. () تطبيق WF NTP في الدراسات السكانية الكبيرة (N > 1,000) القياسات BPM لنماذج C. ايليجانس طائفة من أمراض الأعصاب بما في ذلك FTD، PD، الإعلانية، والمرض. (ب) تطبيق WF NTP في اكتشاف الأدوية. (ج) أهمية الدراسات السكانية في درجة الحرارة حساسية وفعالية العقاقير وتوصيف سلالة متحولة. تعمل للفئات السكانية الفرعية N < 50 (أشرطة صفراء) مقارنة مع أولئك السكان دودة كاملة (N < 1,000). أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

بسبب التوسع السريع في تقنيات داخل ميدان العلوم البصرية، من الممكن الآن لمعالجة الحاجة إلى أساليب مؤتمتة في دراسات C. ايليجانس بطرق جديدة إلى حد كبير. كنتيجة لذلك، تم تصميم عدد الرقمية تتبع منصات20،،من4142،43،44،،من4546 وإتاحتها عبر السنوات القليلة الماضية من أجل استبدال العد اليدوي للمعلمات مثل سرعة الحركة، الانحناء التردد، ومعدل الشلل، فضلا عن أشكال أكثر تعقيداً من السلوكيات مثل يتحول أوميغا، وقياسات عمر. أحدث المنصات المؤتمتة تحسنت إلى حد كبير في إمكانية تكرار نتائج ودراسات41 حساسية ايليجانس جيم- وقدمت بيانات عالية الجودة في مجموعات صغيرة أو حتى كل من الحيوانات. قررنا تمديد التشغيل الآلي لتحليل سلوك دودة تجعل من الممكن تقييم تعمل الأفواج الآلاف من الحيوانات في نفس الوقت أيضا. والميزة الرئيسية للنهج المتبع في دراسة الأفواج دودة هو أنه يتيح للمحاسبة لتباين جوهري عالية دودة السلوك24 ولكون دراسات علاج المخدرات غالباً ما تؤدي إلى الاختلافات المظهرية خفية، من الصعب الكشف عن مع دلالة إحصائية كافية عند استخدام مجموعة صغيرة من الحيوانات. قوة عالية للكشف عن (جراب) في الواقع ضرورية للكشف عن أي اختلاف كبير في السلوك مع الثقة والحد من النتائج الإيجابية الكاذبة25.

