Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

إنشاء نموذج الماوس ثنائي الأنسنة TK-NOG لمسببات أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية

doi: 10.3791/58645 Published: September 11, 2019

Summary

يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لإنشاء الفئران أنسنة مع كل من الجهاز المناعي البشري وخلايا الكبد. الفئران المزدوجة التي تعاني من نقص المناعة التي تحققت عن طريق الحقن داخل الطحال من خلايا الكبد البشرية وCD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم عرضة للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 وتلخيص تلف الكبد كما لوحظ في المرضى المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية.

Abstract

وعلى الرغم من زيادة العمر المتوقع للمرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1)، فقد برز مرض الكبد كسبب شائع لاعتلالهم. ولا يزال علم أمراض المناعة في الكبد الناجم عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 بعيد المنال. يمكن للنماذج الحيوانية الصغيرة xenograft مع خلايا الكبد البشرية والجهاز المناعي البشري تلخيص البيولوجيا البشرية من مسببات الأمراض المرض. هنا، يتم وصف بروتوكول لإنشاء نموذج الماوس المزدوج أنسنة من خلال خلايا الكبد البشرية وCD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم / الخلايا السلف (HSPCs) زرع، لدراسة أمراض المناعة الكبد كما لوحظ في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. ولتحقيق إعادة تشكيل مزدوجة، فإن الذكور من المعارف التقليدية - NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK) يتم حقن الفئران داخل الحالبة بجرعات غانسيكلوفير (GCV) للقضاء على خلايا الكبد المعدلة وراثيا الماوس، ومع treosulfan لتكييف nonmyeloablative، وكلاهما تسهيل نمو خلايا الكبد البشرية (HEP) وتطوير الجهاز المناعي البشري (HIS). يتم تقييم مستويات الزلال البشري (ALB) لتطعيم الكبد، ووجود الخلايا المناعية البشرية في الدم التي تم الكشف عنها عن طريق قياس التدفق يؤكد إنشاء الجهاز المناعي البشري. النموذج الذي تم تطويره باستخدام البروتوكول الموضح هنا يشبه مكونات متعددة من تلف الكبد من عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1. ويمكن أن يثبت أن إنشائها ضروري لإجراء دراسات عن العدوى المشتركة بفيروس التهاب الكبد ولتقييم العقاقير المضادة للفيروسات ومضادات الفيروسات العكوسة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ومنذ ظهور العلاج المضاد للفيروسات العكوسة، حدث انخفاض كبير في الوفيات المتصلة بالعدوى الأحادية لفيروس نقص المناعة البشرية -1. ومع ذلك، فقد برز مرض الكبد كسبب شائع للاعتلال في المرضى المصابين بفيروس نقصالمناعةالبشرية1،2. العدوى المشتركة لفيروسات التهاب الكبد مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 هي أكثر شيوعا، مما يمثل 10٪ - 30٪ من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية في الولايات المتحدة5.

وتحد خصوصية المضيف لفيروسات فيروس نقص المناعة البشرية-1 والتهاب الكبد من فائدة النماذج الحيوانية الصغيرة في دراسة الأمراض المعدية الخاصة بالإنسان أو للتحقيق في جوانب متعددة من مسببات أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية-1. الفئران التي تعاني من نقص المناعة التي تسمح بتطعيم الخلايا البشرية و / أو الأنسجة (تسمى نماذج الماوس أنسنة) هي نماذج حيوانية مقبولة للدراسات ما قبل السريرية6،7،8. منذ إدخال الفئران الأنسنة في أوائل 2000s، دراسات ما قبل السريرية متعددة من سمية الكبد البشري cholestatic، مسببات الأمراض الخاصة بالإنسان، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1 والاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية، فيروس ابشتاين بار، التهاب الكبد، وغيرها الأمراض المعدية، وقد تم التحقيق في هذه الفئران10،11. وقد وضعت نماذج الماوس متعددة لCD34+ HSPCs و / أو زرع خلايا الكبد البشرية منذ فترة طويلة، وقد تحسنت مع مرور الوقت لدراسة مسببات الأمراض من فيروس التهاب الكبد B (HBV) المرتبطة بمرض الكبد12، 13 , 14.وتستند عدة نماذج لزراعة HSPC وخلايا الكبد البشرية (HEP) على سلالات، والمعروفة باسم NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13,NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15,Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12,and fah-/- NOD rag1-/- [إيل2رغهمل] فأرة16. ومع ذلك، فإن لكل نموذج مزاياه وقيوده الخاصة؛ على سبيل المثال، الفئران ذات الأنسنة المزدوجة AFC8 لـ HEPs والخلايا الجذعية البشرية (HSCs) على خلفية Balb/C-Rag2-/- γc-/- الخلفية تمكن من تطعيم الخلايا المناعية وHSCs بنجاح، ولكن هناك غياب مستضد محدد T- و B-الخلية استجابة في هذا النموذج12. وتشمل الشواغل الرئيسية في إعادة تشكيل الفئران ذات الأنسنة المزدوجة الطعوم دون المستوى الأمثل، وعدم وجود نماذج مناسبة لدعم الأنسجة المختلفة، والظروف غير المتطابقة، ورفض المناعة، أو مرض الكسب غير المشروعمقابلالمضيف (GVHD)، والتقنية الصعوبات، مثل التلاعب محفوفة بالمخاطر مع حديثي الولادة وارتفاع معدلات الوفيات بسبب تشوهات التمثيل الغذائي13.

على الرغم من أن الفئران أنسنة قد استخدمت لبحوث فيروس نقص المناعة البشرية لسنوات عديدة17،18،19، واستخدام الفئران أنسنة لدراسة تلف الكبد الناجم عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 كان محدودا20. أبلغنا سابقا إنشاء نموذج الماوس TK-NOG المزدوج أنسنة وتطبيقها في أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية8. هذا النموذج يظهر الطعوم قوية من الكبد والخلايا المناعية ويلخص مسببات الأمراض عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. تقدم هذه المناقشة بروتوكولًا مفصلًا، بما في ذلك الخطوات الأكثر أهمية في زرع خلايا الكبد البشرية. كما يُقدَّم وصف للمركبات ذات الـ HSPCs اللازمة لنجاح عملية الطعوم من الملوثات التي تكون خالية من الحشرات وإنشاء نظام مناعي وظيفي في فئران TK-NOG. يتم تفصيل استخدام هذه الفئران لدراسة مسببات الأمراض المناعية الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. يتم استخدام الفئران الذكور TK-NOG تحمل فيروس الهربس البسيط محددة نوع 1 كيناز الثيميدين (HSV-TK) transgene. خلايا كبد الماوس التي تعبر عن هذا الترانسجين يمكن بسهولة أن تُقال بعد التعرض لفترة وجيزة لجرعة غير سامة من GCV. يتم الحفاظ على خلايا الكبد البشرية المزروعة بشكل مستمر داخل كبد الفأر دون أدوية خارجية21. كما يتم شروط مسبقة الفئران مع جرعات nonmyeloablative من treosulfan لخلق مكانة في نخاع العظام الماوس للخلايا البشرية8. يتم حقن الفئران TK-NOG نقص المناعة داخل مع HEPs وHSPCs متعددة القوى. ثم يتم رصد الفئران بانتظام لإعادة تشكيل الدم والكبد عن طريق علم الدم المناعي وقياسات مستويات المصل الإنسان الزلال، على التوالي. يتم حقن الفئران مع إعادة تشكيل ناجحة لأكثر من 15٪ لكل من الخلايا المناعية البشرية وHEPs داخل احصام الله مع فيروس نقص المناعة البشرية-1. يمكن تقييم تأثير فيروس نقص المناعة البشرية على الكبد في وقت مبكر من 4 - 5 أسابيع بعد العدوى. ومن الأهمية بمكان ملاحظة أنه، نظرا لاستخدام فيروس نقص المناعة البشرية-1، يجب اتخاذ جميع الاحتياطات اللازمة أثناء التعامل مع الفيروس وحقنه في الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في المركز الطبي لجامعة نبراسكا.

ملاحظة: الحصول على موافقة من IACUC المحلية قبل إجراء التجارب على الحيوانات.

1- معالجة دم الحبل السري وعزل ة الإنسان

  1. تنفيذ جميع خطوات البروتوكول في ظل ظروف معقمة في خزانات تدفق laminar.
  2. تناول دم الحبل السري (CB) الذي تم جمعه في الأنابيب المعمرة وجعل حجم الصوت يصل إلى 35 مل عن طريق إضافة ملحية عازلة من الفوسفات (PBS). طبقة العينة على رأس الخلايا الليمفاوية فصل المتوسطة (LSM) كما هو موضح في الشكل 1 والطرد المركزي LSM مع CB الطبقات في 400 × ز لمدة 35 دقيقة في 4 درجة مئوية مع عدم وجود الفرامل.
    ملاحظة: تمييع الدم بعناية وبلطف لتجنب الخلط في الواجهة.
  3. إزالة أعلى LSM وطبقة البلازما بعناية ونقل واجهة معطف برتقالي أبيض إلى أنبوب جديد باستخدام ماصة نقل.
  4. إعادة تعليق معطف برتقالي في 30 - 40 مل من الجليد الباردة العازلة (PBS + 0.5٪ ألبوم المصل البقري [BSA] + 2 M حمض الإيثيلين ديامينتيراسيتيك [EDTA]). باستخدام ماصة، الجمع بين 20 درجة مئوية من تعليق الخلية مع 20 درجة مئوية من 0.4٪ الأزرق تريبان وماصة 10 €L من الخليط في الافتتاح الخارجي لأي من الغرفتين من شريحة العد وإدراج الشريحة في عداد الخلية الآلي لحساب الخلايا.
    ملاحظة: استخدام الجليد الباردة العازلة في جميع الخطوات، كما أنه يساعد على الحفاظ على الخلايا قابلة للحياة.
  5. طرد مركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية واستنشاق supernatant بعناية. ثم، إضافة 300 درجة مئوية من الجليد الباردة العازلة.
  6. إضافة 100 درجة مئوية من مستقبلات Fc الإنسان حجب الكاشف و 100 درجة مئوية من أحادية النسيلة الماوس المضادة للإنسان CD34 الأجسام المضادة للجسم المترافق microbeads لمدة تصل إلى 1 × 108 خلايا (انظر جدول المواد). الحضانة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية، إضافة 10 مل من الجليد الباردة العازلة لغسل الخلايا، والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: توسيع هذا وفقا لرقم الخلية في حالة وجود أكثر من 1 × 108 الخلايا.
  7. إزالة بعناية supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 500 درجة مئوية من العازلة، والمضي قدما في خطوة الفصل المغناطيسي لإثراء HSPCs.
  8. ضع عمود LS اختيار إيجابي (راجع جدول المواد)في حقل فرز الخلايا المغنطيسية ومررها باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت.
  9. تحميل العينة إلى العمود LS التي يمكن أن فخ microbeads ملزمة CD34 + الإنسان في عينات والسماح لها بالتدفق تحت تأثير الجاذبية في أنبوب جمع.
  10. غسل العمود 3X مع المخزن المؤقت وجمع elute في نفس أنبوب جمع CD34- جزء من الخلايا.
  11. قم بالغطس في العمود باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت للوصول إلى CD34+ الخلايا في أنبوب تجميع جديد. كرر الإجراء لتحقيق نقاء >90%.
  12. عد CD34+ الخلايا باستخدام صبغة الأزرق تريبان في مقياس الهيموشتوي. بعد العد، الطرد المركزي CD34+ الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل supernatant.
  13. إعادة تعليق CD34+ الخلايا في 25 ميكرولتر من PBS لحقن لاستخدامها على الفور في زرع أو حفظ الخلايا بالتبريد بتركيز 1-2 مليون /مل في تجميد المتوسطة (روزويل بارك معهد ميموريال معهد المتوسطة [RPMI 1640 المتوسطة] + 50٪ الجنين مصل البقر (FBS) + 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) لمزيد من الاستخدام في زرع.
    ملاحظة: إعادة سرد الخلايا القابلة للحياة دائمًا قبل استخدامها في الزرع.
  14. للتحقق من نقاء CD34+ elute، واتخاذ 50 درجة مئوية من التعليق واحتضانه مع 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD34 المضادة للبشرية PE مترافق لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. بعد حضانة الأجسام المضادة، وغسل الخلايا الملونة مع PBS، وإعادة تعليقها في 100 درجة مئوية من PBS، ومن ثم، والمضي قدما لأداء قياس التدفق. إضافة أنبوب إضافي من الخلايا مع عدم وجود الأجسام المضادة لتصميم البوابة في مقياس التدفق.
  15. بعد الاكتساب، قم بتحليل البيانات عن طريق تحديد المنطقة ذات الأهمية على مخطط تشتت أمامي (FSC) وتشتت جانبي (SSC)، متبوعاً بإضافة خلايا واحدة على قطع الأراضي التي تحتوي على منطقة FSC وارتفاع FSC. بوابة CD34-الخلايا الإيجابية على خلايا واحدة في قناة PE ومؤامرة منطقة SSC.

2. إعداد خلايا الكبد البشرية لزرعها

  1. إزالة خلايا الكبد المحفوظة بالتبريد من النيتروجين السائل، وغمر القارورة بسرعة في حمام الماء، وذوبان لمدة 90 - 120 ق تقريبا.
  2. إزالة غطاء القارورة وصب خلايا الكبد المذابة في أنبوب مخروطي 50 مل من وسط ذوبان الدافئة.
  3. تعليق الخلايا عن طريق هز أنبوب 50 مل باليد لبضع ثوان.
    ملاحظة: لا دوامة الأنبوب.
  4. بيليه الخلايا في 100 × ز لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا الكريات في PBS مع 0.1٪ BSA وتجميعها مع HSPCs الطازجة أو المذابة (نسبة 10:1) في PBS في حجم نهائي من 80 درجة مئوية / الماوس.

3. مناولة الحيوانات، والفحص، والنماذج الجينية، والعلاج لزرع HSPC وخلايا الكبد البشرية

  1. التعامل مع الحيوانات
    1. نتيجة لنقص المناعة الشديد، تولد، منزل، والتعامل مع الفئران TK-NOG في ظل ظروف العقيم.
    2. ارتداء دائما معطف المختبر، والقفازات، ويغطي الأحذية، وقناع الوجه لمنع العدوى مع الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض المحتملة.
    3. استخدام قفازات معقمة والأدوات لعملية جراحية والتعامل مع الحيوانات عنقمية طوال الجراحة.
  2. اختيار فئران TK-NOG للتجربة
    1. الحفاظ على مستعمرة سلالة TK-NOG عن طريق تربية الفئران TK-NOG الإناث مع الذكور غير TK-NOG القمامة واختيار الذرية المعدلة وراثيا عن طريق علم الوراثة.
      ملاحظة: إجراء النماذج الجينية (انظر الخطوة 3-3) لتحديد وجود أو عدم وجود الجين المتحول في الفئران الذكور والإناث حديثي الولادة في وقت الوهن.
    2. اختيار الذكور في 6-8 أسابيع من العمر للزرع بسبب حساسيتهم العالية لاستنفاد GCV بوساطة من HSV-TK transgene التعبير عن خلايا الكبد21.
    3. الأذن العلامة الفئران في وقت الوين أو الجراحة لتسهيل تحديد الهوية. لاحظ أسفل الوزن والحالة الصحية للالحيوانات.
  3. الكتابة الجينية لوجود ترانسجين HSV-TK باستخدام تفاعل متسلسل بوليميراز في الوقت الحقيقي
    1. أداء النماذج الجينية في وقت الوين (عادة في 3 - 4 أسابيع من العمر). للكتابة الجينية، قطع قطعة من أذن الماوس في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية تدفق laminar للحفاظ على العقم واستخراج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الجينومي.
    2. تضخيم الحمض النووي الجينومي المستخرج من قطعة الأذن في خليط رد فعل 20 ميكرولتر إلى الشاشة لانتقال HSV-TK تحت سيطرة المروج الزلال البشري عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من التمهيدي إلى الأمام 5'-CCATGCACGTTTATTTTGG-3 '، 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي 5'-TAAGTTGCAGCGCGCGTC-3'، 0.5 ميكرولتر من FAM التحقيق 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 '، و 10 ميكرولتر من مزيج رئيسي على تفاعل البوليميراز سلسلة في الوقت الحقيقي (PCR) أداة22.
    3. تعيين إعدادات PCR في الوقت الحقيقي على النحو التالي: 60 درجة مئوية لمدة 30 ق (مرحلة القراءة المسبقة)، 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (مرحلة الانتظار)، 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ق و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (مرحلة PCR)، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ق (مرحلة ما بعد القراءة).
      ملاحظة: وتعتبر دورة العتبة (Ct) أقل من 22 إيجابية بالنسبة للترانسجين HSV-TK.
  4. العلاج باستخدام غانسيكلوفير وتروسولفان
    1. باستخدام إبرة 27 G، حقن الفئران TK-NOG مع حقن GCV داخل الصفاق (6 ملغ / كغ) 2X يوميا في اليوم 7 وفي اليوم 5 في 100 ميكرولتر من المالحة قبل الجراحة لاستنفاد الخلايا النضوية المعدلة وراثيا الفئران (كما هو مبين في الاستراتيجية التجريبية في الشكل 2)23 .
    2. في الأيام 3 و2 و1 قبل الجراحة، الفئران المسبقة مع جرعات داخل الصفاق nonmyeloablative من treosulfan (1.5 غرام / كغ / يوم) في 100 ميكرولتر من المالحة، وذلك باستخدام إبرة 27 G.
    3. قبل يوم واحد من الجراحة، رسم اثنين إلى ثلاث قطرات (~ 100 درجة مئوية) من الدم من الوريد تحت الفك السفلي عن طريق وخز مع 5 ملم لانسيت، وعزل المصل عن طريق الطرد المركزي (1500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية) لألانين أمينوترانسفيراز (ALT) اختبار لتقييم degr هه من تلف الكبد.
  5. التحضير للجراحة
    1. استخدم كليبرز لثقب فرو الماوس المحيط بموقع الشق (على يسار الجدار العضد) قبل الجراحة.
    2. ضبط تدفق الأكسجين إلى 1 لتر / دقيقة وتدفق isoflurane إلى 3٪ - 5٪ في غرفة التعريفي باستخدام آلة تخدير الماوس. ضع فأرة واحدة في كل مرة في غرفة الحث للتخدير.
    3. إرفاق أحد طرفي أنبوب تمديد معقمة (مع قدرة عقد 550 درجة مئوية من التعليق؛ انظر جدول المواد للمواصفات) إلى إبرة 30 G والطرف الآخر إلى حقنة 1 مل.
    4. ملء الحقنة مع تعليق (80 درجة مئوية / الماوس) من HEPs المجمعة وHSPCs (انظر القسم 2)، تناسب الحقنة في درجة من ماصة الاستغناء المتكررة، وضبط موزع لتوزيع 10 ميكرولتر في كل الصحافة.
    5. مرة واحدة يتم التخدير الفئران (عادة بعد 3 - 4 دقيقة)، والتبديل تدفق isoflurane إلى مخروط الأنف والحد من معدل تدفق isoflurane إلى 2٪ - 3٪.
  6. زرع الصفيحات من HSPCs البشرية وخلايا الكبد في الفئران
    1. تنفيذ جميع خطوات الجراحة في مجلس الوزراء تدفق اللامينار في ظل ظروف معقمة.
    2. وضع الستائر المعقمة نظيفة على سطح العمل وفرك الجانب الأيسر من الجسم من كل فأر مع 10٪ بوفيدون اليود تليها 70٪ كحول isopropyl، قبل إجراء شق.
    3. إجراء شق صغير (~ 1 - 1.5 سم في الطول و 5 ملم عميق) في الجلد والعضلات والسوريوم على يسار الجدار العضد مع مقص نوع فانا لدخول تجويف العضد حوالي 5 ملم تحت الحافة السفلى من القفص الصدري.
    4. حدد موقع الطحال، وسحبه قليلا مع ملقط إلى منطقة العمليات لسهولة الوصول إليها، وإدراج إبرة 30 G في القطب السفلي من الطحال.
    5. فتح الغطاس من ماصة الاستغناء والاستغناء 10 ميكرولتر من حجم في وقت واحد، مع حد 60 - 80 درجة مئوية لكل الطحال. سحب الإبرة ببطء ومقطع الطحال مع مقاطع الربط باستخدام قضيب الربط.
    6. دفع الطحال مرة أخرى إلى تجويف الجسم مع تطبيق القطن يميل مبللة مع PBS معقمة.
    7. أغلق طبقة العضلات من جدار البطن باستخدام خياطة قابلة للامتصاص توقف نمط خياطة (وليس المستمر). إنجاز إغلاق الجلد مع نمط خياطة توقف باستخدام الغرز غير قابلة للامتصاص.
    8. استخدام منصات المياه الدافئة تعميم لحماية الفئران من انخفاض حرارة الجسم بعد الجراحة.
    9. إزالة الغرز غير القابلة للامتصاص 10-14 يوما بعد الجراحة.
  7. الرعاية بعد العملية الجراحية
    1. عندما يوقظ الحيوان المزروع، حقن البوبرينورفين مسكن (0.1 ملغ / كغ) داخل اقبول، 2X في اليوم لمدة 3 أيام متتالية.
    2. مراقبة الحيوانات على الأقل 1X في اليوم حتى يعودوا إلى الظروف البدنية العادية.
      ملاحظة: تحقق من وزن جسم كل الحيوان، لأن بعض الفئران قد تفقد الوزن بعد الجراحة. عادة ما تستعيد الفئران وزنها الأصلي في 1 إلى 2 أسابيع.

4. التحقق من صحة الطعوم من الكبد البشري من قبل ELISA والجهاز المناعي البشري عن طريق قياس التدفق

ملاحظة: تقييم إعادة تشكيل الكبد البشري والجهاز المناعي شهريا، بدءا من 1 شهر ما بعد الزرع عن طريق فحص المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) وقياس التدفق الخلوي، على التوالي.

  1. جمع عينات الدم من الوريد تحت الفك السفلي باستخدام الرمح في أنابيب EDTA، والطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. عزل المصل للتحقق من مستويات الزلال البشري لتقييم كفاءة تطعيم كبد الفأر لخلايا الكبد البشرية المزروعة، وذلك باستخدام مجموعة الكم ELISA الزلال البشري (انظر جدول المواد)باتباع الشركة المصنعة تعليمات.
    ملاحظة: لا تتخلى عن بيليه واستخدام الخلايا الكريات لتحليل قياس التدفق للخلايا لتقييم إعادة تشكيل الجهاز المناعي البشري.
  2. إعادة تعليق بيليه الخلية بدون مصل في 35 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (PBS + 2٪ FBS) وملطخة بـ 5 ميكرولتر من CD45 الخاص بالماوس (تركيز 0.5 ملغم/مل)، 5 ميكرولتر لكل من الأجسام المضادة الخاصة بالإنسان CD45 (0.1 ملغ/مل)، CD3 (0.2 مغ/مل)، CD8 (0.1 مغ/مل)، وCD19 (0.5 ملغ/مل) ، و20 ميكرولتر من CD4 (0.25 ملغم/مل) وCD14 (0.25 ملغم/مل) لكل منهما لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، للتحقق من تطور نظام مناعي وظيفي من CD34+ HSPCs.
    ملاحظة: النظر في إضافة أنبوب إضافي واحد من الخلايا غير الملطخة لتحديد gating من الخلايا الملونة.
  3. بعد الحضانة، نقل تعليق الملون (~ 100 درجة مئوية) في أنبوب قياس السيتومترية تدفق جولة القاع البوليسترين واستخدام 2 مل من 1X lysis العازلة (انظر جدول المواد)عن طريق تخفيف 1 جزء من 10X lysis العازلة مع 9 أجزاء من الماء المقطر وحضانة 10 - 15 دقيقة لخلايا الدم الحمراء.
    ملاحظة: مراقبة العكر لتقييم الانليس من خلايا الدم الحمراء. بمجرد أن تصبح العينة واضحة، يتم اكتمال اللليس.
  4. بعد lysis، إضافة 3 مل من المخزن المؤقت FACS في الأنبوب والطرد المركزي في 300 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه. كرر الغسيل عن طريق إضافة 3 مل من المخزن المؤقت FACS إلى بيليه والطرد المركزي في 300 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. إصلاح الخلايا في طازجة أدلى 1٪ بارافورمالدهايد (PFA) والحصول على الخلايا الملونة على مقياس التدفق، وتحليلها مع برنامج التدفق.
  6. للتحليل، حدد الخلايا الليمفاوية gating على مؤامرة FSC / SSC، تليها خلية واحدة gating على FSC-منطقة / FSC-الارتفاع.
  7. وعلاوة على ذلك، فإن بوابة CD45 الخاصة بالإنسان (hCD45) على السكان من خلية واحدة وتشمل CD45 خاصة بالماوس (mCD45) لاستبعاد الخلايا من أصل المورين. وضع استراتيجية gating من السكان الملونين على أساس gating من الخلايا غير الملطخة.
  8. بوابة hCD45+ خلايا لتحديد تواتر خلايا CD3+ T وCD19+ B الخلايا. خلايا البوابة T لتحديد مجموعات فرعية CD4 و CD8. لتقييم الخلايا الأحادية، بوابة على hCD45 لتحديد CD14+ الخلايا الأحادية.

5. عدوى فيروس نقص المناعة البشرية من الفئران TK-NOG وتأثيرها على الكبد البشري والجهاز المناعي

  1. التعامل مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 وجميع الفئران المصابة في منشأة معينة للسلامة البيولوجية من المستوى 2.
    تحذير: الأوتوكلاف والتخلص من جميع النفايات المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في أكياس الخطر البيولوجي المزدوج. لأسباب تتعلق بالسلامة، ارتداء قفازات مقاومة للقطع أثناء تسليم الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.
  2. ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE)، بما في ذلك ثوب الغطاء المتاح، ويغطي الأحذية، وقناع الوجه، والقفازات المزدوجة في جميع الأوقات أثناء العمل مع الفيروس.
  3. حدد الفئران مع إعادة تشكيل أكثر من 15٪ من CD45 الإنسان+ الخلايا (اختبارها في الخطوة 4.7) ومع وجود الزلال البشري في المصل للعدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 (اختبارها في الخطوة 4.1).
  4. حقن الفئران مع 1 × 103 إلى 1 × 104 الأنسجة زراعة الجرعات المعدية 50 (TCID50) HIV-1ADA في حجم 100 - 200 درجة مئوية لكل فأرة، داخل اقابي.
  5. قتل الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 5 أسابيع بعد العدوى باستخدام isoflurane (مع تركيز بخار الإيسوفلوران من >5٪).
  6. بعد قتل الفئران، وجمع الدم في أنابيب EDTA عن طريق ثقب القلب لعزل المصل، لمعرفة تأثير فيروس نقص المناعة البشرية-1 على الكبد عن طريق تقييم مستويات الزلال ينسّف هُنا من قبل ELISA (انظر الخطوة 4.1) وخلايا الدم للتحقق من وجود تغييرات في المناعة البشرية الخلايا التي تستخدم قياس التدفق (راجع الخطوات 4.2 -4.8).
    ملاحظة: تقييم الحمل الفيروسي المحيطي 5 أسابيع بعد العدوى على محلل حيوي للتأكد مما إذا كانت الفئران مصابة.
  7. بعد سحب الدم، استئصال الكبد من الفئران القتل الرحيم.
  8. لاستئصال الكبد ، كشف تجويف البطن عن طريق إجراء شق من 1.5 - 2 سم طويلة و 0.5 سم عميقة في الجلد والعضلات والخطاط ، من xyphoid. جعل قطع عمودي على العمود الفقري بين الكبد والحجاب الحاجز. رفع الكبد ولقطع أي أغشية تعلق على المعدة والأمعاء.
  9. جمع وإصلاح الكبد في 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها واتبع بروتوكول المناعية الكيميائية القياسية لتقييم تأثير فيروس نقص المناعة البشرية على CK18+ خلايا الكبد باستخدام الإنسان محددة CK18 الأجسام المضادة8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

إنشاء نموذج الماوس المزدوج أنسنة مع الكبد البشري والخلايا المناعية يمكن رصدها بسهولة في كل خطوة مع ELISA بسيطة جدا والتدفق قياس الخلايا، على التوالي. يتم إجراء قياس التدفق المنتظم لتقييم تطور جهاز المناعة الوظيفي ورؤية تأثير العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية على الخلايا المناعية. في الفئران ذات الأنسنة المزدوجة، يمكن أن تتراوح تطوير الخلايا المناعية الوظيفية من 15٪ إلى 90٪ من بوابة الخلايا الليمفاوية. وتظهر المجموعات الفرعية التمثيلية للخلايا المناعية في قطع النقاط(الشكل 3). لتقييم تطعيم خلايا الكبد البشرية ، يتم إجراء ELISA لمستويات الزلال الخاصة بالإنسان شهريا على مصل الماوس. تظهر الفئران المطعومة بمركبات HSPCs وHEPs مستويات الزلال الخاصة بالإنسان التي تتراوح بين حوالي 7 ميكروغرام/مل إلى 377 ميكروغرام/مل في شهر واحد، وتستمر في النمو على مدى وقت المراقبة (6 أشهر)(الشكل 4). يتم رصد تأثير العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية على الخلايا المناعية البشرية في دم الفئران ذات الأنسنة المزدوجة عن طريق قياس التدفق وعلى HEPs في الكبد من قبل الزلال ينوب عن الإنسان ELISA. بحلول 5 أسابيع، فيروس نقص المناعة البشرية-1 يسبب انخفاضا في مستويات الزلال البشري في المصل، كما تقيمها ELISA، وهناك استنفاد CK18 الإنسان+ خلايا الكبد في أقسام الكبد من الفئران ذات الأنسنة المزدوجة، كما يقيمها الكيمياء المناعية (الشكل 5). ويلاحظ عادة نسبة أقل من CD4:CD8، عن طريق قياس التدفق، في الدم والكبد من الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، مقارنة مع المستويات التي لوحظت في نفس الماوس قبل العدوى(الشكل 6). تتم مناقشة جميع الكواشف والمواد الهامة للبروتوكول في جدول المواد.

Figure 1
الشكل 1 مخطط لإثراء CD34+ خلايا من دم الحبل السري. (أ)دم الحبل السري هو الطبقات على الخلايا الليمفاوية فصل المتوسطة (LSM) والطرد المركزي لعزل معطف برتقالي. (B)يتم وضع أعمدة LS على حامل مغناطيسي وشطفها مع المخزن المؤقت BSA، تليها إضافة معطف برتقالي. الخلايا الإيجابية لCD34 محاصرون في الأعمدة، وCD34- يتم تُعنى الخلايا في أنابيب منفصلة. يتم غرق CD34+ الخلايا المحاصرين في راتنجات العمود مع الغطاس، ويتم جمع الخلايا في أنبوب جديد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 منظر تخطيطي للتصميم التجريبي لإعادة تشكيل الكبد وفئران الجهاز المناعي ذات الطابع الإنساني، تليها عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1. يتم حقن الفئران TK-NOG مع ganciclovir (GCV) بجرعة من 6 ملغ / كغ، 2X في اليوم، في اليوم -7 واليوم -5، تليها حقن treosulfan في الأيام -3، -2 و -1. لفحص الفئران للزرع (Tx)، يتم إجراء فحص أمينوترانسفيراز ألانين (ALT) قبل يوم واحد من الجراحة، ويتم اختيار الفئران مع مستويات ALT من > 200 و <600 U/L. بعد الزرع، يتم فحص الفئران لإعادة تشكيل الجهاز المناعي البشري عن طريق قياس التدفق (FACS) وإعادة تشكيل الكبد من خلال تقييم مستوى الزلال باستخدام ELISA. الفئران مصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 5 أسابيع قبل أن يتم التضحية بها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 : تدفق قياس الخلايا تحليل استراتيجية gating لتوزيع الخلايا البشرية من الدم. (أ)أولاً، يتم بوابات الخلايا الليمفاوية على الدم كله على أساس FSC-A و SSC-A. (ب)يتم بوابات الخلايا المفردة على الخلايا الليمفاوية. (C)CD45 الإنسان+ الكريات البيض هي بوابة على خلايا واحدة باستخدام الماوس CD45 وCD45 الإنسان. (D)يتم تحديد CD3+ خلايا T وخلايا CD19+ B على CD45 المسور+ الكريات البيض البشرية. (E)CD4+ T يتم تعريف الخلايا المساعدة وCD8+ الخلايا T السامة للخلايا في خلايا CD3+ T المسورة. (F)CD14+ يتم بوابات الخلايا الأحادية من CD45 الإنسان+ الكريات البيض. والنتائج الواردة هنا هي من فأر واحد مزروع بخلايا كبدية بشرية مزدوجة وأجهزة منع الكل منها. 

Figure 4
الشكل 4 يتم قياس تركيز الزلال بواسطة ELISA في مصل الفئران ذات الأنسنة المزدوجة. يتم زرع الفئران مع كل من خلايا الكبد البشرية (HEPs) وCD34+ الخلايا الجذعية/السلف المكونة للدم (HSPCs) = 11). يتم جمع المصل في أوقات مختلفة في 1، 4، و 6 أشهر بعد الزرع، ويتم تخفيف لضبط تركيزات عينة غير معروفة في مجموعة من المعايير. يمثل كل رمز قيمة ماوس فردية. تمثل النتائج الوسيط، بالإضافة إلى القيم الفردية. * P < 0.05, by ANOVA في اتجاه واحد. وقد عُدل هذا الرقم من Dagur et al.8. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 تأثير على فيروس نقص المناعة البشرية-1 على مستويات الزلال في المصل واستنفاد CK18+ خلايا الكبد البشرية في الكبد من الفئران المزدوجة أنسنة. (أ)يتم رصد تركيزات الزلال في الفئران غير المصابة = 9) المزروعة مع كل من HEPs الإنسان وHSPCs في 1 و 4 أشهر. يتم إصابة الفئران = 10) مع فيروس نقص المناعة البشرية في 4-5 أشهر بعد زرع والتضحية 5 أسابيع بعد العدوى. يمثل كل رمز قيمة ماوس فردية. تمثل النتائج الوسيط، بالإضافة إلى القيم الفردية. * P < 0.05, by ANOVA في اتجاه واحد. تم تعديل هذا الرقم من داغور وآخرون. 8.(ب)يتم إصلاح خمسة ميكرون أقسام الكبد من غير المصابين (HEPs + HSPCs، اللوحة اليسرى) والفئران TK-NOG المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (HEPs + HSPCs + فيروس نقص المناعة البشرية، لوحة الحق) ، جزءا لا يتجزأ من البارافين ، وملطخة للأجسام المضادة للسيتوكيراتين-18 (CK18). فيروس نقص المناعة البشرية-1 مما تسبب في استنفاد CK18+ خلايا الكبد ويتضح من منطقة أقل احتلالا من قبل CK18+ الخلايا البشرية. والنتائج الواردة هنا هي من فأر واحد غير مصاب وفأر مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية زرع بخلايا كبدية بشرية مزدوجة وخلايا مزدوجة في الكبد.

Figure 6
الشكل 6 نسبة CD4+ الخلايا إلى CD8+ T الخلايا في الدم المحيطي وفي الكبد من الفئران المزدوجة المعاد تشكيلها غير المصابة وفيروس نقص المناعة البشرية-1 المصابة. للفئران المزدوجة المعاد تشكيلها غير المصابة: دائرة مغلقة؛ (أ) برامج العمل المحلية + مركبات الـ HSPCs؛ الدم ن = 7; ن الكبد = 6. بالنسبة للفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1: الدوائر المفتوحة؛ الـ HEPs + HSPCs + فيروس نقص المناعة البشرية؛ الدم ن = 10; n الكبد = 11. تمثل النتائج الوسيط، بالإضافة إلى القيم الفردية. * P < 0.05, عن طريق اختبار ANOVA في اتجاه واحد بين الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وغير المصابة. وقد عُدل هذا الرقم من Dagur et al.8. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الكبد يتعرض للخطر وتلف في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية24. النماذج الحيوانية الصغيرة التجريبية لدراسة أمراض الكبد البشري في وجود فيروس نقص المناعة البشرية-1 محدودة للغاية، على الرغم من توافر عدد قليل من النماذج الحيوانية المزروعة بصورة مشتركة مع CD34+ HSPCs وخلايا الكبد7،12، 25. في التجارب المختبرية، وتظهر خلايا الكبد أن يكون منخفض المستوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 العدوى26. الفئران أنسنة التي تحمل كلا النوعين من الخلايا البشرية هي نموذج مرغوب فيه. وقد تبين أن كبد الفئران المعاد تشكيلها مع الجهاز المناعي البشري فقط أن تتأثر بعدوى فيروس نقص المناعة البشرية في ظل استنفاد تجريبي للخلايا T التنظيمية البشرية20،27. ومع ذلك، فإن الفرق في الخصائص المناعية والوظيفية للماوس وخلايا الكبد البشرية قد يؤكد الاختلافات في استجاباتها لفيروس نقص المناعة البشرية-1 والخلايا المناعية. في هذا الاستعراض، يتم وصف بروتوكول لإعادة تشكيل كل من الجهاز المناعي البشري والكبد ومعالجة الأمراض المناعية الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية-1، كما لوحظ في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1. تم اختيار الفئران الذكور TK-NOG بسبب تعبيرهم فيروس MRNA عالية انتقائية الكبد من ترانسجين HSV-TK وحساسية سمية GCV للكبد المعدل وراثيا الماوس21. وعلاوة على ذلك، يمكن الحفاظ عليها لفترات طويلة بعد زرع دون استخدام الأدوية الخارجية ولا تتطور الأمراض الجهازية العفوية28. لإنشاء جهاز المناعة البشرية وإعادة تشكيل الكبد، استئصال الجهاز المناعي للماوس والأضرار التي لحقت خلايا الكبد الخاصة بالماوس مطلوبة وتتحقق باستخدام جرعات nonmyeloablative من treosulfan وGCV، كما هو مبين سابقا في TK-NOG الفئران الذكور13 ،23. يتم حقن الفئران مع GCV وtreosulfan في سن 6-8 أسابيع، كما التعبير عن الترانسجين والإصابة الكبدية الناجمة عن GCV كما تقيمها مستويات ALT الأمثل، ثم، لتوفير الخلايا البشرية المتخصصة لزرع21. يتم عادة اختيار الفئران التي تظهر مستويات ALT من > 200 U/L، ولكن <600 U/L، لزرعها. الفئران التي تظهر مستويات ALT من > 600 U / L هي في خطر أكبر من الموت كما خلايا الكبد البشرية ليست قادرة على إنقاذ وظيفة الكبد الماوس التالفة.

وفي الوقت الراهن، يتجلى إضفاء الطابع الإنساني المزدوج عن طريق زرع CD34 الإنسان+ مركبات ثنائية السنوات وخلايا الكبد الجنينية؛ ومع ذلك، فإن التلاعب بالحيوانات حديثي الولادة يخلق مشاكل تقنية13،14. يمكن اشتقاق HSPCs أو عزلها من مصادر متعددة، مثل خلايا الكبد الجنينية (FLCs) والخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) وCB. ومع ذلك، فإن القضايا الأخلاقية تقيد استخدام الـ ESCs وFLCs. ولا يوجد لدى CB مثل هذا التقييد وهو البديل الأكثر فائدة للحصول على هذه الـ HSPCs، فضلاً عن كونه مصدراً ثميناً للجذع اتّباهي ًا بدائيًا وخلايا ذرية يمكنها إعادة تشكيل المناعة الوظيفية نظام. لا ينبغي أن يكون دم الحبل السري أقدم من يوم واحد عند استخدامه لعزل HSPCs، حيث أن غلة HSPCs تتأثر بشدة بالعمر. يجب فحص نقاء الـ HSPCs المعزول قبل الحفاظ على الخلايا بالتبريد. يتم تجنب التلوث المتبادل لخلايا CD3+ T، كما أنه قد يؤدي إلى الكسب غير المشروع الماوس الجهازيةمقابل-المضيف المرض وallorejection الحاد من HEPs أثناء زرع مع خلايا غير متطابقة.

تم استخدام خلايا الكبد المتاحة تجاريا كمصدر لإعادة تشكيل الكبد8،13. ويفضل خلايا الكبد الكبار لإنشاء إعادة تشكيل الكبد بسبب زيادة كفاءتها في الطعوم والاستدامة لفترة طويلة من الزمن29.

وجود الجهاز المناعي البشري في نموذج الماوس زيادة مستويات ALB، كما هو مبين سابقا30،31. ومع ذلك، قد تختلف كفاءة خلايا الكبد وإعادة تشكيل الجهاز المناعي باختلاف مصادر الخلايا المانحة وتعتمد على الماوس المتلقي. لذلك، كل فأر يحتاج إلى تقييم للتطعيم، والجزء الأكثر أهمية هو استخدام الأجسام المضادة أو الكاشف التي هي خاصة بالإنسان ولا تتفاعل مع خلايا الماوس. الكواشف الخاصة بالإنسان والأجسام المضادة المستخدمة في الدراسة المعروضة هنا مفصلة في جدول المواد. إذا تم استخدام الأجسام المضادة غير المنصوص عليها في جدول المواد للدراسة، تأكد من التحقق من خصوصية الإنسان.

والشرط الأمثل هو زرع الخلايا السينجينية. ومع ذلك، من الصعب من الناحية التقنية تحقيق ذلك. وحيثما أمكن، ينبغي تجميع الـ HSPCs وخلايا الكبد من الجهات المانحة التي تُضاهى جزئياً مستضدات من الفئة 1 من الكريات البيض البشرية (مثل HLA-A2).

لفحص الفئران لدراسات فيروس نقص المناعة البشرية, يتم سحب الدم في نقاط زمنية متعددة لتحديد إعادة تشكيل المناعة والكبد الأمثل; يفضل تدفق قياس السيتومترية وELISA لأنها يمكن أن تؤدي مع كمية صغيرة فقط من الدم. ويمكن استخدام خلايا الدم والمصل من نفس العينة لتدفق قياس الخلايا وELISA، على التوالي. ومن المهم جعل التخفيفات المناسبة من المصل في كل نقطة زمنية (1,000 - 40,000 نطاق) لتقييم مستويات ALB بحيث يمكن جلب التركيزات غير المعروفة ضمن نطاق التركيزات القياسية (مجموعة: 6.25 - 400 نانوغرام/مل).

السيتوكينات الالتهابية في الاستجابة للعدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 في وجود الجهاز المناعي البشري يمكن أيضا أن تكون مفيدة في معالجة التفاعل بين خلايا الكبد والخلايا المناعية. النموذج مفيد لإظهار مسببات الأمراض المناعية من مرض الكبد الناجم عن فيروس نقص المناعة البشرية-1، نظراً لأنه يلخص تلف الكبد بنفس الطريقة كما هو الحال في البشر، ويتضح ذلك من انخفاض نسبة CD4:CD8، وانخفاض في مستويات ALB، وموت خلايا الكبد البشرية، والمناعة الكبد التنشيط. النموذج لديه أيضا بعض القيود, مثل انخفاض مستوى نشاط الخلايا T السامة للخلايا وضعف التحول فئة الغلوبولين المناعي. بسبب وجود كل من الجهاز المناعي البشري والكبد، والنموذج المعروض هنا واعدة للعدوى المشتركة studi من فيروس نقص المناعة البشرية-1 وفيروسات التهاب الكبد، عدوى التهاب الكبد المزمن (لتوضيح آليات الاستجابة المناعية المضادة لالتهاب الكبد)، وكتليف الكبد نموذج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل منحة المعهد الوطني للصحة R24OD018546 (إلى L.Y.P. وS.G.). يود المؤلفون أن يشكروا ويزي لي، دكتوراه، للمساعدة في الإجراءات الجراحية، أماندا برانش وودز، بي.س.، يان تشنغ لعلم المناعة، أعضاء مرفق أبحاث قياس الخلايا التابع للأمم المتحدة المدير فيليب هليسلي، دكتوراه، فيكتوريا ب. سميث، ب. س. وسامانثا وول، ب. س. ، أعضاء مرفق الفحص المجهري المتقدم جانيس أ. تايلور، ب. س. وجيمس ر. تالاسكا، B.S.، للحصول على الدعم التقني. ويقر المؤلفان بالدكتورمامورو يتو وهيروشي سوميزو من وكالة الأحوال الجوية الدولية لتوفيرالفئران TK-NOG والدكتور يواكيم بومغارت لتوفير هالة التريوسولفان. ويشكر المؤلفون الدكتور أدريان كوسترز، من اللجنة، على مساهمتها التحريرية في المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
27 G1/2" needles BD biosciences 305109
30 G1/2" needles BD biosciences 305106
5 mL polystyrene  round-bottom tube 12 mm x 75 mm style Corning 352054
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle BD biosciences 309659
BD FACS array bioanalyzer  BD Biosciences For purity check of eluted CD34+ cells 
BD FACS array software BD Biosciences Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array
BD FACS lysing solution BD Biosciences 349202 To lyse red blood cells
BD LSR II BD Biosciences Instrument for acquisiton of flow cytometry samples
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube BD biosciences BD 367874 To collect Cord blood
Bovine Serum Albumin  Sigma-aldrich A9576
Buprenorphine Controlled substance and pain-killer
CD14-PE BD Biosciences 555398 Specific to human
CD19-BV605 BD Biosciences 562653 Specific to human
CD34 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-046-702 For isoation of   CD34+ HSPC
CD34-PE, human Miltenyi Biotec 130-081-002 Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells 
CD3-AF700 BD Biosciences 557943 Specific to human
CD45-PerCPCy5.5 BD Biosciences 564105 Specific to human
CD4-APC BD Biosciences 555349 Specific to human
CD8-BV421 BD Biosciences 562428 Specific to human
Cell counting slides Bio-rad 1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit Thermofisher scientific CS11204 for extraction of genomic DNA from ear piece
Cobas Amplicor system v1.5  Roche Molecular Diagnostics bioanalyzer to measure viral load
Cotton-tipped applicators   McKesson 24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18) DAKO M7010 Specific to human
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-aldrich D2650-5X5ML
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile BD biosciences 30914 Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion
FACS Diva version 6 BD Biosciences flow cytometer software required for  acqusition of sample
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10438026
FLOWJO analysis software
v10.2
FLOWJO, LLC flow cytometry analysis software
Ganciclovir APP Pharmaceuticals, Inc. 315110 Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA Tubes Greiner bio-one 450475
Hepatocytes thawing medium  Triangle Research Labs  MCHT50
Horizon Open Ligating Clip Appliers Teleflex 537061 To hold the ligating clips
Hospira Sterile Water for Injection ACE surgical supply co. Inc. 001-1187 For dilution of Buprenorphine (pain-killer)
Human Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl laboratories E80-129 For assesing human albumin levels in mouse serum
Human hepatocyte Triangle Research Labs  HUCP1  Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified 
Iris Scissors, Straight Ted Pella, Inc. 13295
Lancet MEDIpoint Goldenrod 5 mm
LS columns  Miltenyi Biotec 130-042-401 Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)
Lymphocyte Separation Medium (LSM) MP Biomedicals 50494 For isoation of   lymphocytes from peripheral blood
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 holds Qudro MACS seperator and LS columns
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument Co. RS-5605 Used to make an incision on skin to expose spleen
Micro Dissecting Forceps Roboz Surgical Instrument Co. RS-5157  to hold and pull out spleen from peritoneal cavity
mouse CD45-FITC BD Biosciences 553080 mouse-specific
PBS (Phosphate Buffered Saline) Hyclone SH30256.02
Qudro MACS separator  Miltenyi Biotec 130-090-976 holds four LS columns
RPMI 1640 medium Gibco 11875093
StepOne Plus Real Time PCR  Applied Biosystems Instrument used  to  genotype
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml DYMAX CORP T15469 Used to  dispense  HSPC and HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA synthetic absorbale suture Henry Schein Animal Health 41178 Suturing of skin and peritoneum
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermofisher scientific 4369016
TC20 automated cell counter Bio-rad 1450102
TK-NOG mice  Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)
Treosulfan Medac GmbH Provided by  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan Blue Bio-rad 1450022
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L Ted Pella, Inc. 1346 Used to make an incision on skin to expose spleen
Weck hemoclip traditional titanium ligating clips Esutures 523700 To ligate the spleen post-injection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24, (10), 1537-1548 (2010).
  2. Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24, (3), 211-217 (2000).
  3. Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95, (5), 1316-1322 (2000).
  4. Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117, (10), 837-838 (1992).
  5. Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
  6. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25, (4), 428-435 (2013).
  7. Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65, (2), 334-343 (2016).
  8. Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7, (2), (2018).
  9. Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
  10. Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35, (3), 197-208 (2012).
  11. Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352, (2), 274-280 (2015).
  12. Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140, (4), 1334-1344 (2011).
  13. Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184, (1), 101-109 (2014).
  14. Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10, (3), 0119820 (2015).
  15. Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65, (10), 1744-1753 (2016).
  16. Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
  17. Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
  18. Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
  19. Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9, (3), 237-244 (2012).
  20. Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209, (7), 1039-1044 (2014).
  21. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405, (3), 405-410 (2011).
  22. Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44, (2), 146-153 (2014).
  23. Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441, (1), 230-235 (2013).
  24. Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4, (3), 91-98 (2012).
  25. Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
  26. Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
  27. Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26, (17), 2135-2144 (2012).
  28. Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
  29. Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, (2), 198-213 (2011).
  30. Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104, (8), 2582-2590 (2004).
  31. Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47, (2), 706-718 (2008).
إنشاء نموذج الماوس ثنائي الأنسنة TK-NOG لمسببات أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dagur, R. S., Wang, W., Makarov, E., Sun, Y., Poluektova, L. Y. Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis. J. Vis. Exp. (151), e58645, doi:10.3791/58645 (2019).More

Dagur, R. S., Wang, W., Makarov, E., Sun, Y., Poluektova, L. Y. Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis. J. Vis. Exp. (151), e58645, doi:10.3791/58645 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter