Summary
Этот протокол обеспечивает надежный метод для создания гуманизированных мышей с иммунной системой человека и клетками печени. Двойной восстановленный иммунодефицитных мышей, достигнутых с помощью интраспелинической инъекции человеческих гепатоцитов и CD34 гематопоиетических стволовых клеток восприимчивы к вирусу иммунодефицита человека-1 инфекции и повторение повреждения печени, как наблюдается в ВИЧ-инфицированных пациентов.
Abstract
Несмотря на увеличение продолжительности жизни пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), заболевание печени стало распространенной причиной их заболеваемости. Иммунопатология печени, вызванная ВИЧ-1, остается неуловимой. Малые модели животных ксенотрансплантата с гепатоцитами человека и иммунной системой человека могут резюмировать биологию человека патогенеза болезни. При этом описывается протокол для создания двойной гуманизированной модели мыши с помощью человеческих гепатоцитов и CD34 гематопоиетических стволовых /клеток-прародителей (HSPCs) трансплантации, для изучения иммунопатологии печени, как наблюдается у ВИЧ-инфицированных пациентов. Для достижения двойной реконституции, мужчины ТЗ-НОГ (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK)7-2/ShiJic) мышей интраперитоно вводят с ганциклозир (GCV) дозы для устранения мыши трансгенных клеток печени, и с treosulfan для немиелоаблятивного кондиционирования, оба из которых из которых оба из которых облегчить гепатоциты человека (HEP) прививок и иммунной системы человека (HIS) развития. Уровень альбумина человека (ALB) оценивается для прививок печени, а наличие иммунных клеток человека в крови, обнаруженных цитометрией потока, подтверждает установление иммунной системы человека. Модель, разработанная с использованием описанного здесь протокола, напоминает несколько компонентов повреждения печени от ВИЧ-1. Его создание может оказаться необходимым для исследований совместной инфекции вируса гепатита и для оценки противовирусных и антиретровирусных препаратов.
Introduction
С момента появления антиретровирусной терапии произошло значительное снижение смертности от моноинфекции ВИЧ-1. Тем не менее, заболевания печени стала распространенной причиной заболеваемости у ВИЧ-инфицированных пациентов1,2. Инфекции вирусов гепатита с ВИЧ-1 встречаются чаще, на долю 10% - 30% ВИЧ-инфицированных в США3,4,5.
Специфика вирусов ВИЧ-1 и гепатита ограничивает полезность малых моделей животных для изучения специфических инфекционных заболеваний человека или для изучения многочисленных аспектов патогенеза печени, связанного с ВИЧ-1. Иммунодефицитные мыши, которые позволяют прививать человеческие клетки и / или ткани (так называют гуманизированных моделей мыши) являются приемлемыми животными модели для доклинических исследований6,7,8. С момента появления гуманизированных мышей в начале 2000-х годов, многочисленные доклинические исследования токсичности холестатической печени человека, специфических для человека патогенов, включая ВИЧ-1 и ВИЧ-ассоциированные нейрокогнитивные расстройства, вирус Эпштейна Барра, гепатит и другие инфекционных заболеваний, были исследованы в этих мышей6,9,10,11. Несколько моделей мыши для CD34и HSPCs и / или трансплантации гепатоцитов человека уже давно разработаны и улучшились с течением времени для изучения болезни патогенеза вируса гепатита В (HBV)-связанных заболеваний печени12, 13 Год , 14. Несколько моделей для трансплантации гепатоцитов и человека (HEP) основаны на штаммах, известных как NOG (NOD). CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- кк-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, и fah-/- NOD rag1-/- il2r null мышь16. Однако каждая модель имеет свои преимущества и ограничения; например, AFC8 двойных гуманизированных мышей для HEPs и стволовых клеток человека (HSCs) на Balb/C-Rag2-/- Кк-/- фон позволяет успешно привить иммунных клеток и HSCs, но есть отсутствие антигена конкретных Т- и В-клеток ответ в этой модели12. Основные проблемы в восстановлении двойной гуманизированных мышей включают субоптимальный прививок, отсутствие подходящих моделей для поддержки различных тканей, несовпадающие условия, иммунный отторженный, или трансплантат -по сравнениюс -хост болезни (GVHD), и технические трудности, такие как рискованные манипуляции с новорожденными и высокие показатели смертности из-за метаболических нарушений13.
Хотя гуманизированные мыши были использованы для исследования ВИЧ в течение многих лет17,18,19, использование гуманизированных мышей для изучения повреждения печени, вызванные ВИЧ-1 была ограничена20. Ранее мы сообщали о создании двойной гуманизированной модели мыши TK-NOG и ее применении при ВИЧ-ассоциированном заболевании печени8. Эта модель показывает надежное прививочение печени и иммунных клеток и резюмирует патогенез ВИЧ-инфекции. В ходе этой дискуссии представлен подробный протокол, включав в себя наиболее важные шаги в области трансплантации гепатоцитов человека. Представлено также описание HSPCs, необходимых для успешного прививки От hePs и создания функциональной иммунной системы у мышей ТК-NOG. Использование этих мышей для изучения ВИЧ-ассоциированного иммунопатогенеза печени подробно. TK-NOG мышей, перевозящих печени конкретных вирус простого герпеса типа 1 тимидин киназы (HSV-TK) трансгениспользуютиспользуются. Клетки печени мыши выражая этот transgene можно легко ablated после краткого подвержения к nontoxic дозе GCV. Пересаженные клетки печени человека устойчиво поддерживаются в печени мыши без экзогенных препаратов21. Мышей также предусловные с nonmyeloablative дозы треосульфана для создания ниши в костном мозге мыши для человеческих клеток8. Иммунодефицитные мыши ТК-НОГ интраспленически вводятся с помощью HePs и многопотентных HSPCs. Затем мышей регулярно контролируют на наличие в крови и печени восстановления с помощью иммунофенотипирования крови и измерений уровня сыворотки человека и альбумина, соответственно. Мыши с успешной реконституцией более 15% как для иммунных клеток человека, так и для HEPs интраперитоно вводят ВИЧ-1. Влияние ВИЧ на печень можно оценить уже через 4 - 5 недель после инфицирования. Важно отметить, что, поскольку ВИЧ-1 используется, все необходимые меры предосторожности должны быть приняты при обработке вируса и инъекционных его на мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) при Медицинском центре Университета штата Небраска.
ПРИМЕЧАНИЕ: Получить одобрение от местного IACUC перед проведением экспериментов на животных.
1. Обработка пуповинной крови и изоляция Человеческих ГСпК
- Выполните все этапы протокола в стерильных условиях в ламинарных шкафах потока.
- Возьмите пуповинной крови (CB), собранные в гепаринизализированных труб и сделать объем до 35 мл, добавив фосфат-буферный солен (PBS). Слой образца на верхней части лимфоцитов разделения среды (LSM), как показано на рисунке 1 и центрифуга LSM с слоистых CB на 400 х г в течение 35 минут при 4 КК без тормозов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавить кровь тщательно и осторожно, чтобы избежать смешивания на интерфейсе. - Удалите верхний слой LSM и плазмы тщательно и передать белый баффи пальто интерфейс в новую трубку с помощью передачи пипетки.
- Отрежь буйный слой в 30 - 40 мл ледяного буфера (PBS - 0,5% бытового сывороточных альбомов (BSA) 2 мМ этиленедиаминететацетическая кислота «ЭДТА»). Используя пипетку, объедините 20 злиц яточной подвески с 20 qL 0,4% трипан синий и пипетка 10 зл и 10 л смеси во внешнее отверстие любой из двух камер подсчета слайда и вставьте слайд в автоматизированный счетчик ячейки для подсчета клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ледяной буфер во всех шагах, так как он помогает сохранить жизнеспособные клетки. - Центрифуги клетки на 300 х г в течение 10 минут при 4 кв и аспирации супернатант тщательно. Затем добавьте 300 л ледяного буфера.
- Добавьте 100 зЛ рецепторов человека Fc, блокирующих реагент, и 100 л моноклональных мышей против человеческих антител-конъюгированных микробусов на сумму до 1 х 108 клеток (см. Таблицу Материалов). Инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия, добавить 10 мл ледяного буфера для мытья клеток и центрифугу при 300 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Масштабируйте это в соответствии с номером ячейки, если более 1 х 108 ячеек присутствуют. - Тщательно удалите супернатант, resuspend гранулы в 500 л буфера, и приступить к магнитному шагу разделения, чтобы обогатить HSPCs.
- Поместите положительный отбор LS колонки (см. Таблица материалов) в магнитно-активированной ячейки сортировки поле и передать его через с 3 мл буфера.
- Загрузите образец в колонку LS, которая может заманить микробусы, привязанные к человеческому CD34, в образцах и позволить ему течь под воздействием силы тяжести в трубку коллекции.
- Вымойте столбец 3x с буфером и соберите elute в той же трубке коллекции CD34- фракция клеток.
- Окунитесь в столбец с 5 мл буфера, чтобы удлинить клетки CD34в новую трубку сбора. Повторите процедуру, чтобы достичь чистоты в размере 90%.
- Подсчитайте eluted CD34- клетки, используя трипан синий краситель в гемоцитометре. После подсчета, центрифуга CD34и клетки на 300 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
- Приостанавливаете действие CD34- клеток в 25 Л PBS для инъекции, которая будет немедленно использована при трансплантации или криоконсервации клеток в концентрации 1-2 млн/мл в замораживании среды (Roswell Park Мемориальный институт среднего (RPMI 1640 средних) сыворотка крупного рогатого скота (FBS) - 10% диметилсульфодоксид (DMSO) для дальнейшего использования в трансплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда пересчитывайте жизнеспособные клетки перед их использованием при трансплантации. - Чтобы проверить чистоту CD34и элиты, возьмите 50 qL подвески и инкубировать его с 10 Зл PE-конъюгированных анти-человеческих антител CD34 в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия. После инкубации антител, мыть окрашенные клетки с PBS, resuspend их в 100 зл. Добавьте дополнительную трубку клеток без антител для проектирования ворот в цитометрпотока потока.
- После приобретения, анализировать данные, выбирая область интереса на переднем рассеянии (FSC) и боковой рассеяния (SSC) участок, а затем gating для одиночных ячеек на FSC-области и FSC-высота участков. Ворота CD34-положительные ячейки на одиночных ячейках в канале PE и участке SSC-области.
2. Подготовка гепатоцитов человека для трансплантации
- Удалить криоконсервированные гепатоциты из жидкого азота, быстро погрузить флакон в водяную баню и оттаивать примерно 90 - 120 с.
- Снимите крышку флакона и залейте оттаяваемые гепатоциты в коническую трубку 50 мл теплой оттаивательной среды.
- Приостановить клетки, качая 50 мл трубки вручную в течение нескольких секунд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихрь трубки. - Пеллет клетки при температуре 100 х г в течение 8 мин при комнатной температуре. Вымойте гранулированные клетки в PBS с 0,1% BSA и объединить их с свежими или оттаять HSPCs (коэффициент 10:1) в PBS в окончательном объеме 80 Л / мышь.
3. Обработка животных, скрининг, генотипирование и лечение hSPC человека и трансплантации гепатоцитов
- Обработка животных
- В результате тяжелого иммунодефицита, породы, дома, и обрабатывать TK-NOG мышей в асептических условиях.
- Всегда носите лабораторное пальто, перчатки, бахилы и маску для лица, чтобы предотвратить заражение потенциально патогенными микроорганизмами.
- Используйте стерильные перчатки и инструменты для хирургии и обрабатывать животных асептически на протяжении всей операции.
- Выбор мышей ТК-НОГ для эксперимента
- Поддерживайте колонию штамма ТК-NOG путем разведения самок мышей ТК-НОГ с мужскими пометами, не являющихся ТЗ-NOG, и отбирайте трансгенное потомство генотипированием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните генотипирование (см. шаг 3.3), чтобы определить наличие или отсутствие трансгена у новорожденных мышей мужского и женского пола во время отлятки. - Выберите мужчин в возрасте от 6 до 8 недель для трансплантации из-за их высокой чувствительности к GCV-опосредованного истощения HSV-TK трансген-выражения гепатоцитов21.
- Ухо-тег мышей во время отлужели или хирургии, чтобы облегчить идентификацию. Обратите внимание на вес и состояние здоровья животных.
- Поддерживайте колонию штамма ТК-NOG путем разведения самок мышей ТК-НОГ с мужскими пометами, не являющихся ТЗ-NOG, и отбирайте трансгенное потомство генотипированием.
- Генотипирование для присутствия трансгена HSV-TK с использованием количественной реакции полимеразы в реальном времени
- Выполните генотипирование во время отлужели (обычно в возрасте от 3 до 4 недель). Для генотипирования, вырезать кусок мыши ухо в ламинарный поток биологической безопасности кабинета для поддержания бесплодия и экстракт геномной ДНК с помощью геномного комплекта изоляции ДНК.
- Усиливать геномную ДНК, извлеченную из ушной части в 20-ю реакционную смесь на экран для трансгена HSV-TK под контролем промотора альбумина, добавляя 1 зл и л форварда 5'-CCATGCACCTCTTTATCCTGG-3', 1 Л обратной грунтовой части 5'-TAGTTGCAGGGГГГКККК-3', 0.5 L FAM зонд 5'-FAM-AATCGCCCGGGGCTGC-MGB-3', и 10 зл мастер смеси на в режиме реального времени полимеразы цепной реакции (PCR) инструмент22.
- Установите настройки ПЦР в реальном времени следующим образом: 60 градусов по Цельсию на 30 с (предредевая стадия), 95 градусов по Цельсию на 10 мин (удержание), 40 циклов 95 градусов по Цельсию на 15 с и 60 градусов по Цельсию в течение 1 мин (стадия ПЦР) и 60 градусов по Цельсию на 30 с (постред).
ПРИМЕЧАНИЕ: Цикл порога (Ct) ниже 22 считается положительным для трансгена HSV-TK.
- Лечение с использованием ганцикловира и треосульфана
- Используя 27 G иглу, вводить TK-NOG мышей с интраперитонеальной Инъекции ГКВ (6 мг/кг) 2x в день на 7 день и в день 5 в 100 Л солей перед операцией, чтобы истощать трансгенные паранхимальные клетки мышей (как показано в экспериментальной стратегии на рисунке 2)23 .
- В дни 3, 2 и 1 до операции, предпосылки мышей с немиелоаблятивной интраперитонеальной дозы треосульфан (1,5 г/кг/день) в 100 Л соля, используя 27 G иглы.
- За день до операции нарисуйте от двух до трех капель крови из субмандибулярной вены, колоя ее 5-мм ланцетом, и изолировать сыворотку путем центрифуга (1500 х г на 10 мин при температуре 4 градуса Цельсия) для анализа аланина аминотрансферазы (ALT) для оценки дегр ee повреждения печени.
- Подготовка к операции
- Используйте ножницы для бритья меха мыши, окружающего место разреза (слева от стенки перитонеальной) перед операцией.
- Отрегулируйте поток кислорода до 1 л/мин, а изофлуран поток до 3% - 5% в индукционной камере с помощью мышиной анестезии. Поместите одну мышь за один раз в индукционной камере для анестезии.
- Прикрепите один конец стерильной удлинительной трубки (с удерживающей емкостью 550 л подвески; см. таблицу материалов для спецификаций) к игле 30 G, а другой конец шприцу 1 мл.
- Заполните шприц с подвеской (80 л/мышь) объединенных HEPs и HSPCs (см. раздел 2), приспосабливайте шприц в зазубре повторяющейся распределительной трубе, и отрегулируйте дозатор, чтобы распределить 10 ЗЛ в каждом прессе.
- После того, как мыши обезболивают (обычно после 3 - 4 мин), переключите изофлуранный поток на носовой конус и уменьшите скорость изофлуана до 2% - 3%.
- Интраспенетическая трансплантация ГСПК и гепатоцитов у мышей
- Выполните все этапы операции в ламинарном шкафу в стерильных условиях.
- Поместите чистую стерильную драпировку над рабочей поверхностью и скраб левой стороне тела каждой мыши с 10% повидон-йод следуют 70% изопропиловый спирт, прежде чем сделать разрез.
- Сделайте небольшой разрез (1 - 1,5 см в длину и 5 мм в глубину) в коже, мышцах и перитенеума слева от стенки перитонеальной стенки с ножницами типа Ванны, чтобы войти в полость перитонеальной полосты примерно на 5 мм ниже нижнего края грудной клетки.
- Найдите селезенку, слегка потяните ее щипками в операционную зону для легкого доступа и вставьте иглу 30 G в нижний полюс селезенки.
- Разблокируйте поршень от распределительный пипетка и распределите 10 л объема за один раз, с ограничением 60 - 80 л на селезенку. Уречись иглы медленно и клип селезенки с ligating клипы с помощью перевязки applier.
- Нажмите селезенки обратно в полости тела с хлопчатобумажными аппликаторами смачивают стерильной PBS.
- Закрыть мышечный слой брюшной стенки с помощью усваиваемой швы прерванный шовный рисунок (не непрерывный). Выполните закрытие кожи с прерванным рисунком шва с использованием неабсорбируемых швов.
- Используйте теплую воду циркулирующих прокладок для защиты мышей от переохлаждения после операции.
- Удалить неабсорбируемые швы через 10-14 дней после операции.
- Послеоперационный уход
- Когда пересаженные животные просыпаются, вводят обезболивающим бупренорфином (0,1 мг/кг) интраперитонеально, 2 раза в день в течение 3 дней подряд.
- Наблюдайте за животными по крайней мере 1 раз в день, пока они не вернутся к нормальным физическим условиям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте вес тела каждого животного, так как некоторые мыши могут похудеть послеоперации. Мыши обычно восстанавливают свой первоначальный вес в течение 1 до 2 недель.
4. Привляние валидации печени человека eLISA и иммунной системы человека с помощью цитометрии потока
ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените восстановление печени человека и иммунной системы ежемесячно, начиная 1 месяц после трансплантации фермент-связанных иммуносорбента анализа (ELISA) и потока цитометрии, соответственно.
- Собирайте образцы крови из подчелюстной вены с помощью ланцетов в трубках ЭДТА и центрифуги при 1500 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Изолировать сыворотку для проверки уровня альбумина человека для оценки эффективности прививок печени мыши для пересаженных человеческих гепатоцитов, используя человеческий альбумин ELISA квантитационный набор (см. Таблица материалов) следуя производителя Инструкции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не отбрасывайте гранулы и используйте гранулированные клетки для анализа цитометрии потока для оценки восстановления иммунной системы человека. - Приостановите действие клеточной гранулы без сыворотки в 35 qL буфера FACS (PBS 2% FBS) и окрашенных 5 qL мыши конкретных CD45 (концентрация 0,5 мг/мл), 5 qL каждый из человека конкретных антител CD45 (0,1 мг/мл), CD3 (0,2 мг/мл), CD8 (0,1 мг/мл9 , и 20 кЛ CD4 (0,25 мг/мл) и CD14 (0,25 мг/мл) каждый в течение 30 мин при 4 градусах По Цельсию, чтобы проверить развитие функциональной иммунной системы от CD34и HSPCs.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность добавления еще одной трубки неокрашенных клеток для определения запятнанных клеток. - После инкубации, передача окрашенных подвески (100 л) в полистирол круглого дна потока цитометрии трубки и использовать 2 мл 1x лисис буфера (см. таблицу материалов) путем разбавления 1 часть 10x лисис буфера с 9 частями дистиллированной воды и инкубации 10 - 15 мин для лиза красных кровяных телец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за мутностью, чтобы оценить лиза красных кровяных телец. Как только образец становится ясным, лисис завершен. - После лисиса добавьте 3 мл буфера FACS в трубку и центрифугу при 300 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут, чтобы получить гранулы. Повторите стирку, добавив 3 мл буфера FACS в гранулы и центрифугу при 300 х г при 4 кв. м в течение 5 мин.
- Исправить клетки в свежесделанном 1% параформальдегида (PFA) и приобрести окрашенные клетки на поток цитометра, проанализированы с потоком программного обеспечения.
- Для анализа выберите лимфоциты gating на участке FSC/SSC, а затем одноклеточные gating на FSC-области / FSC-высота.
- Кроме того, ворота для человека конкретных CD45 (hCD45) на одноклеточной популяции и включают мыши конкретных CD45 (mCD45) для исключения клеток муринового происхождения. Стратегия gating окрашенных населения на основе gating неокрашенных клеток.
- Ворота hCD45- клетки для определения частоты CD3и Т-клеток и CD19и В-клеток. Клетки gate T для определения подмножества CD4 и CD8. Для оценки моноцитов, ворота на hCD45 для определения CD14и моноцитов.
5. ВИЧ-инфекция мышей ТЗ-НОГ и ее влияние на печень и иммунную систему человека
- Обработка вируса ВИЧ-1 и всех инфицированных мышей в специально отведенном месте для биобезопасности 2 уровня.
ПРЕДЕКТО: Автоклав и отбросить все ВИЧ-инфицированные отходы в двойных биоопасных мешках. В целях безопасности носите резистойкие перчатки при передаче ВИЧ-инфицированных мышей. - Носите личное защитное оборудование (PPE), включая одноразовое платье комбинера, бахилы, маску для лица и двойные перчатки во время работы с вирусом.
- Выберите мышей с воссозданием более 15% клеток CD45человека (проверено в шаге 4.7) и с присутствием человеческого альбумина в сыворотке крови для ВИЧ-1 инфекции (проверено в шаге 4.1).
- Вводят мышам 1 х10 х 1х 1х10 4 ткани культуры инфекционных доз 50 (TCID50) ВИЧ-1ADA в объеме 100 - 200 Л л на мышь, интраперитоне.
- Эвтаназии ВИЧ-инфицированных мышей 5 недель после инфицирования с помощью изофлурана (с изофлурановой концентрации пара в размере йgt;5%).
- После эвтаназии мышей, собирать кровь в трубках ЭДТА путем прокола сердца для изоляции сыворотки, чтобы увидеть влияние ВИЧ-1 на печень, оценивая человека конкретных уровней альбумина eLISA (см. шаг 4.1) и клетки крови, чтобы проверить изменения в иммунной жизни человека клетки, использующие цитометрию потока (см. шаги 4.2 - 4.8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените периферической вирусной нагрузки 5 недель послеинфекции на биоанализаторе, чтобы подтвердить, инфицированы ли мыши. - После рисования крови, акциз печени из эвтаназии мышей.
- Для иссечения печени, подвергать брюшной полости, сделав разрез 1,5 - 2 см в длину и 0,5 см глубоко в коже, мышцах и брюшной полости, от ксифоида. Сделайте разрез перпендикулярно позвоночнику между печенью и диафрагмой. Поднимите печень и разорвать любые мембраны, прикрепляя ее к желудку и кишечнику.
- Сбор и исправить печень в 4% параформальдегида в одночасье и следовать стандартному иммуногистохимическому протоколу для оценки влияния ВИЧ на CK18и гепатоцитов с помощью человека конкретных CK18 антитела8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Создание двойной гуманизированной мыши модели с человеческой печени и иммунных клеток можно легко контролировать на каждом шагу с очень простой ELISA и поток цитометрии, соответственно. Цитометрия потока регулярно выполняется для оценки развития функциональной иммунной системы и для просмотра влияния ВИЧ-инфекции на иммунные клетки. У двойных гуманизированных мышей, развитие функциональных иммунных клеток может варьироваться от 15% до 90% от лимфоцитов ворот. Репрезентативные подмножества иммунных клеток показаны в точечных участках(рисунок 3). Для оценки прививки человеческих гепатоцитов, ELISA для человека конкретных уровней альбумина осуществляется ежемесячно на сыворотке мыши. Мыши, привитые как HSPCs, так и HEPs, показывают уровень альбумина в диапазоне от 7 мкг/мл до 377 мкг/мл в течение одного месяца, продолжая расти в течение времени наблюдения (6 месяцев) (Рисунок 4). Влияние ВИЧ-инфекции на иммунные клетки человека в крови двойных гуманизированных мышей контролируется цитометрией потока и на HEPs в печени человека конкретных альбумин ELISA. К 5 неделям, ВИЧ-1 вызывает снижение уровня альбумина человека в сыворотке крови, по оценке ELISA, и есть истощение человека CK18и гепатоцитов в печени разделов двойных гуманизированных мышей, как оценивается иммуногистохимии (Рисунок 5). Более низкое соотношение CD4:CD8, как правило, наблюдается, по потоку цитометрии, в крови и печени ВИЧ-инфицированных мышей, по сравнению с уровнями, отмеченными в той же мыши до инфекции (Рисунок 6). Все реагенты и материалы, важные для протокола, обсуждаются в таблице материалов.
Рисунок 1 : Схема обогащения CD34- клеток пуповинной крови. (A) Кровь шнура слоистых на лимфоцитов разделения среды (LSM) и центрифугированных изолировать буйный пальто. (B) LS колонны помещаются на магнитной подставке и промыть с буфером BSA, а затем добавить буйный пальто. Клетки, положительные для CD34, застряли в столбцах, а CD34- клетки, выемые в отдельных трубках. Застрявныеклетки CD34 в колонных мели погружаются с поршенем, а клетки собираются в новую трубку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Схематический взгляд на экспериментальную конструкцию для двойной восстановления гуманизированной печени и иммунной системы мышей, а затем ВИЧ-1 инфекции. TK-NOG мышам вводят ганцикловира (GCV) в дозе 6 мг/кг, 2 x в день, в день -7 и день -5, а затем троосульфан инъекции в дни -3, -2 и -1. Для проверки мышей для трансплантации (Tx), аланина аминотрансферазы (ALT) асссе проводится за день до операции, и мышей с уровнями ALT в размере 200 и lt;600 U / L выбраны. После трансплантации, мышей проверяют сярвосстановления иммунной системы человека цитометрией потока (FACS) и для восстановления печени путем оценки их уровня альбумина с помощью ELISA. Мышей заражают ВИЧ-1 5 недель до того, как они приносятся в жертву. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Поток цитометрии анализа gating стратегии для распределения клеток человека крови. (A) Во-первых, лимфоциты закрыты на цельную кровь на основе FSC-A и SSC-A. (B) Одиночные клетки закрыты на лимфоциты. (C) Человек CD45и лейкоциты закрыты на одиночных клетках с помощью мыши CD45 и человека CD45. (D) CD3- Т-клетки и CD19и B-клетки идентифицируются на закрытых CD45и человеческих лейкоцитах. (E) CD4и T-помощник клетки и CD8- цитотоксические Т-клетки идентифицируются в закрытых CD3и Т-клеток. (F) CD14- моноциты закрыты от человека CD45и лейкоцитов. Результаты, представленные здесь от одной мыши пересажены с двойными гепатоцитов человека и HSPCs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Концентрация альбумина измеряется ELISA в сыворотке двойного гуманизированных мышей. Мышей пересаживают как с гепатоцитами человека (HEPs) и CD34 , гематопоиэтичнымстеблем/клетками-прародителями (HSPCs)(n No 11). Сыворотка собирается в разное время при 1, 4 и 6 месяцах после трансплантации, и разбавления производятся для корректировки неизвестных концентраций образцов в диапазоне стандартов. Каждый символ представляет собой отдельное значение мыши. Результаты представляют медиану, а также индивидуальные значения. - П Злт; 0,05, в одну сторону ANOVA. Эта цифра была изменена с Dagur и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Влияние на ВИЧ-1 на уровни альбумина в сыворотке крови и истощение CK18- гепатоцитов человека в печени двойных гуманизированных мышей. (A) Концентрации альбумина контролируются у неинфицированных мышей(n No 9) пересаженных с обоих человека HEPs и HSPCs на 1 и 4 месяцев. Мыши инфицированы(n No 10) с ВИЧ в 4 - 5 месяцев после трансплантации и пожертвовал 5 недель после инфекции. Каждый символ представляет собой отдельное значение мыши. Результаты представляют медиану, а также индивидуальные значения. - П Злт; 0,05, в одну сторону ANOVA. Эта цифра была изменена из Дагур идр. 8. (B) Пять микрон печени разделы от неинфицированных (HEPs и HSPCs, левая панель) и ВИЧ-инфицированных TK-NOG мышей (HEPs - HSPCs - ВИЧ, правая панель) являются фиксированными, парафин встроенные, и окрашенные для анти-человеческого цитокератин-18 (CK18) антитела. ВИЧ-1, вызывающий истощение клеток CK18и гепатоцитов, свидетельствует о менее оккупированной территории клетками человека CK18. Результаты, представленные здесь от одного неинфицированного и один ВИЧ-инфицированных мышь пересажены с двойными человеческими гепатоцитами и HSPCs. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Соотношение клеток CD4и CD8и Т-клеток в периферической крови и в печени двойного восстановленного неинфицированных и ВИЧ-1-инфицированных мышей. Для двойного воссозданы неинфицированных мышей: замкнутый круг; HEPs - HSPCs; кровь n No 7; печень n No 6. Для ВИЧ-1 инфицированных мышей: открытые круги; HePs - HSPCs - ВИЧ; кровь n No 10; печень n No 11. Результаты представляют медиану, а также индивидуальные значения. P qlt; 0.05, одностороннее тест ANOVA между ВИЧ-инфицированными и неинфицированными мышами. Эта цифра была изменена с Dagur и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Печень скомпрометирована и повреждена у ВИЧ-инфицированных пациентов24. Экспериментальные модели малых животных для изучения заболеваний печени человека в присутствии ВИЧ-1 крайне ограничены, несмотря на наличие нескольких скотрансажированных моделей животных с CD34и HSPCs и гепатоцитами7,12, 25. В экспериментах in vitro, гепатоциты показаны, что имеют низкую инфекцию HIV-126. Гуманизированные мыши, которые несут оба типа человеческих клеток являются желательной моделью. Печень мышей восстановлена только с иммунной системой человека было показано, что пострадавших от ВИЧ-инфекции в рамках экспериментального истощения человека регулирующих Т-клеток20,27. Однако разница в иммунных и функциональных свойствах мышей и гепатоцитов человека может подчеркнуть различия в их реакции на ВИЧ-1 и иммунные клетки. В этом обзоре описывается протокол для восстановления иммунной системы и печени человека и для решения ВИЧ-1 связанных иммунопатологии печени, как наблюдается у ВИЧ-1-инфицированных пациентов. TK-NOG мышей были отобраны из-за их печени селективного высокой мРНК выражение HSV-TK трансгена и восприимчивость Токсичности ГКВ мыши трансгенной печени21. Кроме того, они могут сохраняться в течение длительного времени после трансплантации без применения экзогенных препаратов и не развиваются спонтанные системные заболевания28. Для установления иммунной системы человека и восстановления печени, абляция иммунной системы мыши и повреждения мыши конкретных клеток печени необходимы и достигнуты с использованием немиелоабливных доз треосульфана и ГКВ, как показано ранее в TK-NOG мышей мужскогопола 13 ,23. Мыши вводят с GCV и treosulfan в возрасте от 6 до 8 недель, как выражение трансгена и GCV индуцированной печеночной травмы, как оценивается по уровням ALT являются оптимальными, то для обеспечения нишу к пересаженной клеток человека21. Мыши, показывающие уровни ALT в размере 200 u/l, но qlt;600 U/L, обычно выбираются для трансплантации. Мыши, показывающие уровни ALT в размере 600 U/L, подвергаются большему риску смерти, так как человеческие гепатоциты не в состоянии спасти поврежденную функцию печени мыши.
В настоящее время двойная гуманизация показана трансплантацией человека CD34и HSPCs и клеток печени плода; однако, манипуляции новорожденных животных создает технические проблемы13,14. HSPCs могут быть получены или изолированы из нескольких источников, таких как клетки печени плода (FLCs), эмбриональные стволовые клетки (ESCs), и CB. Тем не менее, этические вопросы ограничивают использование ESCs и FLCs. CB не имеет такого ограничения и является наиболее полезной альтернативой для получения HSPCs, а также является ценным источником примитивных гематопогетических стволовых и клеток-прародителей, которые могут воссоздать функциональный иммунитет Системы. Кровь шнура не должна быть старше одного дня, когда используется для изоляции HSPCs, так как выход HSPCs сильно зависит от возраста. Чистота изолированных HSPCs должны быть проверены до криоконсервирования клеток. Перекрестного загрязнения CD3и Т-клеток избежать, так как это может привести к системной пересадки мыши -по сравнениюс-хозяина болезни и острого алдоотказая HEPs при пересадке с несоответствующими клетками.
Коммерчески доступные гепатоциты были использованы в качестве источника для восстановления печени8,13. Взрослые гепатоциты являются предпочтительными для создания восстановления печени в связи с их повышенной эффективностью в трансплантации и устойчивости в течение длительного периода времени29.
Присутствие иммунной системы человека в мышиной модели увеличило уровни ALB, как показано ранее30,31. Тем не менее, эффективность гепатоцитов и восстановления иммунной системы может варьироваться в зависимости от различных источников донорских клеток и зависит от мыши получателя. Таким образом, каждая мышь должна быть оценена для прививки, и наиболее важной частью является использование антител или реагентов, которые являются конкретными для человека и не перекрестно реагировать с клетками мыши. Реагенты и антитела, используемые в исследовании,представленном здесь, подробно описаны в таблице материалов. Если антитела, кроме, чем предусмотрено в таблице материалов используются для исследования, не забудьте проверить на человеческую специфику.
Оптимальным условием будет трансплантация синенических клеток; однако технически это трудно сделать. Там, где это возможно, HSPCs и гепатоциты должны быть объединены от доноров с частично подобранными человеческими антигенами класса лейкоцитов-1 (например, HLA-A2).
Для проверки мышей для изучения ВИЧ, кровь обращается в несколько точек времени, чтобы определить оптимальный иммунной и печени восстановления; цитометрии потока и ELISA являются предпочтительными, поскольку они могут быть выполнены только с небольшим количеством крови. Клетки крови и сыворотки из одного образца могут быть использованы для цитометрии потока и ELISA, соответственно. Важно сделать правильное разбавление сыворотки в каждый временной момент (1000 - 40 000 диапазон) для оценки уровней ALB, так что неизвестные концентрации могут быть приведены в диапазоне стандартных концентраций (диапазон комплекта: 6,25 - 400 нг/мл).
Провоспалительные цитокины в ответ на ВИЧ-1 инфекцию в присутствии иммунной системы человека также могут быть полезны в решении взаимодействия гепатоцитов и иммунных клеток. Модель полезна для показа иммунопатогенеза ВИЧ-1-индуцированной болезни печени, учитывая, что она резюмирует повреждения печени таким же образом, как и у людей, о чем свидетельствует низкий коэффициент CD4:CD8, снижение уровня ALB, смерть гепатоцитов человека и иммунная печень Активации. Модель также имеет некоторые ограничения, такие как низкий уровень цитотоксических Т-клеток деятельности и нарушения иммуноглобулина класса переключения. Благодаря наличию как иммунной системы человека, так и печени, представленная здесь модель перспективна для шпили-коинфекции вирусов ВИЧ-1 и гепатита, хронической инфекции гепатита (для уточнения механизмов антигепатитного иммунного ответа), а также в виде цирроза печени Модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения грант R24OD018546 (в L.Y.P. и S.G.). Авторы хотели бы поблагодарить Вайчжэ Ли, доктор философии, за помощь в хирургических процедурах, Аманда Бранч Вудс, B.S., Ян Ченг для иммуногистологии, UNMC потока цитометрии членов научно-исследовательского центра директор Филипп Хексли, доктор философии, Виктория Б. Смит, B.S., и Саманта Уолл, B.S., UNMC передовые микроскопии основных членов объекта Дженис А. Тейлор, B.S., и Джеймс Р. Таласка, B.S., для технической поддержки. Авторы признают д-ра Мамору Ито и Хироси Суамидзу из CIEA за предоставление мышей ТК-НОГ и д-ра Иоахима Баумгарта за предоставление треосульфана. Авторы благодарят д-ра Адриана Кестерса, UNMC, за ее редакционный вклад в рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
