Summary
इस प्रोटोकॉल दोनों मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और जिगर की कोशिकाओं के साथ मानवीय चूहों की स्थापना के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है. मानव हेपेटोसाइट्स और सीडी34+ हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं के इंट्रास्प्लेनिक इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त दोहरी पुनर्गठन इम्यूनोन्यूफिडेक्ट चूहों मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस-1 संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और में मनाया के रूप में जिगर की क्षति recapitulate एचआईवी संक्रमित रोगियों।
Abstract
मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस-1 (एचआईवी-1) से संक्रमित रोगियों की जीवन प्रत्याशा में वृद्धि के बावजूद, यकृत रोग उनकी रुग्णता का एक आम कारण के रूप में उभरा है। एचआईवी-1 के कारण लीवर इम्यूनोपैथोलॉजी मायावी बनी हुई है। मानव hepatocytes और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ छोटे xenograft पशु मॉडल रोग रोगजनन के मानव जीव विज्ञान recapitulate कर सकते हैं. इसमें, एक प्रोटोकॉल मानव hepatocytes और CD34 के माध्यम से एक दोहरी मानवीय माउस मॉडल स्थापित करने के लिए वर्णित है+ hematopoietic स्टेम / दोहरी पुनर्गठन को प्राप्त करने के लिए, पुरुष TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) चूहों को माउस ट्रांसजेनिक लिवर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए गैनिकलोविर (जीसीवी) खुराक के साथ इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन दिया जाता है, और गैर-माइलोब्लटिव कंडीशनिंग के लिए ट्रेसोसल्फान के साथ, दोनों मानव hepatocyte (HEP) engraftment और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली (एचआईएस) विकास की सुविधा. मानव एल्बुमिन (एएलबी) के स्तर जिगर engraftment के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं, और प्रवाह cytometry द्वारा पता चला रक्त में मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की स्थापना की पुष्टि करता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर विकसित मॉडल एचआईवी-1 संक्रमण से जिगर की क्षति के कई घटकों जैसा दिखता है। इसकी स्थापना हेपेटाइटिस वायरस सह संक्रमण के अध्ययन के लिए और एंटीवायरल और एंटीरेट्रोवायरल दवाओं के मूल्यांकन के लिए आवश्यक साबित हो सकती है।
Introduction
एंटीरेट्रोवायरल थेरेपी के आगमन के बाद से, एचआईवी-1 मोनोइंसेटिव से संबंधित मौतों में काफी कमी आई है। तथापि, यकृत रोग एचआईवी संक्रमित रोगियों में रुग्णता का एक सामान्य कारण के रूप में उभरा है1,2. एचआईवी-1 संक्रमण वाले हेपेटाइटिस वायरस का सह संक्रमण अधिक आम है , जो संयुक्त राज्य अमेरिका में एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों के 10% - 30% के लिए जिम्मेदारहै 3,4,5.
एचआईवी-1 और हेपेटाइटिस वायरस की मेजबान विशिष्टता मानव-विशिष्ट संक्रामक रोगों का अध्ययन करने या एचआईवी-1-संबद्ध यकृत रोगजनन के कई पहलुओं की जांच करने के लिए छोटे पशु मॉडलों की उपयोगिता को सीमित करती है। प्रतिरक्षा की कमी वाले चूहे जो मानव कोशिकाओं और/या ऊतकों के engraftment की अनुमति देते हैं (मानवीकृत माउस मॉडल कहा जाता है) पूर्व नैदानिक अध्ययनों केलिए स्वीकार्य पशु मॉडल हैं 6,7,8. 2000 के दशक के शुरू में मानवीकृत चूहों की शुरूआत के बाद से, cholestatic मानव यकृत विषाक्तता के कई पूर्व नैदानिक अध्ययन, मानव-विशिष्ट रोगजनकों, एचआईवी-1 और एचआईवी संबद्ध neurocognitive विकारों सहित, एपस्टीन बार वायरस, हेपेटाइटिस, और अन्य संक्रामक रोगों की जांच इन चूहों6,9,10,11में की गई है . CD34+ HSPCs और/या मानव hepatocyte प्रत्यारोपण के लिए एकाधिक माउस मॉडल लंबे समय से विकसित किया गया है और हेपेटाइटिस बी वायरस (HBV) संबद्ध जिगर की बीमारी12के रोग रोगजनन का अध्ययन करने के लिए समय के साथ सुधार हुआ है, 13 , 14.एचएसपीसी और मानव हेपेटोसाइट (एचईपी) प्रत्यारोपण के लिए कई मॉडल उपभेदों पर आधारित होते हैं, जिन्हें एनओजी (एनओडी) के रूप में जाना जाता है। ग-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13,एनएसजी (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1WJl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- [c-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/ J)12,और fah-/- NOD rag1/ il2r-null माउस16| हालांकि, प्रत्येक मॉडल के अपने फायदे और सीमाएं हैं; उदाहरण के लिए, एचईपी और मानव स्टेम सेल (एचएससी) के लिए एएफसी8 दोहरी मानवीय चूहों एक Balb/C-Rag2पर -/- [c-/ इस मॉडल12में प्रतिक्रिया . डबल मानवीकृत चूहों के पुनर्गठन में प्रमुख चिंताओं में शामिल हैं suboptimal engraftment, विभिन्न ऊतकों का समर्थन करने के लिए उपयुक्त मॉडल की कमी, बेमेल स्थितियों, प्रतिरक्षा अस्वीकृति, या भ्रष्टाचारबनाम- मेजबान रोग (GVHD), और तकनीकी कठिनाइयों, इस तरह के नवजात शिशुओं के साथ जोखिम भरा जोड़तोड़ और चयापचय असामान्यताएं13के कारण उच्च मृत्यु दर के रूप में.
