Summary
우리는 넓은 필드의 보기 선 충 추적 플랫폼 (WF-NTP), 꼬마 선 충의 큰 인구의 높은 처리량 phenotypic 특성을 가능 하 게를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 미묘한 행동 변화 돌연변이 체 긴장 또는 확장성 패션에서 약물 치료에 대 한 응답에서 특성을 사용할 수 있습니다.
Abstract
꼬마 선 충 은 생물 의학 연구, 기능 유전체학 및 노화 연구에 널리 고용에 잘 설립 동물 모델입니다. 건강과 연구에서 동물의 적합성 평가, 하나는 일반적으로 바디 벤드 수 또는 이동 속도 측정 등 운동 정보에 의존 합니다. 이러한 측정은 일반적으로 수동 계산 포함, 25 이하로 각 실험에서 동물의 수를 제한 하기가 좋은 통계 중요성, 시간 제약을 종종 노동 하 도전. 높은 통계 전원 재현성 결과 얻을 때 약한 phenotypic 효과 조사는 거짓 긍정 및 부정적인 결과 제한 하는 데 필요한 때문에, 노력은 최근 만들어진 증가에 초점을 맞춘 자동화 프로토콜을 개발 하는 운동 성 탐지 및 다중 파라미터 행동 프로 파일링. 의 감도 중요 한 유전자 연구와 신약에는 작은 phenotypic 변화를 캡처하는 데 필요한 단계로 탐지의 한계를 확장 하기 위하여 여기 5000 개별 동물의 연구를 가능 하 게 기술 개발 설명 동시에,에 의해 측정의 통계적 인 힘 증가 약 수동 분석 실험에 비해 1,000-fold 그리고 약 다른 사용 가능한 자동된 방법에 비해 약.
Introduction
약 반세기 전, 시드니 브 레너 연구 개발 및 신경 생물학,이 작은 모델 시스템으로 꼬마 선 충 (C. 선 충)을 도입 (1 m m에 길이), 투명 한 선 충 벌레 조작 하기 쉽습니다 유전자 실험실1에 유지 하기. 오늘, C. 선 충 다양 한 apoptosis, 세포 신호, 세포 주기, 유전자 조절, 대사의 성격을 포함 하 여 그리고2노화 생물학 과정을 공부 하는 데 사용 됩니다. 또한, 세포와 조직의 복잡성, 단백질 식 패턴 및 C. 선 충 및 더 높은 유기 체 (벌레 유전자의 80%는 인간의 orthologue), 간의 질병 경로 보존 단순 연결 하 고 경작, 비용 확인 그것은 효과적인 vivo에서 모델 생물 의무가 높은 처리량 유전자3,,45,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 과 약14,,1516 상영. 모든 이러한 이유로, C. 선 충 정상과 질병 관련 분자 경로; 특성에 대 한 고용은 neurodegeneration의 분야, 예를 들면, 그것은 활성화 단백질 집계3,4,7,,1517, 노화의 효과의 탐험 18및 발기인의 특성화 및 단백질 집계3,,45,6,7,14, 억제제 18.
연구의이 종류에 정의 하는 중요 한 행동 매개 변수 즉, 벌레의 전반적인 체력 측정 될 수 있다 수동으로 다양 한 방법으로와 같은 당 분 (BPM)4,6, 몸 굴곡의 수를 계산 하 여 19, 평균 수명 및 마비의 속도 측정 하 여 뿐만 아니라 운동20,,2122의 속도 측정 하 여 또는. 비록 몸 굴곡의 수동 측정 및 이동 속도에 다양 한 분자 경로 및 메커니즘3,4,,1419, 많은 중요 한 통찰력을 이끈 20,23, 수동 분석 남아 현재 낮은 처리량, 매우 노동 집약 및 시간이 걸리는 오류 하 고 인간의 편견 경향이 되 고 하는 동안. 이러한 문제는 미묘한 행동 변화를 구별 하는 충분 한 통계적 인 힘과 데이터의 수집에 상당한 도전을 제시. 이 한계는 특히 분자 종종 작은 phenotypic 변경24이어질 잠재적인 약물 처리로 심사, 따라서 재현성 결과 얻기 위해서는 동물의 많은 수의 연구를 필요로 하는 약물입니다. 이 시점을 설명 하기 위해 최근 연구 탐지 (포드)의 높은 파워는 필요한 행동에 어떤 중요 한 변화 자신감과 정의 하 고 제한 하는 거짓 긍정적인 결과25나타났습니다. 이것은 재현, 자동화, 시간-고 비용-effective 측정 수동 계산을 대체 하 선 충 C. 커뮤니티에 강한 동기 부여 귀착되 었 다. 이 수요를 충족 시키기 위해 여러 실험실 최근 개발한 고감도 측정 및 웜22,,2627,28의 수의 정확한 벌레 추적 방법 ,29,,3031,,3233.
추가 확장 통계적 측정에 필요한 동물의 큰 동료에 자동화의 과정을 위해 우리는 최근에 개발 플랫폼 (WF-NTP)15,34 를 추적 하는 넓은 필드의 보기 선 충 류 ,3536, 매우 큰 벌레 인구에 여러 phenotypic 판독, 통계적으로 관련성이 높은 phenotypical 탐지25핵심 요소 동시 조사를 가능 하 게. 뿐만 아니라 WF NTP은 현재 병렬, 최대 5000 동물을 모니터링할 수 있지만 phenotypic 판독 속도 바디 벤드, 이동 속도, 마비는 인구의 분수의 진폭을 포함 하 여 여러 매개 변수를 포함 하 고는 동물의 크기입니다. 그것은 따라서 쉽게 다차원 지문36만들려고 행동 지도에 서로 다른 정보를 결합 하 고 동시에 벌레의 화면 수천 수 있습니다. 관련된 오픈 소스 소프트웨어 작동에 필요한 이며 또한 완전히 사용자 정의할 수 있는 파이썬에서 작성 됩니다. 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 또한이 기술을 채택 하는 사용자가 제공 됩니다.
여기, 선물이 WF NTP의 잠재적인 응용 프로그램의 일부를 설명 하는 프로토콜의 시리즈. 특히, 우리 화합물, 단백질 치료제, 작은 분자에서까지 관리를 토론 하 고 따라서 필요가 작은 샘플을 효과적으로 제거 웜, 큰 인구 위에 직접 그들의 효과 스크린 하는 방법을 설명합니다 부분 모집단입니다. 이러한 목적을 위해 WF-NTP를 사용 하 여 상당한 이점을 이미 Alzheimer의 질병 (광고)15,,3435 와 파 킨 슨 병 (PD)18의 약물 발견 프로그램을 디자인 하기 위한 절차 가져왔다. 치료 후보35,37의 평가 대 한 vivo에서 데이터를 사용 하 여.
Protocol
1. 선 충 C. 프로토콜에 대 한 자료의 준비
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10 x M9 버퍼 솔루션을 준비 하는 1 L 멸 병 인산 이수소 칼륨 30 g, 염기 나트륨 인산 염의 60 g 및 염화 나트륨의 50 g 추가 합니다.
- Ca. 121 ° C 15 분에서 순화 된 물과 압력솥의 1 L를 추가 합니다.
- 순화 된 물과 압력솥에서 ca. 15 분 동안 121 ° C에 10 배 희석.
- 냉각 되 면, 1 M 마그네슘 황산 염의 해결책의 1 mL를 추가 합니다.
참고: 1 x M9 (M9) 웜 처리 다음 단계에 사용 해야 합니다.
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선 충 류 성장 매체 (리치-NGM) 준비, 염화 나트륨, 천, 카 제인, 순화 된 물, 그리고 15 분 동안 121 ° C에 고압의 900 mL의 5.75 g의 15.75 g의 2.7 g을 혼합 한다.
- 즉시, 사용 하지 않을 경우 지구 온난화 오븐 (ca. 70 ° C)에 풍부한 NGM 매체를 전송 서식-NGM 수 있습니다 보관 녹은 ca. 12 h 최대 70 ° C에서 사용할 수 없게 되기 전에.
- 리치 NGM 믹스를 절대 에탄올에 900 µ L 1 M 마그네슘 황산 염의 해결책의 염화 칼슘 1 M, 5 mg/mL 콜레스테롤의 솔루션의 900 µ L의 솔루션의 900 µ L를 추가 합니다.
참고: 콜레스테롤에는 압력가 마로 소독 사용 하기 전에 필요 하지 않습니다. - 세 동기 인구를 유지 하는 실험 접시를 준비 하려면 리치 NGM의 900 mL에 사용 812 µ M에 deoxyuridine (FUDR)-5-플 루 오로-2'의 92 µ L을 추가 합니다.
참고: FUDR 이므로 독성과 발암 성, 실험실 코트와 안전 안경 니트 릴 장갑을 착용 하는 필수적 이다. 폐기물 일반 폐기물 입력을 허용 하지 않습니다 스트리밍하 고는 애프터로 소 각 하 여 삭제. - 성장 플레이트 (리치 NGM 플레이트)를 생성 하 9 cm 멸 균 페 트리 접시에 압력가 리치 NGM의 20 mL를 붓으십시오. 운동 성 판 (Mot 플레이트)를 만들기 위해 9 cm 멸 균 페 트리 접시에 압력가 리치 NGM의 15 mL를 붓으십시오. 9 cm FUDR 접시를 생성 하 살 균 배양 접시에 FUDR와 리치 NGM의 20 mL를 붓으십시오.
참고: Mot 플레이트의 낮은 agar 볼륨 카메라를 용이 하 게 집중 하 고 벌레 추적 (3.2.5 단계 참조).
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압력가 마로 소독 1 L에 의해 OP50 대장균 스트레인 준비 15 분 동안 121 ° C에서 파운드 국물의 스타터 문화 냉각 때 접종 하는 고.
- 37 ° C에서 하룻밤 성장 하 고 원심 분리에 사용할 튜브 소독 세균성 문화를 허용 한다.
- 무 균 튜브와 15 분 동안 4600 x g 에서 원심 분리기를 박테리아를 전송 합니다.
- 가만히 따르다는 상쾌한 고, 살 균 수를 사용 하 여, 10 (10 배 농축) x OP50 재고를 만들려고 원래 볼륨의 10%에 일시 중지.
- 1 생성 하 150 ml 10 x OP50의 15 mL를 희석 x OP50, 메 마른 물를 사용 하 여 리치 NGM 접시를 시드하는 데 사용 되 고. 씨앗 FUDR 번호판을 사용 하 여 나머지 10 x 솔루션.