وهنا، لقد قمنا بوصف سلسلة من البروتوكولات القائمة على أسلوب فرز الآلي المبلغ عنها مؤخرا C. ايليجانس، ديدان أسطوانية واسعة المجال لعرض تتبع منهاج (WF-NTP)36. البروتوكول هو موضح هنا ينقسم إلى 5 أجزاء. تصف الأجزاء 1 و 2 إعداد السكان الكبيرة دودة. الخطوات الحاسمة هي عقم ظروف العمل وإعداد الكواشف والصفائح اللازمة لتشغيل هذه التجارب. ونلاحظ أنه بسبب زيادة الإنتاجية المقدمة بموجب هذا البروتوكول مقارنة بغيرها فحص المنهجيات36، كما يتطلب كميات متزايدة من المواد الكاشفة؛ وهذا العامل يحتاج إلى النظر بعناية في التصميم التجريبي. ونلاحظ أيضا أن الخطوة تبيض أمر بالغ الأهمية، ويحتاج إلى اختبار مقدما كعدد كبير من البيض واليرقات صحية ضرورية لتشغيل هذه التجارب. الجزء 3 من هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تسليم المخدرات في دودة وسائط الإعلام والشاشة الصلبة السكان. ونلاحظ أن هذا الجزء من البروتوكول تعتمد اعتماداً شديدا على العدد من العقاقير والمخدرات تركيزات يمكن اختباره بواسطة المستخدم في نفس الوقت. أتمتة كاملة لإجراء الفحص والحصول على البيانات بسرعة التحول خطوة تحد من المراقبة السلوكية لإعداد كاشف والنمو والمزامنة من السكان دودة كبيرة. الخطوات الرئيسية أثناء فحص السلوكية هي أوقات التسجيل وأي دودة التعامل مع الخطوات (مثلاً، نقل الديدان من لوحات NGM إلى منصة التعقب). البروتوكول الموصوفة هنا مثال مصممة للشاشة الديدان لمدة 9 أيام خلال عمر الكبار؛ ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة الشاشة العديد من النقاط الزمنية حسب رغبة المستخدم، مثلاً، 18 يوما على التوالي36. ويوضح الجزء 4 ثم تطبيق البروتوكول على تسليم الجزيئات البروتينية (مثل الأجسام المضادة ومرافقين الجزيئية) إلى C. ايليجانس، ويظهر كيف البروتوكول يتضح في الأجزاء 1-3 يمكن تخصيصها بسهولة، حسب المطلوب التطبيق. علينا أن نظهر كيف يمكن تمديد هذا الإجراء ليس فقط لإيصال جزيئات شبيهة بالمخدرات ولكن أيضا لإدارة مرافقين أو الأجسام المضادة الجزيئية37. تنفذ الخطوات الأربعة الأولى (أجزاء) تحت ظروف معقمة، إلا إذا ذكر خلاف ذلك. يجب أن تكون كافة المكونات السائلة يعقم قبل الاستخدام وحضانة الخطوات التي ينبغي أن تجري في الرطوبة النسبية 70%. في الجزء 5، ونحن تصف كيفية استخدام حزمة البرامج المقدمة في تركيبة مع المرحلة التي تعقب. وكان هذا البرنامج مخصصة مصممة لتحليل البيانات WF NTP تتصل بسلوك السكان دودة كبيرة. ونحن نقترح أن المستخدم يتبع المبادئ التوجيهية الواردة في الباب 5 لتحليل البيانات؛ ومع ذلك، هذه المعلمات التي تعتمد على السمات المحددة لأشرطة الفيديو المسجلة (أي في الثانية، ومجال الرؤية، دقة الفيديو، عدد الإطارات المكتسبة). قد تم تصميم الدالة الأمثلة المقدمة في واجهة المستخدم الرسومية تسهيل تقييم المعلمات الصحيحة قبل التحليل.

هذه السلسلة من البروتوكولات تجعل من الممكن لتحليل تعمل لإعداد كبيرة من السكان من C. ايليجانس (حاليا ما يصل إلى 5,000 الديدان الفردية بالتوازي) فعالية، الحد من المصنوعات اليدوية بسبب تباين جوهري في سلوك الحيوانات ، باﻻتفاق مع دراسات تمهيدية بشأن قوة الكشف ضروريا لتحقيق الدلالة الإحصائية للدراسات ايليجانس جيم-25. ويستخدم المنصة نظام الكاميرات ذات الدقة العالية، قادرة على تسجيل الصور لإعداد كبيرة من الحيوانات بسرعة عالية، أثناء تسجيل أفواج كبيرة متعددة في وقت واحد. عالية الأداء والإنتاجية العالية لبروتوكول WF NTP يجعل من الممكن تحديد تغييرات صغيرة جداً في سلوك دودة بطريقة دقيقة جداً. ولذلك، تمكن هذه المنهجية النهج الجديدة التي سينظر فيها لدراسة بيولوجيا C. ايليجانس، بل بالإضافة إلى ذلك للبحوث الطبية والدوائية، مثل الفرز الفائق من التعديلات الوراثية والمخدرات العلاجات. ويمتاز هذا الإجراء أيضا السماح للدراسات الشلل يجب القيام بها بالتوازي مع قياسات سلوكية أخرى، سمة رئيسية في دراسات الفحص الجزيئي.

النتائج التي تحققت حتى الآن في برامج اكتشاف المخدرات الإعلانية15،،من3435 و PD18 تبرهن على أهمية اكتساب واسعة المجال لعرض البيانات في زيادة كبيرة عدد الحيوانات التي يمكن رصدها في تجربة واحدة، إلى حد كبير وبالتالي تقليل الأخطاء التجريبية وإلى حد كبير تحسين صحة الدراسات الإحصائية. بينما ركز النهج الحالية المبينة في هذا البروتوكول على التصدي للتحديات في مجال اكتشاف الأدوية، ونأمل أن المنهجية التي ستعتمد على نطاق واسع في المجتمع، وأن تطبيقه سوف تمتد إلى المجمع الوراثي و الدراسات السلوكية وتوسيع عدد تعمل حاليا لإزالتها.