यद्यपि मानवीकृत चूहों का उपयोग कई वर्षों से एच आई वी अनुसंधान के लिए किया गया है17,18,19, एचआईवी -1 के कारण होने वाले यकृत क्षति का अध्ययन करने के लिए मानवीकृत चूहों का उपयोगसीमितकिया गया है . हम पहले एक दोहरी मानवीय TK-NOG माउस मॉडल और एचआईवी संबद्ध जिगर की बीमारी8में इसके आवेदन की स्थापना की सूचना दी. इस मॉडल जिगर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मजबूत engraftment से पता चलता है और एचआईवी संक्रमण रोगजनन recapitulates. यह चर्चा एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, मानव hepatocytes के प्रत्यारोपण में सबसे महत्वपूर्ण कदम भी शामिल है. एचईपी के सफल ग्राफ्टमेंट और टीके-एनओजी चूहों में एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली की स्थापना के लिए आवश्यक एचएसपीसी का विवरण भी प्रस्तुत किया गया है। एचआईवी-संबद्ध यकृत इम्यूनोरोगाजेनोजेसिस का अध्ययन करने के लिए इन चूहों का उपयोग विस्तृत है। TK-NOG पुरुष चूहों एक जिगर विशेष दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार ले जाने 1 थाइमिडीन kinase (HSV-TK) transgene उपयोग किया जाता है. माउस जिगर की कोशिकाओं को इस transgene व्यक्त आसानी से GCV के एक nontoxic खुराक के लिए एक संक्षिप्त जोखिम के बाद ablated किया जा सकता है. प्रतिरोपित मानव यकृत कोशिकाओं को बाह्य जात औषधियोंकेबिना माउस यकृत के भीतर स्टयपर किया जाता है . चूहों को मानव कोशिकाओं के लिए माउस अस्थि मज्जा में एक जगह बनाने के लिए ट्रेसुल्फान की गैर-मिलिएलोएब्लेटिव खुराक के साथ भी पूर्व-संस्कार किया जाता है8. इम्यूनोडेमिन्यूड टीके-नोग चूहों को एचईपी और मल्टीपॉवर एचपीएससी के साथ इंट्रास्प्लेनली इंजेक्ट किया जाता है। चूहों तो नियमित रूप से रक्त इम्यूनोफेनोटाइपिंग और सीरम मानव-एल्बुमिन के स्तर की माप द्वारा रक्त और जिगर पुनर्गठन के लिए नियमित रूप से निगरानी कर रहे हैं, क्रमशः. मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एचईपी दोनों के लिए 15% से अधिक के सफल पुनर्गठन के साथ चूहे को एचआईवी-1 के साथ इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन दिया जाता है। जिगर पर एचआईवी के प्रभाव के रूप में जल्दी के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है 4 - 5 सप्ताह postinfection. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, क्योंकि एचआईवी-1 का उपयोग किया जाता है, वायरस से निपटने और चूहों में इंजेक्शन लगाते समय सभी आवश्यक सावधानियां बरतनी चाहिए।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल को नेब्रास्का मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
नोट: जानवरों पर प्रयोग करने से पहले स्थानीय IACU से अनुमोदन प्राप्त करें।
1. Umbilical गर्भनाल रक्त के प्रसंस्करण और मानव HSPCs के अलगाव
- स्तरीय प्रवाह अलमारियाँ में बाँझ शर्तों के तहत प्रोटोकॉल के सभी चरणों का प्रदर्शन।
- हेपरिनीकृत ट्यूबों में एकत्र गर्भनाल रक्त (सीबी) लें और फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) जोड़कर मात्रा को 35 एमएल तक बना दें। लिम्फोसाइटों जुदाई माध्यम (LSM) के शीर्ष पर नमूना परत के रूप में चित्र1 में सचित्र और centrifuge एलएसएम पर स्तरित सीबी के साथ 400 x g पर 35 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोई ब्रेक के साथ.
नोट: ध्यान से और धीरे से रक्त पतला इंटरफ़ेस पर मिश्रण से बचने के लिए। - शीर्ष LSM और प्लाज्मा परत ध्यान से निकालें और एक हस्तांतरण pipette का उपयोग कर एक नई ट्यूब के लिए सफेद buffy कोट इंटरफ़ेस हस्तांतरण.
- बर्फ ठंडा बफर के 30 - 40 एमएल में buffy कोट resuspend (पीबीएस + 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [BSA] + 2 m ethylenediaminetetraacetic एसिड [EDTA]). एक पिपेट का उपयोग करना, एक गिनती स्लाइड के दो कक्षों में से किसी के बाहरी उद्घाटन में मिश्रण के 20 $4% trypan नीले और pipette के 20 $L के साथ सेल निलंबन के 20 डिग्री सेल्सियस गठबंधन और कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर में स्लाइड डालें।
नोट: सभी चरणों में बर्फ ठंडा बफर का उपयोग करें, क्योंकि यह कोशिकाओं को व्यवहार्य रखने में मदद करता है। - कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट को सावधानी से प्रेरित करें। फिर, बर्फ ठंडा बफर के 300 डिग्री एल जोड़ें।
- मानव एफसी रिसेप्टर अवरुद्ध अभिकर्मक के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और मोनोक्लोनल माउस विरोधी मानव CD34 एंटीबॉडी-कंजुटेड microbeads के 1 x 108 कोशिकाओं के लिए के 100 $L (सामग्री की तालिकादेखें )। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट, कोशिकाओं को धोने के लिए बर्फ-ठंडा बफर के 10 एमएल जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर अपकेंद्रित्र।
नोट: यदि 1 x 108 से अधिक कक्ष मौजूद हैं तो इसे कक्ष संख्या के अनुसार स्केल करें. - ध्यान से supernatant निकालें, बफर के 500 डिग्री एल में गोली resuspend, और चुंबकीय जुदाई कदम HSPCs को समृद्ध करने के साथ आगे बढ़ना.
- चुंबकीय-सक्रिय सेल छँटाई क्षेत्र में एक धनात्मक चयन एलएस कॉलम (सामग्री सारणीदेखें) को रखिए और इसे 3 एमएल बफर के साथ पास कीजिए।
- नमूने में मानव CD34 + करने के लिए बाध्य microbeads जाल और यह संग्रह ट्यूब में गुरुत्वाकर्षण के प्रभाव में प्रवाह करने के लिए अनुमति दे सकते हैं कि LS स्तंभ के लिए नमूना लोड.
- बफर के साथ स्तंभ 3x धो लें और सीडी 34 के एक ही संग्रह ट्यूब में एल्यूट इकट्ठा- कोशिकाओं के अंश.
- एक नया संग्रह ट्यूब में CD34+ कोशिकाओं को हल करने के लिए बफर के 5 एमएल के साथ स्तंभ डुबकी. की शुद्धता को प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ।
- एक हीमोसाइटोमीटर में trypan नीले रंग का उपयोग कर eluted CD34+ कोशिकाओं की गणना. गिनती के बाद, 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर CD34+ कोशिकाओं को अपकेंद्रण और supernatant त्यागें.
- पीबीएस के 25 डिग्री सेल्सियस मेंकोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए एक इंजेक्शन प्रत्यारोपण में तुरंत इस्तेमाल किया जा करने के लिए या ठंड माध्यम में 1-2 लाख/एमएल की एकाग्रता पर कोशिकाओं cryopreserve (Roswell पार्क मेमोरियल संस्थान मध्यम [RPMI 1640 मध्यम] + 50% भ्रूण प्रतिरोपण में आगे उपयोग के लिए गोजातीय सीरम (एफबीएस) + 10% डाइमेथिल सल्फाइड [DMSO])।
नोट: प्रत्यारोपण में उनका उपयोग करने से पहले हमेशा व्यवहार्य कोशिकाओं का वर्णन करें। - CD34+ elute की शुद्धता की जांच करने के लिए, निलंबन के 50 डिग्री सेल्सियस ले लो और पीई के 10 $L के साथ इनक्यूबेट-संयोजित विरोधी मानव CD34 एंटीबॉडी 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ दाग कोशिकाओं को धो लें, उन्हें पीबीएस के 100 डिग्री एल में पुन: निलंबित करें, और फिर, प्रवाह साइटोमेट्री करने के लिए आगे बढ़ें। कोई एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की एक अतिरिक्त ट्यूब जोड़ें प्रवाह cytometer में गेट डिजाइन करने के लिए.
- अधिग्रहण के बाद, एक आगे तितर बितर (FSC) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) भूखंड पर ब्याज के क्षेत्र का चयन करके डेटा का विश्लेषण, FSC क्षेत्र और FSC ऊंचाई भूखंडों पर एकल कोशिकाओं के लिए gating द्वारा पीछा. पीई चैनल और एसएससी क्षेत्र साजिश में एकल कोशिकाओं पर गेट CD34-सकारात्मक कोशिकाओं.
2. प्रत्यारोपण के लिए मानव Hepatocytes की तैयारी
- तरल नाइट्रोजन से cryopreserved hepatocytes निकालें, जल्दी से पानी के स्नान में शीशी डूब, और लगभग 90 - 120 s के लिए thaw.
- शीशी टोपी निकालें और गर्म thawing माध्यम के 50 एमएल शंकु ट्यूब में thawed hepatocytes डालना.
- कुछ सेकंड के लिए हाथ से 50 एमएल ट्यूब हिल द्वारा कोशिकाओं को निलंबित.
नोट: ट्यूब भंवर मत करो. - कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली। 0.1% बीएसए के साथ पीबीएस में छर्रों वाले कोशिकाओं को धोएं और उन्हें 80 डिग्री सेल्सियस/माउस के अंतिम खंड में पीबीएस में या तो ताजा या thawed HSPCs (अनुपात 10:1) के साथ पूल करें।
3. पशु हैंडलिंग, स्क्रीनिंग, जेनोटाइपिंग, और मानव HSPC और Hepatocyte प्रत्यारोपण के लिए उपचार
- पशु हैंडलिंग
- गंभीर इम्यूनोडेफिशियेंसी, नस्ल, घर, और aseptic शर्तों के तहत टी के-NOG चूहों को संभालका एक परिणाम के रूप में।
- संभावित रोगजनक सूक्ष्मजीवों के साथ संक्रमण को रोकने के लिए हमेशा एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, जूते कवर, और एक चेहरा मुखौटा पहनें।
- सर्जरी के लिए बाँझ दस्ताने और उपकरणों का प्रयोग करें और सर्जरी के दौरान जानवरों को संभाल।
- प्रयोग के लिए TK-NOG चूहों का चयन
- पुरुष गैर-TK-NOG litermates के साथ महिला TK-NOG चूहों प्रजनन द्वारा टी के-NOG तनाव कॉलोनी बनाए रखें और जीनोटाइपिंग द्वारा ट्रांसजेनिक वंश का चयन करें।
नोट: genotyping प्रदर्शन (चरण 3.3 देखें) उपस्थिति या नवजात पुरुष और मादा चूहों में ट्रांसजीन की अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए weaning के समय. - एचएसवी-टीके ट्रांसजीन-व्ययित हेप्टोसाइट्स21के जीसीवी-मध्यस्थ की कमी के प्रति उनकी उच्च संवेदनशीलता के कारण प्रत्यारोपण के लिए 6 से 8 सप्ताह की आयु में पुरुषों का चयन करें।
- पहचान को कम करने के लिए weaning या सर्जरी के समय चूहों कान टैग. पशुओं के वजन और स्वास्थ्य की स्थिति को नोट की।
- पुरुष गैर-TK-NOG litermates के साथ महिला TK-NOG चूहों प्रजनन द्वारा टी के-NOG तनाव कॉलोनी बनाए रखें और जीनोटाइपिंग द्वारा ट्रांसजेनिक वंश का चयन करें।
- मात्रात्मक वास्तविक समय पॉलिमरेज श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग करHSV-TK transgene की उपस्थिति के लिए Genotyping
- weaning के समय जीनोटाइपिंग प्रदर्शन (आमतौर पर 3 - 4 वर्ष की उम्र के सप्ताह)। जीनोटाइपिंग के लिए, एक laminar प्रवाह जैविक सुरक्षा कैबिनेट में माउस कान का एक टुकड़ा काट बाँझपन बनाए रखने और एक जीनोमिक डीएनए अलगाव किट का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए.
- मानव एल्बुमिन प्रमोटर के नियंत्रण में एचएसवी-टीके ट्रांसजीन के नियंत्रण में स्क्रीन करने के लिए कान के टुकड़े से निकाले गए जीनोमिक डीएनए को आगे प्राइमर 5'-CCATGCGTCTTTTGG-3' का 1 $L, रिवर्स प्राइमर 5'-TAAGTGCAGCG-3', 0.5 डिग्री एल जोड़कर FAM जांच 5[-FAM-AATCGCCCCGC-MGB-3', और एक वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) साधन22पर मास्टर मिश्रण के 10 डिग्री एल .
- वास्तविक समय पीसीआर सेटिंग्स निम्नानुसार सेट करें: 30 s (प्रीट्रेड चरण) के लिए 60 डिग्री सेल्सियस), 10 मिनट (होल्ड चरण) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 1 मिनट (पीसीआर चरण) के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 30 s (पोस्टरीड चरण) के लिए 60 डिग्री सेल्सियस।
नोट: 22 से नीचे की सीमा (सी टी) का एक चक्र एचएसवी-टीके ट्रांसजीन के लिए सकारात्मक माना जाता है।
- गैन्सिक्लोविर और ट्रेसल्फान का उपयोग करके उपचार
- 27 जी सुई का उपयोग करना, इंट्रापेरिटोनियल जीसीवी इंजेक्शन के साथ टी के-एनओजी चूहों को इंजेक्ट करें (6 मिलीग्राम/किग्रा) दिन में एक दिन में 2x 7 और दिन में 5 में 100 डिग्री सेल्सियस में नमकीन की सर्जरी से पहले चूहों के ट्रांसजेनिक पैरेन्काइमल कोशिकाओं को कम करने के लिए (जैसा कि चित्रा 2में प्रयोगात्मक रणनीति में दिखाया गया है )23 .
- दिन 3, 2, और 1 सर्जरी से पहले, एक 27 जी सुई का उपयोग कर, saline के 100 डिग्री एल में treosulfan (1.5 ग्राम/किलोग्राम/दिन) की nonmyeloablative intraperitoneal खुराक के साथ पूर्व शर्त चूहों।
- सर्जरी से एक दिन पहले, एक 5 मिमी लांसेट के साथ चुभन द्वारा submandibular नस से रक्त की दो से तीन बूँदें ($100 $L) आकर्षित, और सेंट्रीफ्यूगिंग द्वारा सीरम को अलग (1,500 x ग्राम के लिए 10 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस) alanine aminotransferase (ALT) के लिए वर्णन degr का आकलन करने के लिए जिगर की क्षति के ee.
- सर्जरी के लिए तैयारी
- सर्जरी से पहले चीरा साइट (परीटोनल दीवार के बाईं ओर) के आसपास माउस के फर दाढ़ी के लिए क्लिपर का प्रयोग करें।
- एक माउस संज्ञाहरण मशीन का उपयोग कर एक प्रेरण कक्ष में 3% - 5% करने के लिए ऑक्सीजन के प्रवाह को समायोजित करें और आइसोलुरेन प्रवाह 3% करने के लिए। संज्ञाहरण के लिए प्रेरण कक्ष में एक समय में एक माउस रखें.
- एक बाँझ विस्तार ट्यूब के एक छोर संलग्न (निलंबन के 550 डिग्री सेल्सियस की एक होल्डिंग क्षमता के साथ; विनिर्देशों के लिए सामग्री की मेज देखें) एक 30 जी सुई और एक 1 एमएल सिरिंज करने के लिए दूसरे छोर के लिए।
- जमा किए गए एचईपी और एचपीएससी के निलंबन (80 डिग्री सेल्सियस/माउस) के साथ सिरिंज भरें (अनुभाग 2 देखें), एक दोहराव वाले वितरण पिपेट के पायदान में सिरिंज फिट करें, और प्रत्येक प्रेस में 10 डिग्री सेल्सियस वितरित करने के लिए मशीन को समायोजित करें।
- एक बार चूहों anesthetized कर रहे हैं (आमतौर पर 3 - 4 मिनट के बाद), नाक शंकु के लिए isoflurane प्रवाह स्विच और 2% करने के लिए isoflurane प्रवाह दर को कम - 3%.
- चूहों में मानव HSPCs और hepatocytes के इंट्रास्प्लेनिक प्रत्यारोपण
- बाँझ शर्तों के तहत एक laminar प्रवाह कैबिनेट में सभी सर्जरी कदम प्रदर्शन करते हैं।
- काम की सतह पर एक साफ बाँझ कपड़ा प्लेस और एक चीरा बनाने से पहले, 10 % povidone-आयोडीन के साथ प्रत्येक माउस के शरीर के बाईं ओर साफ़ करें, 70 % आइसोप्रोपिल शराब के बाद।
- त्वचा में एक छोटा सा चीरा ($1 - 1.5 सेमी और 5 मिमी गहरा) त्वचा में, मांसपेशियों, और पर्युदर्या दीवार के बाईं ओर Vanna प्रकार कैंची के साथ peritoneal गुहा में प्रवेश करने के लिए लगभग 5 मिमी रिब पिंजरे के निचले किनारे के नीचे.
- प्लीहा का पता लगाएँ, आसान पहुँच के लिए ऑपरेटिंग क्षेत्र के लिए forceps के साथ थोड़ा खींच, और तिल्ली के निचले ध्रुव में 30 जी सुई डालने.
- वितरण पिपेट के प्लंजर अनलॉक और एक समय में मात्रा के 10 डिग्री सेल्सियस वितरित, 60 की एक सीमा के साथ - 80 $L तिल्ली प्रति। सुई को धीरे-धीरे वापस लें और प्लाथी को लिगिंग ऐपियर का उपयोग करके लिगाटिंग क्लिप के साथ क्लिप करें।
- तिल्ली को वापस शरीर गुहा में कपास से ढके हुए applicators बाँझ पीबीएस के साथ गीला के साथ धक्का।
- पेट की दीवार की मांसपेशी परत को बंद करें एक शोषक सीवन बाधित सीवन पैटर्न का उपयोग करते हुए (निरंतर नहीं)। गैर अवशोषित टांके का उपयोग कर एक बाधित सीवन पैटर्न के साथ त्वचा बंद करने को पूरा।
- सर्जरी के बाद चूहों को हाइपोथर्मिया से बचाने के लिए गर्म पानी घूम पैड का उपयोग करें।
- सर्जरी के 10-14 दिनों के बाद गैर अवशोषित टांके निकालें।
- पोस्टऑपरेटिव देखभाल
- जब प्रत्यारोपित पशु जागता है, तो एनाल्जेसिक ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम/किग्रा) इंट्रापेरिटोनली, लगातार 3 दिनों के लिए एक दिन में 2x इंजेक्ट करें।
- जानवरों को कम से कम 1x एक दिन का निरीक्षण जब तक वे सामान्य शारीरिक स्थितियों के लिए वापस.
नोट: प्रत्येक जानवर के शरीर के वजन की जाँच करें, के बाद से कुछ चूहों वजन postsurgery खो सकते हैं. चूहे आम तौर पर 1 से 2 सप्ताह में अपने मूल वजन हासिल.
4. एलिसा द्वारा मानव जिगर का सत्यापन और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मानव प्रतिरक्षा प्रणाली
नोट: मानव जिगर और प्रतिरक्षा प्रणाली मासिक के पुनर्गठन का मूल्यांकन, एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा 1 महीने के posttransplantation शुरू, क्रमशः.
- EDTA ट्यूबों में लांसेट का उपयोग कर submandibular नस से रक्त के नमूने ले लीजिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। अलग सीरम मानव एल्बुमिन के स्तर की जांच करने के लिए प्रतिरोपित मानव hepatocytes के लिए माउस जिगर के engraftment दक्षता का आकलन करने के लिए, एक मानव एल्बुमिन एलिसा परिमाणीकरण सेट का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता का पालन करके निर्देश.
नोट: गोली त्याग नहीं है और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली पुनर्गठन का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए गोलीदार कोशिकाओं का उपयोग करें। - 35 डिग्री सेल्सियस में सीरम के बिना सेल गोली को पुन: निलंबित करें एफएसीएस बफर (पीबीएस + 2% एफबीएस) और माउस-विशिष्ट CD45 (संकेंद्रण 0.5 मिलीग्राम/एमएल), 5 डिग्री एल प्रत्येक मानव-विशिष्ट एंटीबॉडी CD45 (0.1 मिलीग्राम/एमएल), सीडी3 (0.2 मिलीग्राम/एमएल), सीडी8 (0.1 मिलीग्राम/एमएल) और एमजीएल (0.1 मिलीग्राम/एमएल) और एमजीएल (0.1 मिलीग्राम) और सी.डी.एल.) के साथ दाग , और CD4 के 20 डिग्री एल (0.25 mg/mL) और CD14 (0.25 mg/mL) प्रत्येक के लिए 30 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस, CD34+ HSPCs से एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास की जांच करने के लिए.
नोट: दाग कोशिकाओं की gating निर्धारित करने के लिए unstained कोशिकाओं की एक अतिरिक्त ट्यूब जोड़ने पर विचार करें. - ऊष्मायन के बाद, एक polystyrene दौर-नीचे प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब में दाग निलंबन ($100 जेडएल) हस्तांतरण और 1x lysis बफर के 2 एमएल का उपयोग करें (सामग्री की मेजदेखें) distilled पानी के 9 भागों के साथ 10x lysis बफर के 1 भाग diluting द्वारा और incubating 10 - 15 मिनट लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए।
नोट: लाल रक्त कोशिका lysis का मूल्यांकन करने के लिए turbidity का निरीक्षण करें। एक बार नमूना स्पष्ट हो जाता है, lysis पूरा हो गया है. - lysis के बाद, ट्यूब में FACS बफर के 3 एमएल जोड़ें और एक गोली पाने के लिए 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x ग्राम पर अपकेंद्रण। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x ग्राम पर गोली और अपकेंद्रित्र के लिए FACS बफर के 3 एमएल जोड़कर धोने को दोहराएँ।
- ताजा बनाया 1% paraformaldehyde (पीएफए) में कोशिकाओं को ठीक करें और प्रवाह साइटोमीटर पर दाग कोशिकाओं के अधिग्रहण, प्रवाह सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया.
- विश्लेषण के लिए, एक FSC/SSC भूखंड पर gating लिम्फोसाइटों का चयन करें, FSC-क्षेत्र/FSC-ऊँचाई पर एकल-सेल gating द्वारा पीछा किया।
- इसके अलावा, एकल कोशिका जनसंख्या पर मानव-विशिष्ट CD45 (hCD45) के लिए गेट और murine मूल के कोशिकाओं के बहिष्कार के लिए माउस-विशिष्ट CD45 (mCD45) शामिल हैं. बेदाग कोशिकाओं की गेटिंग के आधार पर दागी हुई जनसंख्या की रणनीति बनाना।
- गेट hCD45+ कोशिकाओं CD3+ टी कोशिकाओं और CD19+ बी कोशिकाओं की आवृत्ति निर्धारित करने के लिए। गेट टी कोशिकाओं CD4 और CD8 सबसेट निर्धारित करने के लिए. monocytes का मूल्यांकन करने के लिए, CD14+ monocytes निर्धारित करने के लिए hCD45 पर गेट.
5. टी के एचआईवी संक्रमण-NOG चूहे और मानव जिगर और प्रतिरक्षा प्रणाली पर इसके प्रभाव
- एक नामित जैव सुरक्षा स्तर 2 सुविधा में एचआईवी-1 वायरस और सभी संक्रमित चूहों को संभालें।
चेतावनी: ऑटोक्लेव और डबल biohazard बैग में सभी एचआईवी संक्रमित कचरे को त्याग दें। सुरक्षा कारणों से, एचआईवी संक्रमित चूहों को सौंपने के दौरान कट-प्रतिरोधी दस्ताने पहनें। - वायरस के साथ काम करते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (PPE) पहनें, जिसमें डिस्पोजेबल कवरल गाउन, जूते कवर, एक फेस मास्क, और डबल दस्ताने शामिल हैं।
- मानव CD45+ कोशिकाओं के 15% से अधिक के पुनर्गठन के साथ चूहों का चयन करें (चरण 4.7 में परीक्षण) और एचआईवी-1 संक्रमण के लिए सीरम में मानव एल्बुमिन की उपस्थिति के साथ (चरण 4.1 में परीक्षण किया).
- चूहों के साथ इंजेक्शन 1 x 103 करने के लिए 1 x 104 ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक 50 (TCID50) एचआईवी-1एडीए की एक मात्रा में 100 - 200 $L प्रति माउस, intraperitoneally.
- एचआईवी संक्रमित चूहों की इच्छा 5 सप्ताह के बाद का संक्रमण isoflurane का उपयोग करके (एक isoflurane वाष्प एकाग्रता के साथ)
- चूहों ethanizing के बाद, सीरम के अलगाव के लिए एक कार्डियक पंचर द्वारा EDTA ट्यूबों में रक्त इकट्ठा, ELISA द्वारा मानव-विशिष्ट एल्बुमिन के स्तर का मूल्यांकन करके जिगर पर एचआईवी-1 के प्रभाव को देखने के लिए (चरण 4.1 देखें) और रक्त कोशिकाओं मानव प्रतिरक्षा में परिवर्तन के लिए जाँच करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने वाले कोशिकाएं (चरण 4.2 - 4.8 देखें)।
नोट: परिधीय वायरल लोड का आकलन 5 सप्ताह एक bioanalyzer पर postinfection की पुष्टि करने के लिए अगर चूहों संक्रमित हैं. - रक्त खींचने के बाद, इच्छामृत्यु वाले चूहों से जिगर को निकाल दो।
- जिगर चीरा के लिए, 1.5 - 2 सेमी लंबी और 0.5 सेमी गहरी त्वचा, मांसपेशियों में, और peritoneum, xyphoid से एक चीरा बनाकर पेट की गुहा का पर्दाफाश. जिगर और डायाफ्राम के बीच रीढ़ की हड्डी के लंबवत एक कट बनाओ. जिगर लिफ्ट और किसी भी झिल्ली यह पेट और आंतों के लिए संलग्न तोड़.
- रात भर 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में यकृत को एकत्र और ठीक करें और मानव-विशिष्ट CK18 एंटीबॉडी8का उपयोग करके CK18+ hepatocytes पर एचआईवी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रोटोकॉल का पालन करें।
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Representative Results
मानव जिगर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ एक दोहरी मानवीय माउस मॉडल की स्थापना आसानी से बहुत सरल एलिसा और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ प्रत्येक कदम पर नजर रखी जा सकती है, क्रमशः. प्रवाह साइटोमेट्री नियमित रूप से एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास का मूल्यांकन करने के लिए और प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर एचआईवी संक्रमण के प्रभाव को देखने के लिए किया जाता है। दोहरी मानवीय चूहों में, कार्यात्मक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विकास से रेंज कर सकते हैं 15% लिम्फोसाइट गेट के 90% के लिए. प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रतिनिधि सबसेट डॉट प्लॉट्स में दिखाएजातेहैं ( चित्र 3 )। मानव hepatocytes के engraftment के मूल्यांकन के लिए, मानव-विशिष्ट एल्बुमिन स्तर के लिए एलिसा माउस सीरम पर मासिक प्रदर्शन किया जाता है। एचएसपीसी और एचईपी दोनों के साथ engrafted चूहे एक महीने में $ 7 ग्राम/एमएल से 377 डिग्री ग्राम/एमएल तक मानव-विशिष्ट एल्बुमिन स्तर दिखाते हैं, अवलोकन के समय में विकसित करने के लिए जारी (6 महीने) (चित्र 4)। दोहरी मानवीकृत चूहों के रक्त में मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर एचआईवी संक्रमण के प्रभाव को मानव-विशिष्ट एल्बुमिन एलिसा द्वारा प्रवाह साइटोमेट्री और यकृत में एचईपी पर निगरानी रखी जाती है। 5 सप्ताह तक, एचआईवी-1 सीरम में मानव एल्बुमिन के स्तर में कमी का कारण बनता है, जैसा कि एलिसा द्वारा मूल्यांकन किया गया है, और मानव सीके 18+ हेपाटोसाइट्स की यकृत वर्गों में दोहरी मानवीय चूहों की कमी है, जैसा कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया है (चित्र 5)। CD4 का एक कम अनुपात:CD8 आम तौर पर देखा जाता है, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा, एचआईवी संक्रमित चूहों के रक्त और जिगर में, संक्रमण से पहले एक ही माउस में नोट किए गए स्तरों की तुलना में (चित्र 6)। प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण सभी अभिकर्मकों और सामग्रियों पर सामग्री तालिकामें चर्चा की जाती है।
चित्र 1 : CD34 के संवर्धन के Schematic+ गर्भनाल रक्त से कोशिकाओं. (ए) गर्भनाल रक्त लिम्फोसाइटों जुदाई माध्यम (एलएसएम) पर स्तरित है और buffy कोट को अलग करने के लिए centrifuged. (बी) एलएस कॉलम एक चुंबकीय स्टैंड पर रखा जाता है और बीएसए बफर के साथ कुल्ला, buffy कोट जोड़ने के बाद. CD34 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं कॉलम में फंस रहे हैं, और CD34- कोशिकाओं को अलग ट्यूबों में eluted हैं. स्तंभ रेजिन में फंस CD34+ कोशिकाओं एक प्लंजर के साथ गिर रहे हैं, और कोशिकाओं को एक नई ट्यूब में एकत्र कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : मानवीकृत जिगर और प्रतिरक्षा प्रणाली चूहों के दोहरे पुनर्गठन के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन के Schematic दृश्य, एचआईवी-1 संक्रमण के बाद. TK-NOG चूहों ganciclovir के साथ इंजेक्शन कर रहे हैं (GCV) की एक खुराक पर 6 mg/kg, 2x एक दिन, दिन पर -7 और दिन -5, दिन पर एक treosulfan इंजेक्शन के बाद -3, -2 और -1. प्रत्यारोपण के लिए चूहों स्क्रीन करने के लिए (Tx), एक alanine एमिनोट्रांसफरेज़ (ALT) परख सर्जरी से पहले एक दिन किया जाता है, और ALT के स्तर के साथ चूहों और lt;600 U/L का चयन कर रहे हैं. प्रत्यारोपण के बाद, चूहों प्रवाह cytometry द्वारा मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के पुनर्गठन के लिए जाँच कर रहे हैं (FACS) और जिगर पुनर्गठन के लिए उनके एल्बुमिन स्तर का आकलन करके एलिसा का उपयोग कर. चूहों एचआईवी से संक्रमित हैं-1 5 सप्ताह पहले वे बलिदान कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण रक्त के मानव कोशिका वितरण के लिए रणनीति gating. (ए) सबसे पहले, लिम्फोसाइट्स FSC-A और एसएससी-ए के आधार पर पूरे रक्त पर गेट किए जाते हैं। (बी) एकल कोशिकाओं लिम्फोसाइटों पर द्वार कर रहे हैं. (ग)मानव CD45+ ल्यूकोसाइट्स माउस CD45 और मानव CD45 का उपयोग कर एकल कोशिकाओं पर गेट कर रहे हैं. (डी) सीडी 3+ टी कोशिकाओं और CD19+ बी कोशिकाओं gated CD45+ मानव ल्यूकोसाइट्स पर पहचान कर रहे हैं। (ई) सीडी 4+ टी सहायक कोशिकाओं और सीडी 8+ साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं gated CD3+ टी कोशिकाओं में पहचान कर रहे हैं। (च) सीडी 14+ मोनोसाइट्स मानव सीडी 45+ ल्यूकोसाइट्स से गेट किए गए हैं। यहाँ का प्रतिनिधित्व परिणाम एक माउस से दोहरी मानव hepatocytes और HSPCs के साथ प्रतिरोपित कर रहे हैं. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
चित्र 4 : Albumin एकाग्रता दोहरी मानवीय चूहों के सीरम में एलिसा द्वारा मापा जाता है. चूहों दोनों मानव hepatocytes के साथ प्रतिरोपित कर रहे हैं (HEPs) और CD34+ hematopoietic स्टेम / सीरम 1, 4, और 6 महीने posttransplantation पर अलग अलग समय पर एकत्र किया जाता है, और कमजोर पड़ने के लिए मानकों की सीमा में अज्ञात नमूना सांद्रता को समायोजित करने के लिए बना रहे हैं. प्रत्येक प्रतीक एक अलग-अलग माउस मान का प्रतिनिधित्व करता है। परिणाम औसत, साथ ही व्यक्तिगत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। * पी एंड एलटी; 0.05, एक तरह से ANOVA द्वारा। यह आंकड़ा डागुर एट अल से संशोधित किया गयाहै. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5 : सीरम में एल्बुमिन के स्तर पर एचआईवी-1 पर प्रभाव और दोहरी मानवीय चूहों के जिगर में CK18+ मानव hepatocytes की कमी. (ए) एल्बुमिन सांद्रता की निगरानी संक्रमित चूहों(द ] 9 ) में मानव एचईपी और एचपीएससी दोनों के साथ 1 और 4 महीने में प्रतिरोपित की जाती है। चूहों संक्रमित कर रहे हैं (n $ 10) एचआईवी के साथ 4 - 5 महीने posttransplantation और बलिदान 5 सप्ताह के बाद संक्रमण. प्रत्येक प्रतीक एक अलग-अलग माउस मान का प्रतिनिधित्व करता है। परिणाम औसत, साथ ही व्यक्तिगत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। * पी एंड एलटी; 0.05, एक तरह से ANOVA द्वारा। यह आंकड़ा डागुर एट अल से संशोधित किया गयाहै. 8. (बी) असंक्रमित (एचईपी + एचपीएससी, बाएं पैनल) और एचआईवी संक्रमित टीके-नोग चूहों (एचईपी + एचएसपीसी + एचआईवी, दाएं पैनल) से पांच-माइक्रोन यकृत अनुभाग स्थिर हैं, पैराफिन एम्बेडेड, और मानव साइटोकेराटिन-18 (CK18) एंटीबॉडी के लिए दाग। एचआईवी-1 के कारण CK18+ hepatocytes की कमी CK18+ मानव कोशिकाओं द्वारा एक कम कब्जा क्षेत्र द्वारा सबूत है. यहाँ का प्रतिनिधित्व परिणाम एक uninfected और एक एचआईवी संक्रमित माउस दोहरी मानव hepatocytes और HSPCs. स्केल सलाखों के साथ प्रतिरोपित से कर रहे हैं $ 100 $m. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
चित्र 6 : सीडी 4का अनुपात + कोशिकाओं को सीडी 8+ परिधीय रक्त में टी कोशिकाओं और दोहरी पुनर्गठन uninfected और एचआईवी-1 संक्रमित चूहों के जिगर में. दोहरी पुनर्गठन uninfected चूहों के लिए: बंद चक्र; एचईपी + एचपीएससी; रक्त n ] 7; जिगर n ] 6. एचआईवी-1 संक्रमित चूहों के लिए: खुले हलकों; एचईपी + एचपीएससी + एचआईवी; रक्त n ] 10; जिगर n ] 11. परिणाम औसत, साथ ही व्यक्तिगत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। * पी एंड 0.05, एचआईवी संक्रमित और संक्रमित चूहों के बीच एक तरह से ANOVA परीक्षण द्वारा। यह आंकड़ा डागुर एट अल से संशोधित किया गयाहै. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
एचआईवी संक्रमित रोगियों में यकृत के साथ समझौता किया जाता है और क्षतिग्रस्तहो जाताहै । एचआईवी-1 की उपस्थिति में मानव यकृत रोगों के अध्ययन के लिए प्रायोगिक छोटे पशु मॉडल अत्यंत सीमित है, CD34+ HSPCs और hepatocytes7,12के साथ कुछ cotransplanted पशु मॉडल की उपलब्धता के बावजूद, 25. इन विट्रो प्रयोगों में, हेपेटोसाइट्स को निम्न स्तर के एचआईवी-1 संक्रमण26में दिखाया गया है। मानव कोशिकाओं के दोनों प्रकार ले कि मानव चूहों एक वांछनीय मॉडल हैं. केवल मानव प्रतिरक्षा प्रणाली वाले चूहों के यकृत को मानव नियामक टी कोशिकाओं20,27के प्रायोगिक कमी के तहत एचआईवी संक्रमण से प्रभावित दिखाया गया है . हालांकि, माउस और मानव hepatocytes की प्रतिरक्षा और कार्यात्मक गुणों में अंतर एचआईवी-1 और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं में अंतर को रेखांकित कर सकते हैं. इस समीक्षा में, एक प्रोटोकॉल दोनों मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और जिगर का पुनर्गठन करने के लिए और एचआईवी-1-संबद्ध जिगर इम्यूनोपैथोलॉजी पता करने के लिए वर्णित है, के रूप में एचआईवी-1 संक्रमित रोगियों में मनाया. TK-NOG पुरुष चूहों एचएसवी-टीके ट्रांसजीन के उनके जिगर चयनात्मक उच्च MRNA अभिव्यक्ति और माउस ट्रांसजेनिक जिगर21करने के लिए जीसीवी विषाक्तता की संवेदनशीलता के कारण चुना गया था। इसके अलावा, उन्हें बहिर्जात औषधियों के उपयोग के बिना प्रत्यारोपण के बाद लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है और सहज प्रणालीगतरोगोंका विकास नहीं होता है। मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और जिगर पुनर्गठन स्थापित करने के लिए, माउस प्रतिरक्षा प्रणाली और माउस विशेष जिगर की कोशिकाओं को नुकसान के ablation की आवश्यकता है और treosulfan और GCV के nonmyeloablative खुराक का उपयोग कर हासिल की, के रूप में पहले TK-NOG पुरुष चूहों में दिखाया13 ,23. चूहे 6 - 8 सप्ताह की उम्र में जीसीवी और treosulfan के साथ इंजेक्शन कर रहे हैं, के रूप में transgene और जीसीवी प्रेरित यकृत चोट की अभिव्यक्ति के रूप में ALT स्तर द्वारा मूल्यांकन इष्टतम हैं, तो, आला करने के लिए ट्रांसप्लांट मानव कोशिकाओं प्रदान करने के लिए21. एएलटी स्तर ों को दिखाने वाले चूहे, लेकिन आमतौर पर प्रत्यारोपण के लिए चुने जाते हैं। के ALT स्तर दिखा चूहे और 600 U/L मानव hepatocytes क्षतिग्रस्त माउस जिगर समारोह को बचाने के लिए सक्षम नहीं हैं के रूप में मौत का एक बड़ा खतरा है.
वर्तमान में, दोहरी humanization मानव CD34+ HSPCs और भ्रूण जिगर की कोशिकाओं के प्रत्यारोपण द्वारा दिखाया गया है; तथापि, नवजात शिशुओं के हेरफेर से तकनीकी समस्याएंपैदा होती हैं 13,14. HSPCs प्राप्त या भ्रूण जिगर कोशिकाओं (FLCs), भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs), और सीबी के रूप में कई स्रोतों से अलग किया जा सकता है. हालांकि, नैतिक मुद्दों ESCs और FLCs. सीबी के उपयोग को बाधित कोई प्रतिबंध नहीं है और HSPCs प्राप्त करने के लिए एक सबसे उपयोगी विकल्प है, साथ ही आदिम hematopoietic स्टेम और संतति कोशिकाओं है कि कार्यात्मक प्रतिरक्षा पुनर्गठन कर सकते हैं का एक कीमती स्रोत जा रहा है प्रणाली. गर्भनाल रक्त एक दिन से अधिक पुराने नहीं होना चाहिए जब HSPCs को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया, के रूप में HSPCs की उपज अत्यधिक उम्र से प्रभावित है. कोशिकाओं के क्रायोरसेविंग से पहले पृथक HSPCs की शुद्धता की जांच करने की आवश्यकता है। CD3+ टी कोशिकाओं के पार संदूषण से बचा जाता है, क्योंकि यह प्रणालीगत माउस कलम के लिए नेतृत्व कर सकते हैंबनाममेजबान रोग और एचईपी के तीव्र alloreation जबकि बेमेल कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपण.
वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हेपाटोसाइट्स का उपयोग यकृत पुनर्गठन8,13के लिए एक स्रोत के रूप में किया गया था . वयस्क हेपाटोसाइट्स को29वर्ष की अवधि के लिए engraftment और स्थिरता में उनकी बढ़ी हुई दक्षता के कारण यकृत पुनर्गठन की स्थापना के लिए पसंद किया जाता है .
एक माउस मॉडल में मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की उपस्थिति ALB के स्तर में वृद्धि हुई, जैसा कि पहले दिखाया गया30,31. हालांकि, hepatocytes और प्रतिरक्षा प्रणाली पुनर्गठन की दक्षता दाता कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों के साथ भिन्न हो सकते हैं और प्राप्तकर्ता माउस पर निर्भर करते हैं. तो, प्रत्येक माउस engraftment के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा एंटीबॉडी या अभिकर्मक है कि मानव-विशिष्ट हैं और माउस कोशिकाओं के साथ पार प्रतिक्रिया नहीं का उपयोग करने के लिए है. यहाँ प्रस्तुत अध्ययन में प्रयुक्त मानव-विशिष्ट अभिकर्मकों और एंटीबॉडी सामग्री तालिकामें विस्तृत हैं। यदि सामग्री की तालिका में प्रदान के अलावा अन्य एंटीबॉडी अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है, मानव विशिष्टता के लिए जाँच करने के लिए सुनिश्चित हो.
इष्टतम स्थिति syngeneic कोशिकाओं के प्रत्यारोपण होगा; हालांकि, कि तकनीकी रूप से प्राप्त करने के लिए मुश्किल है. जहाँ भी संभव हो, HSPCs और hepatocytes आंशिक रूप से मिलान मानव ल्यूकोसाइट वर्ग-1 प्रतिजनों के साथ दाताओं से जमा किया जाना चाहिए (HLA-A2 की तरह).
एचआईवी अध्ययन के लिए चूहों स्क्रीन करने के लिए, रक्त इष्टतम प्रतिरक्षा और जिगर पुनर्गठन निर्धारित करने के लिए कई समय अंक पर तैयार की है; प्रवाह साइटोमेट्री और एलिसा पसंद कर रहे हैं के रूप में वे रक्त की केवल एक छोटी राशि के साथ किया जा सकता है. रक्त कोशिकाओं और एक ही नमूने से सीरम प्रवाह साइटोमेट्री और एलिसा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्रमशः. यह प्रत्येक समय बिंदु पर सीरम की उचित कमजोर पड़ने बनाने के लिए महत्वपूर्ण है (1,000 - 40,000 रेंज) ALB स्तर का मूल्यांकन करने के लिए इतना है कि अज्ञात सांद्रता मानक सांद्रता की सीमा के भीतर लाया जा सकता है (किट रेंज: 6.25 - 400 एनजी /
मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की उपस्थिति में एचआईवी-1 संक्रमण के जवाब में प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स भी हेपेटोसाइट्स और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बातचीत को संबोधित करने में उपयोगी हो सकता है। मॉडल एचआईवी-1 प्रेरित जिगर की बीमारी के इम्यूनोपैथोजेसिस दिखाने के लिए उपयोगी है, यह देखते हुए कि यह मनुष्यों में के रूप में एक ही तरीके से जिगर की क्षति recapitulates, CD4 के एक कम अनुपात से सबूत:CD8, ALB के स्तर में कमी, मानव hepatocyte मौत, और जिगर प्रतिरक्षा सक्रियण. मॉडल भी कुछ सीमाएं हैं, इस तरह के cytotoxic टी कोशिकाओं गतिविधि और बिगड़ा इम्यूनोग्लोबुलिन वर्ग स्विचन के एक निम्न स्तर के रूप में. मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और यकृत दोनों की उपस्थिति के कारण, यहां प्रस्तुत मॉडल एचआईवी-1 और हेपेटाइटिस वायरस, क्रोनिक हेपेटाइटिस संक्रमण (एंटी-हेपेटाइटिस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए) और सिरोसिस के रूप में स्टडी सह संक्रमण के लिए वादा कर रहा है मॉडल.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R24OD018546 (L.Y.P. और S.G. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों को शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में मदद के लिए Weizhe ली, पीएच.डी., धन्यवाद करना चाहते हैं, अमांडा शाखा वुड्स, बी एस, प्रतिरक्षा विज्ञान के लिए यान चेंग, UNMC प्रवाह साइटोमेट्री अनुसंधान सुविधा के सदस्यों के निदेशक फिलिप हेक्सले, पीएच.डी., विक्टोरिया बी स्मिथ, बी.एस., और सामन्था वॉल, बी.एस., UNMC उन्नत माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा के सदस्यों जेनिस ए टेलर, बी.एस., और जेम्स आर Talaska, बी.एस., तकनीकी सहायता के लिए. लेखकों TK-NOG चूहों और डॉ Joachim Baumgart treosulfan प्रदान करने के लिए प्रदान करने के लिए सीआईईए से Drs. Mamoru Ito और हिरोशी Suemizu स्वीकार करते हैं. लेखकों डॉ एड्रियन Koesters, UNMC, पांडुलिपि के लिए अपने संपादकीय योगदान के लिए धन्यवाद.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).