참고: Mot 접시 unseeded 유지 됩니다 그리고 이미지 수집 단계에서 서만 사용 될 것입니다.
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하 씨 박테리아, 분리 리치 NGM, FUDR 접시와 접시.
- 무 균 조건 하에서 1 x 리치 NGM을 OP50 플레이트와 균등 하 게 확산의 350 µ L를 추가 합니다.
참고: 벌레 플레이트와 다이의 측면을 크롤 링으로 접시의 가장자리에 확산 되지 않습니다. - 무 균 조건 하에서 10 배 FUDR OP50 플레이트와 균등 하 게 확산의 350 µ L를 추가 합니다.
- 건조 하 고 사용 하기 전에 2 d 20 ° C에서 품 어 접시를 허용 합니다.
- 무 균 조건 하에서 1 x 리치 NGM을 OP50 플레이트와 균등 하 게 확산의 350 µ L를 추가 합니다.
2. 준비 C. 선 충 의 WF NTP와 함께 사용 하기 위해
- C. 선 충 서식 NGM 접시에 유지 또는 전송 하 여 한 천 포함 된 적은 양의 신선한 세균 층에 아래로 얼굴 벌레. 실험 프로토콜을 시작 하기 전에 이와 선 충 C. 긴장을 유지 합니다.
- 전송 기술을 사용 하 여 (단계 2.1 참조), 각각의 씨앗 20 접시 잘 먹이, 혼합 단계 벌레를 사용 하 여 변형 하 고 20 ° c.에서 2 d 성장 하도록 허용
- M9 한 15 mL 튜브에 수영장의 15 mL를 사용 하 여 벌레를 포함 하는 5 접시를 씻어. 모든 20 판 각 변형에 대해 반복 합니다.
- 2000 x g 2 분에 벌레를 원심, 상쾌한, 제거 하 고 2 ml M9 솔루션의 중단.
- 13% 염소와 4 M 권/권 3: 2의 비율로 수산화 나트륨을 혼합 하 여 표백 솔루션의 10 mL를 준비
참고: 이 솔루션에는 압력가 마로 소독이 필요 하지 않습니다. 구성 요소 및 결과 솔루션 및 부식성 이며는 니트 릴 글러브를 사용 하 여 신중 하 게 처리 되어야 한다. 수산화 나트륨 유리 약간 부식성 이며 플라스틱 용기에 저장 한다. - 각 원심 분리기 튜브에 표백 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 흔들어 적극적으로 약 3.5 분 또는 때까지 표 피 완전히 해산 했다.
- 무 균 조건 하에서 2 분에 대 한 제거는 상쾌한 M9 솔루션의 15 mL에 중단 15 mL M9와 2000 x g 에서 원심 분리기 샘플을 희석.
- 2.7 6 번 웜 계란만 남아 있으며 솔루션 이상 염소의 냄새까지 단계를 반복 합니다.
- 2000 x g 2 분에 샘플 원심, 상쾌한, 제거 하 고 2 ml M9 솔루션의 중단.
- 무 균 조건 하에서 메 마른 유리 피 펫을 사용 하 여 12 음 조직 배양 플레이트의 각 음에 M9 포함 계란의 2 개 mL를 전송 및 16 h의 최소 20 ° C에서 품 어.
참고: 각 변형에 대 한 별도 접시를 사용 하 여 교차 오염을 방지 하기 위해. 벌레 질을 피하기 위해 여러 우물 수 원심 분리기 튜브에서 전송 단계. - 15 mL 원심 분리기 튜브 12-잘 접시에서 하룻밤 부 화 하는 벌레를 전송 합니다. 웜 솔루션의 5 µ L의 3 방울을가지고 고 첫번째 애벌레 단계 (L1)에 벌레의 수를 계산.
- 솔루션의 µ L 당 벌레의 수를 계산 합니다.
- 씨앗 L1 접시 당 3000 벌레에서 리치 NGM 접시에 웜 하 고 20 ° C에서 2 일 동안 마지막 애벌레 단계 (L4) 단계를 도달할 때까지 성장 하도록 허용.
3. 일반 WF NTP 프로토콜
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적절 한 농도에서 각 약 화합물의 2.2 mL을 추가 (같은 마약으로 25 또는 10 m m 같은 squalamine18 및 bexarotene15, 각각) 6 FUDR 플레이트 및 각 원하는 웜 변형에 대 한 살 균 조건 하에서 건조를 허용.
참고: 이 단계는 각 농도 및 각 용 매 사용에 대 한 시험에서 각 화합물에 대 한 반복 됩니다.- 2.13 M9 버퍼의 15 mL를 사용 하 여 단계에서 준비 5 리치 NGM 접시에서 벌레를 세척 하 고 원심 분리기 튜브에 벌레를 전송.
- 2000 x g 2 분에 centrifuge, 상쾌한, 제거 하 고 m 9의 3 mL에 중단. 웜 포함 된 M9 솔루션의 5 µ L의 3 방울을 마지막 무대 애벌레 L4에 벌레의 수를 계산.
- M9 버퍼의 µ L 당 벌레의 수를 계산 합니다.
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주어진된 화합물, 각각의 각 농도 대 한 반복을 포함 하는 건조 FUDR 판 6에 씨앗 700 L4 애벌레 화합물과 무 균 조건 하에서 건조 수 있습니다.
- 그 변종 웜 마비만 광고 스트레인38같은 온도 올려서 유발 됩니다 위한 L4에서 24 ° C에서 벌레를 품 어. 성인 기의 D0로 L4 애벌레 단계를 다음 날 수입니다.
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추적기에 대 한 무대 조명 설정.
- 70% 에탄올과 유리 무대를 청소 하 고 아무 보이는 찌꺼기가 남아 다음 렌즈 뚜껑을 제거. 공기 살포 기를 사용 하 여 이미징 렌즈를 청소 합니다. 카메라는 제대로 연결 하 고 설치를 확인 하 고 이미지 캡처 소프트웨어와 함께 녹음을 시작.
- 매개 변수 설정; 기록 하는 모노 16와 20 프레임/s를 기록 하는 카메라 설정을 조정합니다 95% 압축 속도로 MJPEG 형식 저장 1200 프레임을 기록 합니다. 무대 올바른 높이에 설정 되어 있는지 확인 하는 빈 9 cm 배양 접시를 사용 하 고 필요한 경우 조정.
참고: 확인이 제대로 작동 하려면 ' 유지-죽은 ' 알고리즘을 허용 것입니다 접시의 가장자리 기록에 표시 됩니다 (그림 1a). - 무 균 조건 하에서 이전 단계 3.2 동일한 조건 및 심사 단계 1.2.4에서에서 준비 된 접시 1 Mot 준비 2 접시를 가져가 라. Mot 접시에 M9 솔루션의 3 mL를 추가 합니다. 씻어 Mot 접시에 3.2 단계에서 준비 하는 2 접시의 표면 면적의 1/3 m 9의 다른 2 mL를 사용 합니다.
- M9 솔루션 및 추적기 무대에 약 600 벌레의 약 5 mL를 포함 하는 Mot 접시를 놓습니다. 개별 벌레를 사용 하 여 카메라를 집중 하 고 녹음을 시작.
- 녹음 완료 되 면, 벌레; Mot 플레이트 삭제 한 번 사용 되 고 FUDR 번호판 표시 고 인큐베이터에 반환 합니다.
- 각 실험 조건에 대해 3.3.3 3.3.5 단계를 반복 합니다.
- 성인 수명에 각 시간 점에 대 한 3.3.3 3.3.6 단계 반복 합니다.
참고: 심사 절차를 수행할 수 있습니다 밖으로 벌레의 성인 수명 (ca. 3 주)의 어느 시점에서. 이러한 프로토콜 촉진 심사 최대 9 시간 점; 저자 매 2 일 성년의 날 1에서에서 시작을 심사 하는 것이 좋습니다.
4입니다. 개별 복용량 연구에 대 한 최적화
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3.1.1 3.1.3 단계를 반복 하 여 벌레를 준비 합니다.
- 씨앗 ca. 1000 L4 5 FUDR 접시에 벌레. 성인 광고38 를 포함 하는 실험의 D3 벌레까지 24 ° C에서 접시를 품 어.
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메 마른 유리 피 펫, 전송 사용 하 여 벌레 15 mL 원심 분리기 튜브, 2 분 동안 2000 x g 에서 원심 분리기에 격판덮개에서 메 마른 조건 하에서 준비 하 고는 상쾌한 제거.
- M9 버퍼의 1 mL에 벌레의 솔루션을 일시 중단 합니다. Microcentrifuge 튜브, 2 분, 300 x g 에서 원심 분리기에 벌레를 전송 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
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단백질 변환에 대 한 (일반적으로 40 µ M), 원하는 농도에서 40 µ L의 transfection 배달 시 약 및 네이티브 단백질의 20 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 무 균 조건 하에서 메 마른 유리 피 펫을 사용 하 여 캡슐화 된 단백질을 가로 1060 µ L. 총 볼륨 장소 튜브를 주고 8 h에 대 한 보육을 떨고 24 ° C에서 60 rpm 동요를 포함 하는 microcentrifuge 튜브에 단계 4.2.1에서에서 벌레를 전송.
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무 균 조건 하에서 Mot 플레이트에 M9 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 전송 웜 플러스 Mot 접시에 약 1 개의 microcentrifuge 관.
- 3.3 3.3.2 단계를 반복 하 여 추적을 설정 합니다.
- 무 균 조건 하에서 Mot 플레이트에 M9 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 전송 웜 플러스 Mot 접시에 약 1 개의 microcentrifuge 관.
- 추적기 무대에 Mot 플레이트, 개별 벌레에 카메라 초점을 놓고 녹음을 시작 합니다. 완료 되 면 레이블을 Mot 접시 하 고 한쪽으로 설정 합니다.
- 모든 샘플 4.4.1-4.4.3 단계를 반복 합니다.
- 유리 피 펫을 사용 하 여, 15ml 원심 관에 Mot 격판덮개에서 메 마른 조건 하에서 웜 전송 원심 2000 x g 2 분 대에서 제거, 표면에 뜨는 전송 FUDR 접시에 펠 릿 그리고 무 균 조건 하에서 건조를 허용.
- 모든 샘플 4.4.5 단계를 반복 합니다.
- 성인 기의 d 6까지 24 ° C에서 벌레를 품 어.
참고: 여러 항 체 외피도 가능 하다입니다. -
Mot 플레이트에 M9 버퍼의 3 mL를 추가 하 고 M9 솔루션의 2 개 mL를 사용 하 여 Mot 접시에 FUDR 접시에서 모든 벌레를 씻어.
- 3.3 3.3.2 단계를 반복 하 여 추적을 설정 합니다.
- 추적기 무대에 Mot 플레이트, 초점을 필요에 따라 카메라 놓고 녹음을 시작 합니다. 녹음 완료 되, Mot 플레이트를 삭제 하거나 원하는 경우 추가 심사에 대 한 복구.
- 모든 샘플에 대 한 단계 4.6 4.6.2를 반복 합니다.
5. 비디오 데이터 분석
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동영상을 취득 후 데이터 분석을 위한 소프트웨어 GUI (그림 2)에서 적절 한 매개 변수를 선택 합니다.
- 단일 또는 다중 검색 기능을 통해 비디오를 로드 합니다. 출력 대상 폴더를 선택 합니다. 600 1200 프레임 30 s 분석을 위해 사용 되는 확인 하십시오.
참고: 프레임 범위를 분석할 수 있습니다. - 삽입 m m 변환 계수를 픽셀 0.029 9 cm 배양 접시에서 전체 해상도 이미지에 대 한 것입니다. '죽은 ' 계속 추적 알고리즘을 선택 합니다.
참고: 변환 계수 보기 필드의 사용에 따라 달라 집니다. Z-변환 알고리즘 대신으로도 사용할 수 있습니다. - 찾기 섹션 (그림 2)에서 매개 변수를 입력: 이미지를 사용 하는 Z = 100, Z 패딩 = 3, 성병 픽셀 54, 임계값 = = 9, 오프닝 = 1, 종료 = 2. 최소 크기 필터링 매개 변수를 조정 = 20, 최대 크기 = 180, 웜 같 은 0.94 =.
- 성형 궤적 매개 변수 조정: 최대 거리 이동 = 10; 최소 길이 = 150, 메모리 = 10.
- 굴절 및 속도 매개 변수를 설정 합니다. 벤드임계값 1.8, 최소 벤드, 0이 고 150를 사용 하 여 프레임 속도 추정을위한.
- 죽은 벌레 통계를 조정 합니다. 최대 분당 비트 에 대 한 5.0과 1.0를 사용 하 여 최대 속도대 한.
- 출력 폴더를 선택 합니다. 50 출력 프레임 수를 설정 합니다. 10 글꼴 크기 를 설정 합니다.
참고: 필요에 따라 하나 이상의 관심 영역 (ROIs)를 선택 합니다.
- 단일 또는 다중 검색 기능을 통해 비디오를 로드 합니다. 출력 대상 폴더를 선택 합니다. 600 1200 프레임 30 s 분석을 위해 사용 되는 확인 하십시오.
- 예제 함수를 사용 하 여 매개 변수를 테스트 합니다. 예제 이미지 출력 및 벌레 8 임계 처리 단계 (그림 1)을 통해 표시 되는지 확인 합니다.
- 작업 시작 기능을 사용 합니다.
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전체 데이터 집합에 대 한 개별 결과 결합 하 여 텍스트 결과 파일을 분석 합니다. Tsv 함수 내보내기를 사용 하 여 GUI에서.
참고: 선택적으로, 벌레의 개별 통계는 인구 연구 또한 간주 수 있습니다.- 통계 소프트웨어 패키지와 함께 데이터를 분석 합니다.
Representative Results
운영, multiparametric 분석 및 그림된 WF NTP 프로토콜 (그림 1 및 2)의 높은 처리량의 용이성은 매우 정확한 방법으로 웜 행동의 아주 작은 변화 들을 확인할 수 있습니다. 이미징 플랫폼 기반으로 주문 품 광학-역학, 그리고 16 m m 초점 거리 1' 센서와 8' 8' 화이트 백라이트에 의해 조명에 대 한 고해상도 렌즈와 함께 6 MP 흑백 카메라를 사용 하 여 조립 될 수 있다 (참조 테이블의 재료 그리고 대 한 자세한 내용은36 참조). 연결 된 WF NTP 소프트웨어 Python으로 작성 하 고 Windows 플랫폼에서 실행 되도록 개발 되었다. 그것은 3.00 g h z octa-코어 프로세서와 램 (RAM)의 64 기가바이트 사용자 지정 조립된 컴퓨터에서 실행 됩니다. 소프트웨어 또한 병렬화 작업 및 RAM; 컴퓨터의 CPU 기반 비디오 분석 하도록 설계 되었습니다. , 즉, , 낮은 계산 힘을 가진 기계 귀 착될 것 이다 더 적은 동영상을 동시에 실행. 우리가 현재 사용 하는 설치까지 ca. 16 동영상 병렬로 실행 하도록 최적화 하 고 하룻밤 ca. 100 영상의 분석을 완료할 수 있습니다. 또한, WF-NTP의 GUI에서 제공 하는 사용자 지정의 세부의 높은 수준의 이미징 분석의 품질의 좋은 제어할 수 있습니다. 직접 병렬 또는 개별 동영상; 큰 데이터 집합을 업로드 하는 GUI는 사용할 수 있습니다. 특정 프레임 픽셀 변환 요소, 행동 통계 추정 하는 데 사용할 수 있습니다 함께 자세한 하위 분석을 위해 선택할 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 추적 알고리즘 (계속 죽은 및 Z-변환) 중 하나에 따라 여부 사용자 분석에 마비 동물을 고려 하 고 싶습니다 선택할 수 있습니다. 임계 처리 매개 변수 테스트 및 비디오와 그에 따라 조정 된 품질을 수 있습니다. 열고 닫는 매개 변수는 잡음을 제거 하 고 추가 임계 처리 기능을 구현 하는 사용자를 수 있습니다. Skeletonizing 알고리즘 분석의 다른 방법을 제공합니다. 개체 크기 컷-오프 (필터링) 배경 잡음에 대 한 추가 필터를 제공 하 고 벌레 같은 매개 변수 타원 모양, 따라서 같은 픽셀 크기의 수 있습니다. 있는 다른 개체에서 구별 벌레만 개체를 고려 하는 사용자 수 웜입니다. 이러한 임계 처리 작업 후 모든 결과 이라는 지역 개별 벌레로 확인 될 수 있다 하 고 그 영역의 위치 다음 후속 분석 및 추적에 대 한 각 프레임에 저장 됩니다. 각 추적 된 벌레의 이심률 웜 통계 웜 (BPM) 시간의 기능으로 굽 힘의 범위 등을 예측 하는 데 사용 됩니다. 사용자 또한 소프트웨어 충돌, 다음의 메모리에는 벌레를 유지 하는 데 사용 하는 프레임 수를 선택할 수 있습니다 그리고 벌레 프레임 간에 이동할 수 있는 픽셀 수는 소음에서 동물을 구별 하는 것 또한 조정 될 수 있다. 최소 트랙 길이 옵션을 사용 하면만 몇 프레임에 대 한 추적 된 벌레를 삭제할 수 있습니다. 벤드와 속도 같은 다른 주요 매개 변수를 절곡 바디 벤드 및 동물의 속도 추정 하는 데 필요한 것으로 간주 하는 프레임의 수로 계산 하는 데 필요한 정도의 선택 사용자를 수 있습니다. 컷오프 매개 변수 마비 동물의 포함에 대 한 추가 조정 될 수 있습니다. 출력 결과 파일에 자동으로 표시 됩니다. 이러한 값은 마비 동물의 분수의 평가 대 한 상한으로 간주 됩니다. 사용자는 관심의 하나 이상의 영역을 선택할 수도 있습니다. 이 기능은 특히 유용 벌레의 모집단을 분석 하 고 출력 결과 파일에 자동으로 정렬 됩니다. 출력 옵션을 사용 하면 출력 폴더 및 추적 그것에 대 한 생산 됩니다 프레임의 수를 선택할 수 있습니다. 개별 웜 트랙을 보여 주는 플롯 경로 도구 및 지문 도구 사용자 지문 만들 수 있도록 지도 같은 다양 한 도구 세트도 추가 데이터 분석에 사용할 수 있습니다.
이 방법론 채택 되 고, C. 선 충 의 생물학적 연구 뿐만 아니라 유전 수정 및 약물 치료의 높은 처리량 검열 같은 약리 및 의료 연구 목적에 대 한 새로운 접근 수 있습니다. 우리 고기 신경 질환 (frontotemporal 치 매 (FTD)39, 파 킨 슨 병 (PD)7의 다양 한 웜 모델의 큰 인구 연구 (N > 1000)의 특성을 설명 하 여이 잠재력을 일러스트는 , Alzheimer의 질병 (광고)16,40, 그리고 루 경화 증 (ALS)19 (그림 3a), 및 PD18 및 광고 의 웜 모델을 사용 하 여 잠재적인 치료 분자의 효과 15,12 (그림 3b). 2 개의 작은 분자, squalamine18 및 bexarotene15, PD (그림 3b)와 10 25 µ M까지 농도에서 관리 되었다 광고38 (그림 3b) µ M 웜, 각각. 두 화합물 농도의 범위 복용량-의존 효과 테스트 명확 했다. 우리는 높은 정확도 측정의 전통적인 방법 (그림 3c)을 비교 분석할 수 있는 벌레의 수를 증가 의해 이루어집니다 나타났습니다. 우리 분자 뿐만 아니라의 돌연변이 체 긴장 처럼 심사에서 샘플 크기 (그림 3c)의 중요성을 설명 했다. 20 ° C에서 온도 있는 증가 이끌어 낸다 성인 기의 3 일 후 마비 되 고 광고 벌레의 약 절반. 벌레 인구 예: 다른 조건 하에서 상영 했다, -42-잔류물 형태의 아 밀 로이드 β 펩 티 드 (Aβ1-42)를 표현 하는 웜 (광고 웜) 미묘한 온도 변화 (그림 3 c, 왼쪽에 노출 되었다 패널), Aβ1-42 (그림 3 c, 중앙 패널), 모든 신경 세포에 또는 광고 웜 bexarotene (그림 3 c, 오른쪽 패널)에 노출 됐다 표현 했다. 벌레도 작은 ROIs WF-NTP (N < 50, 노란색 바) 전체 벌레 인구 (N의 평균 운동으로이 벌레의 운동 성의 비교를 강조와 함께 인수 하는 동영상의 전체 시야에서 무작위로 선정에서 분석 되었다 < 1000)입니다. 모든 패널, 측정 차이 온 벌레 인구가 나타납니다 p ≤ 0.0001 (*) 통계적으로 중요 한.
여기에 설명 된 WF NTP 프로토콜 또한 최적의 방식으로 지원 하기 위해 여러 개의 매개 변수 (그림 1b)의 동시 녹음을 허용 내부 유효성 검사 및 조건의 광범위의 포괄적인 지문의 개발 여러 연구에서 의미 있는 비교를 허용 컨트롤 샘플에 상대적입니다. 멀티 파라미터 이렇게 여러 행동 기능, 주파수, 속도, 마비 속도, 크기, 벤드 진폭 및 벤드 변위36굽 힘 등의 동시 분석을 포함 한다. 이 훌륭한 세부 사항에 매우 높은 감도 통계적 의미에서 모니터링할 동물의 수천을 허용 하 고 큰 인구 연구를 위한 기회를 제공 합니다. 이 추적 절차는 또한 다른 행동 측정을 병행, 분자 검사 연구에 핵심 기능에서 마비 연구 허용의 이점이 있다.
크게 될 수 있는 동물의 수를 증가에 넓은 필드의 뷰 데이터 수집의 중요성을 입증 하는 결과 달성 하 고 지금까지 광고15,,3435 에 PD18 약물 발견 하나의 실험, 실험 오류를 감소 하는 크게 크게 개선과 연구의 통계 유효성 모니터링. 이러한 결과 바탕으로, 우리는 우리가 쉽게 가능 지역 사회36, WF NTP 프로토콜 크게 C. 선 충의 사용을 확장할 것입니다 예상.
그림 1: WF NTP 분석 단계와 지문의 예. (한) 1입니다. 원래 비디오입니다. 2. 배경 이미지입니다. 3. 배경 이미지를 뺍니다. 4-6. 임계 처리 단계. 7-9. 벌레의 단일 라벨. (b) 여러 고기 야생 형 벌레에 대 한 지문 보고는 및 웜 PD와 광고 모델. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: WF NTP의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI). 특정 비디오 및 프레임 분석을 위한 GUI에서 선택할 수 있습니다 그리고 후 분석 실시 하는 2 개의 주어진된 추적 알고리즘 중 픽셀 변환 요소 삽입 될 수 있다. 바디 벤드로 동물의 속도 추정 하는 데 필요한 프레임 수로 계산 하는 데 필요한 굽 힘의 정도 선택 가능 하다. 바디 벤드 및 속도 임계값 마비 웜 통계를 확인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: WF NTP 메서드에서 사용 하는 응용 프로그램. (는) 응용 프로그램의 WF-NTP 큰 인구 연구에서 (N > 1000)의 다양 한 신경 퇴행 성 질환 FTD, PD, 광고, 등의 선 충 C. 모델에 대 한 BPM 측정 및 ALS. (b) 응용 프로그램의 WF-NTP 약물 발견에. (c) 온도 감도, 약물 효능 및 돌연변이 스트레인 특성에서 인구 연구의 중요성. 모집단 N < 50 (노란색 바)의 고기 전체 벌레 인구와 비교 (N < 1000). 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
광학 과학의 분야 내의 기술의 급속 한 확장 때문에 그것은 지금 실질적으로 새로운 방식으로 자동화 된 방법 C. 선 충 연구에 대 한 요구를 해결 수 있습니다. 그 결과, 다양 한 디지털 플랫폼20,41,,4243,44,,4546 추적 설계 되었고 이상 가능 구 부리는 동작, 오메가 회전 및 수명 측정 등의 보다 복잡 한 형태 뿐만 아니라 주파수, 마비 속도, 이동 속도 등의 수동 계산을 대체 하기 위하여 지난 몇 년. 가장 최근 자동화 플랫폼 크게 재현성 향상 C. 선 충 의 감도41 를 연구 하 고 작은 동료 또는 개별 동물에 고품질 데이터를 제공. 우리는 또한 동시에 동물의 수천의 동료의 고기를 평가할 수 있도록 웜 행동의 분석의 자동화를 확장 하기로 결정 했습니다. 공부 벌레 동료의 접근 방법의 주요 장점은 회계 웜 동작24 의 높은 본질적인 가변성 및 약물 치료 연구는 미묘한 phenotypic 변이 자주 이어질 사실 수 있다는 동물의 작은 그룹을 사용 하는 경우 충분 한 통계적 의미를 검출 하기 어려운. 탐지 (포드)의 고 출력은 자신감과 행동에 어떤 중요 한 변화를 감지 하 고 거짓 긍정적인 결과25제한 하 실제로 필요 합니다.
여기, 우리는 일련의 프로토콜 C. 선 충, 넓은 분야의 보기 선 충 류 플랫폼 (WF-NTP)36추적에 대 한 최근 보고 된 자동화 된 검사 방법에 따라 설명 했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 5 부분으로 나누어져 있습니다. 부품 1과 2는 큰 벌레 인구의 준비를 설명합니다. 중요 한 단계는 작업 조건의 불 임 및 시 약 및 실험을 실행 하는 데 필요한 접시의 준비. 우리가 참고 하, 때문에 늘어난된 처리량 다른 방법론36검사에 비해이 프로토콜에 의해 제공, 그것은 또한 증가 양의 시 약; 이 요인 실험 설계에 신중 하 게 고려 될 필요가 있다. 우리는 또한 표백 단계 중요 하 고 계란의 많은 수로 사전에 테스트 하 고 건강 한 애벌레는 이러한 실험을 실행 하는 데 필요한 참고. 이 프로토콜의 3 부 인구 고체 매체 및 화면 벌레에 마약을 제공 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 우리는이 프로토콜의 부분은 약물과 동시에 사용자에 의해 테스트 되 약물 농도의 수에 강하게 의존 주의. 심사 절차 및 신속한 데이터 수집의 완전 한 자동화 이동 제한 단계 행동 관찰에서 시 약 준비 및 성장 및 큰 벌레 인구의 동기화. 행동 심사 중 중요 한 단계는 녹음 및 처리 단계 (예를 들어, 추적 플랫폼 NGM 격판덮개에서 웜 전송) 어떤 벌레의 타이밍. 여기에 설명 된 프로토콜은 예; 성인 수명 동안 최대 9 일 벌레를 화면 설계 그러나,이 프로토콜은 사용자 욕망, 예를 들어, 18 일 연속36많은 시간 점수 화면에 쉽게 적용할 수 있습니다. 제 4 부는 다음 C. 선 충, 그리고 어떻게 부분 1-3에에서 나와 있는 프로토콜 쉽게 사용자 정의할 수 있습니다, 원하는 따라 쇼에 단백질 분자 (예, 항 체 및 분자 보호자)를 제공 하는 프로토콜의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 응용 프로그램입니다. 우리는 어떻게이 절차 뿐만 아니라 분자 보호자 또는 항 체37의 관리 뿐만 아니라 마약 같은 분자의 납품에 확장 될 수 있습니다 보여 줍니다. 처음 네 단계 (부품) 실행 된다 무 균 조건 하에서 달리 언급 하지 않는 한. 모든 액체 구성 요소 사용 전에 압력가 고 70% 상대 습도에서 부 화 단계를 수행 해야 합니다. 제 5 부, 우리는 추적 단계와 함께에서 제공 된 소프트웨어 패키지를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 소프트웨어 큰 벌레 인구의 동작에 관련 된 WF NTP 데이터의 분석을 위한 사용자 지정 되었습니다. 사용자 데이터 분석; 대 한 제 5에서 제공 된 지침을 따르는 것이 좋습니다. 그러나, 이러한 매개 변수 (즉, fps, 보기의 필드, 비디오 해상도, 획득된 프레임 수) 녹화 된 동영상의 특정 기능에 따라 달라 집니다. GUI에서 제공 하는 예제 함수 분석 전에 올바른 매개 변수의 평가 촉진 하기 위해 설계 되었습니다.
프로토콜의이 시리즈를 가능 하 게 (현재까지 동시에 5000 개별 웜) C. 선 충 의 큰 인구의 고기를 효과적으로 분석 유물 때문에 동물의 행동의 본질적인 가변성을 감소 , 와 탐지 선 충 C.25의 연구에 대 한 통계적 의미를 달성 하는 데 필요한 전력에 대 한 예비 연구. 플랫폼의 고해상도 카메라, 동시에 여러 큰 동료를 녹음 하면서 빠른 속도로 동물의 많은 수의 이미지를 기록할 수 있는 시스템을 사용 합니다. 고성능와 WF NTP 프로토콜의 높은 처리량은 매우 정확한 방법으로 웜 행동의 아주 작은 변화 들을 확인할 수 있습니다. 따라서,이 방법론 수 간주 C. 선 충의 생물학의 연구에 대 한 뿐만 아니라 또한 유전 수정 및 약물의 높은 처리량 검열 등 약리 및 의료 연구를 위한 새로운 접근 치료입니다. 이 절차는 또한 다른 행동 측정을 병행, 분자 검사 연구에 핵심 기능에서 마비 연구 허용의 이점이 있다.
실질적으로 증가에 넓은 필드의 뷰 데이터 수집의 중요성을 입증 하는 결과 달성 하 고 지금까지 광고15,,3435 와 PD18 의 약물 발견 프로그램에는 하나의 실험, 실험 오류를 감소 하는 그로 인하여 크게 크게 개선과 연구의 통계적 타당성에에서 모니터링할 수 있는 동물의 숫자. 이 프로토콜에서 설명 하는 현재 접근은 약물 발견의 분야에서 문제를 해결에 집중 했다, 하는 동안 우리 희망과 방법론 사회에서 널리 채택 될 것을 그것의 응용 프로그램을 복잡 한 유전을 연장 하 고 행동 연구는 현재 감지 하 고기 수 확장.
Disclosures
저자 아무 충돌 다는 것을 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품 Misfolding 질병 (CMD)를 위한 센터에 의해 지원 되었다. 연방 항공국은 Alzheimer의 사회, 영국 (부여 번호 317, AS-SF-16-003)에서 수석 연구 장학금 수상에 의해 지원 됩니다. C. 선 충 종자는 꼬마 선 충 유전 센터 (CGC)에서 얻은 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable reagents | |||
| monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
| dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
| magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
| Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
| cholesterol | Acros | 110190250 | |
| absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
| LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
| 13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
| C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
| C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
| C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
| C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
| C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
| 9 cm sterile Petri dishes | Fisher Scientific | 11309283 | |
| 2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
| Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
| RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
| Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
| M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
| P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
| P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
| P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
| 1,000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
| 300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
| 10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
| pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
| 50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
| 25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
| 10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
| glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
| pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
| Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
| air duster | Office Depot | 1511631 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
| 8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
| 16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
| 6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
| FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
| WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
| Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |
References
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