Disclosures

الكتاب يعلن أن هناك لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل المركز ل Misfolding الأمراض (CMD). ويدعم القوات المسلحة اﻷنغولية بمنح "زمالة للبحث أقدم" من المجتمع، المملكة المتحدة مرض الزهايمر (منحة رقم 317، AS-سادس-16-003). وتم الحصول على سلالات C. ايليجانس من ايليجانس كاينورهابديتيس مركز الوراثية (كجك).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumable reagents
monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P0662
dibasic sodium phosphate Sigma Aldrich S3264
sodium chloride Sigma Aldrich 13422
magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Agar Sigma Aldrich A1296
Difco casein digest Scientific Laboratory Supplies 211610
calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C3881
cholesterol Acros 110190250
absolute ethanol Vwr 20821.33
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% Alfa Aesar L16497.ME
LB medium capsules MP biomedicals 3002-031
13% sodium hypochlorite Acros Organics AC219255000
Sodium hydroxide Fisher Chemical S/4880/53
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli strain OP50 Supplied by CGC Op50 E coli strain
C. elegans strain wild type Supplied by CGC N2 C. elegans strain
C. elegans strain AD Supplied by CGC GMC101 C. elegans strain
C. elegans strain PD Supplied by CGC NL5901 C. elegans strain
C. elegans strain ALS Supplied by CGC AM725 C. elegans strain
C. elegans strain Tau Supplied by CGC BR5485 C. elegans strain
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tactrol 2 Autoclave Priorclave
9 cm sterile Petri dishes Fisher Scientific 11309283
2 L erlenmeyer flasks Scientific Laboratory Supplies FLA4036
Nalgene 1 L Centrifuge pots Fisher Scientific 3120-1000
RC5C plus floor mounted centrifuge Sorvall 9900884
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
Heraeus Multifuge X3R Thermofisher scientific 75004515
Inoculating Spreaders Fisher Scientific 11821741
M4 multipette Eppendorf 4982000012
P1000 pipette Eppendorf Research Plus
P200 pipette Eppendorf Research Plus 3123000055
P10 pipette Eppendorf Research Plus 3123000020
1,000 μL low retention tips Sarstedt
300 μL low retention tips Sarstedt 70.765.105
10 μL low retention tips Sarstedt 70.1130.105
pipeteboy 2 VWR 612-0927
50 mL serological pipette Appleton Woods CC117
25 mL serological pipette Appleton Woods CC216
10 mL serological pipette Appleton Woods CC214
glass pipette 270 mm Fisherbrand FB50255 Camera for videos recording
pulsin Polyplus Transfection 501-04 Transduction reagent
Multitron Standard shaking incubator Infors HT INFO28573
air duster Office Depot 1511631
Name Company Catalog Number Comments
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software
8'' by 8'' Backlight Edmond Optics 88-508 Tracker component
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor Edmond Optics 86-571 Tracker component
6 Mpx camera Edmond Optics 33540 Tracker component
FlyCapture Software PointGrey SDK v2.12 Image capture software
WF-NTP Software Cambridge Enterprise v1.0 Image analysis software
Office Package Microsoft Office 365 Statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (5), 387-399 (2006).
  3. Nollen, E. A. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Van der Goot, A. T., et al. Delaying aging and the aging-associated decline in protein homeostasis by inhibition of tryptophan degradation. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. 109 (37), 14912-14917 (2012).
  6. Van Ham, T. J., et al. Identification of MOAG-4/SERF as a regulator of age-related proteotoxicity. Cell. 142 (4), 601-612 (2010).
  7. Van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of α-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), e1000027 (2008).
  8. Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes & Development. 19 (13), 1544-1555 (2005).
  9. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5 (10), 865-867 (2008).
  10. Kim, Y., Sun, H. Functional genomic approach to identify novel genes involved in the regulation of oxidative stress resistance and animal lifespan. Aging Cell. 6 (4), 489-503 (2007).
  11. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  12. Lee, S. S., Kennedy, S., Tolonen, A. C., Ruvkun, G. DAF-16 target genes that control C. elegans life-span and metabolism. Science. 300 (5619), 644-647 (2003).
  13. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews. Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  14. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J. S., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472 (7342), 226-229 (2012).
  15. Habchi, J., et al. An anticancer drug suppresses the primary nucleation reaction that initiates the production of the toxic A 42 aggregates linked with Alzheimers disease. Science Advances. 2 (2), e1501244 (2016).
  16. Wu, Y., et al. Amyloid- -Induced pathological behaviors are suppressed by ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (50), 13102-13113 (2006).
  17. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 92 (20), 9368-9372 (1995).
  18. Perni, M., et al. A natural product inhibits the initiation of a-synuclein aggregation and suppresses its toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. 114 (6), E1009-E1017 (2017).
  19. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), e1000399 (2009).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of visualized experiments. (95), 52321 (2015).
  21. Machino, K., Link, C. D., Wang, S., Murakami, H., Murakami, S. A semi-automated motion-tracking analysis of locomotion speed in the C. elegans transgenics overexpressing beta-amyloid in neurons. Frontiers in Genetics. 5, 202 (2014).
  22. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  23. Van der Goot, A. T., Nollen, E. A. A. Tryptophan metabolism: entering the field of aging and age-related pathologies. Trends in Molecular Medicine. 19 (6), 336-344 (2013).
  24. Lublin, A. L., Link, C. D. Alzheimer's disease drug discovery: in vivo screening using Caenorhabditis elegans as a model for β-amyloid peptide-induced toxicity. Drug Discovery Today: Technologies. 10 (1), e115-e119 (2013).
  25. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational analysis of lifespan experiment reproducibility. Frontiers in genetics. 8 (JUN), 92 (2017).
  26. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  27. Wang, S. J., Wang, Z. -W. Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior. PLoS ONE. 8 (7), e69653 (2013).
  28. Faumont, S., et al. An image-free opto-mechanical system for creating virtual environments and imaging neuronal activity in freely moving Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 6 (9), e24666 (2011).
  29. Tsibidis, G. D., Tavernarakis, N. Nemo: a computational tool for analyzing nematode locomotion. BMC Neuroscience. 8, 86 (2007).
  30. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  31. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  32. Restif, C., et al. CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion. PLoS Computational Biology. 10 (7), e1003702 (2014).
  33. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS ONE. 3 (5), e2208 (2008).
  34. Habchi, J., et al. Systematic development of small molecules to inhibit specific microscopic steps of Aβ42 aggregation in Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (2), E200-E208 (2017).
  35. Aprile, F. A., et al. Selective targeting of primary and secondary nucleation pathways in Aβ42 aggregation using a rational antibody scanning method. Science Advances. 3 (6), e1700488 (2017).
  36. Perni, M., et al. Massively parallel C. elegans tracking provides multi-dimensional fingerprints for phenotypic discovery. Journal of neuroscience. 306, 57-67 (2018).
  37. Perni, M., et al. Delivery of Native Proteins into C. elegans Using a Transduction Protocol Based on Lipid Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 7380 (2017).
  38. McColl, G., et al. Utility of an improved model of amyloid-beta (Aβ₋) toxicity in Caenorhabditis elegans for drug screening for Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 7 (1), 7380 (2012).
  39. Fatouros, C., et al. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  40. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-Amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).
  41. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-17 (2012).
  42. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G. T., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurobiology. 49 (4), 303-313 (2001).
  43. Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 55 (5), 1539-1549 (2008).
  44. Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neuroscience. 10, 84 (2009).
  45. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H., Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. 5, 115 (2004).
  46. Stroustrup, N., et al. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 141، اكتشاف المخدرات، وعلى أساس النمط الظاهري الفرز، الفائق الفرز C. ايليجانس، تشكيل اميلويد، مرض الزهايمر، نيوروديجينيريشن، ومكتبة السلكية، وتحليل عدد كبير من السكان
الآلي التحليل السلوكي لكبير <em>C. ايليجانس</em> السكان استخدام واسعة مجال-من-عرض "تتبع النظام الأساسي"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perni, M., Casford, S., Aprile, F.… More

Perni, M., Casford, S., Aprile, F. A., Nollen, E. A., Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform. J. Vis. Exp. (141), e58643, doi:10.3791/58643 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter