Summary
Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.
Abstract
Apesar da expectativa de vida aumentada dos pacientes contaminados com o vírus de imunodeficiência humana-1 (HIV-1), a doença de fígado emergiu como uma causa comum de sua morbosidade. A Imunopatologia hepática causada pelo HIV-1 permanece elusiva. Os modelos animais pequenos do xenograft com hepatócitos humanos e o sistema imunitário humano podem recapitular a biologia humana da patogénese da doença. Nisto, um protocolo é descrito para estabelecer um modelo humanizado duplo do rato com os hepatócitos humanos e o transplante de CD34+ hematopoietic/pilhas do progenitor (hspcs), para estudar a Imunopatologia do fígado como observado em pacientes HIV-contaminados. Para conseguir a reconstituição dupla, o macho TK-NOG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (ALB-tk) 7-2/shijic) os camundongos são injetados intraperitonealmente com doses de ganciclovir (GCV) para eliminar as células hepáticas transgênicas do camundongo, e com treosulfano para condicionamento não mieloablativo, ambos facilitar o desenvolvimento de hepatócitos humanos (HEP) e do sistema imunológico humano (HIS). Os níveis da albumina humana (ALB) são avaliados para o Engraftment do fígado, e a presença de pilhas imunes humanas no sangue detectado pela citometria do fluxo confirma o estabelecimento do sistema imunitário humano. O modelo desenvolvido utilizando o protocolo aqui descrito assemelha-se a múltiplos componentes de lesão hepática por infecção pelo HIV-1. Seu estabelecimento poderia revelar-se essencial para estudos da co-infecção do vírus de hepatite e para a avaliação de antivirais e de drogas antiretroviral.
Introduction
Desde o advento da terapia antirretroviral, houve uma diminuição substancial nos óbitos relacionados à monoinfecção pelo HIV-1. Noentanto, adoença hepática surgiu como uma causa comum de morbidade em pacientes infectados pelo HIV1,2. Coinfecções de vírus da hepatite com infecção pelo HIV-1 são mais comuns, representando 10%-30% das pessoas infectadas pelo HIV nos Estados Unidos3,4,5.
A especificidade do hospedeiro do HIV-1 e dos vírus da hepatite limita a utilidade de pequenos modelos animais para estudar doenças infecciosas específicas do homem ou para investigar múltiplos aspectos da patogênese hepática associada ao HIV-1. Camundongos imunodeficientes que permitem o Engraftment de células humanas e/ou tecidos (denominados modelos humanizados do camundongo) são modelos animais aceitáveis para estudos pré-clínicos6,7,8. Desde a introdução de camundongos humanizados no início dos anos 2000, vários estudos pré-clínicos de toxicidade hepática humana colestática, patógenos específicos do homem, incluindo HIV-1 e distúrbios neurocognitivos associados ao HIV, vírus Epstein Barr, hepatite e outros doençasinfecciosas, foraminvestigadas nesses camundongos6,9,10,11. Os modelos múltiplos do rato para CD34+ hspcs e/ou a transplantação humana do hepatócito têm sido desenvolvidos por muito tempo e melhoraram sobre o tempo para estudar a patogénese da doença do vírus de hepatite B (HBV)-doença de fígado associada12, 13 anos de , 14. vários modelos para hspc e hepatócitos humanos (HEP) transplante são baseados em cepas, conhecido como Nog (Nod. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (Nod. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, e Fah-/- Nod rag1-/- il2rγnull mouse16. No entanto, cada modelo tem suas próprias vantagens e limitações; por exemplo, AFC8 camundongos humanizados duplos para HEPs e células-tronco humanas (HSCs) em um Balb/C-Rag2-/- γc-/- background permite o bem sucedido Engraftment de células imunes e hscs, mas há uma ausência de um antígeno-específico T-e B-Cell resposta neste modelo12. As principais preocupações em reconstituir camundongos humanizados duplos incluem o Engraftment suboptimal, a falta de modelos adequados para suportar diferentes tecidos, condições incompatíveis, rejeição imune, ou doença do enxertocontrao hospedeiro (DECH), e técnicas dificuldades, como manipulações de risco com recém-nascidos e altas taxas de mortalidade devido a anormalidades metabólicas13.
Embora os camundongos humanizados tenham sido usados para a pesquisa por HIV há muitos anos17,18,19, o uso de camundongos humanizados para estudar os danos hepáticos causados pelo HIV-1 tem sido limitado20. Nós relatamos previamente o estabelecimento de um modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG e de sua aplicação na doença de fígado HIV-associada8. Este modelo mostra o Engraftment robusto do fígado e das pilhas imunes e recapitula a patogénese da infecção do HIV. Esta discussão apresenta um protocolo detalhado, incluindo os passos mais críticos no transplante de hepatócitos humanos. Uma descrição dos HSPCs exigidos para um Engraftment bem sucedido dos HEPs e o estabelecimento de um sistema imune funcional em ratos de TK-NOG é apresentada igualmente. O uso destes ratos para estudar o imunopatogênese HIV-associado do fígado é detalhado. Os ratos masculinos de TK-Nog que carreg um tipo fígado-específico do vírus de palavra simples de herpes-1 transgene da quinase do timidina (HSV-tk) são usados. As células hepáticas do rato que expressam este transgene podem ser facilmente abladas após uma breve exposição a uma dose não tóxica de GCV. As pilhas de fígado humanas transplantadas são mantidas estàvel dentro do fígado do rato sem medicina exógena21. Os camundongos também são pré-condicionados com doses nonmyeloablative de treosulfan para criar um nicho na medula óssea do rato para células humanas8. Os camundongos imunodeficientes TK-NOG são injetados intrasplenicamente com HEPs e HSPCs multipotentes. Os ratos são monitorados regularmente para a reconstituição do sangue e do fígado pelo imunofenotipagem do sangue e pelas medidas de níveis da humano-albumina do soro, respectivamente. Camundongos com uma reconstituição bem-sucedida de mais de 15% para ambas as células imunes humanas e HEPs são injetados intraperitonealmente com HIV-1. O efeito do HIV no fígado pode ser avaliado tão cedo quanto 4-5 semanas pós-infecção. É importante notar que, porque o HIV-1 é usado, todas as precauções necessárias devem ser tomadas durante o manuseio do vírus e injetá-lo em camundongos.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) no centro médico da Universidade de Nebraska.
Nota: Obter a aprovação do IACUC local antes de realizar experimentos em animais.
1. processamento de sangue do cordão umbilical e o isolamento de HSPCs humanos
- Realize todas as etapas do protocolo condições estéreis em armários de fluxo laminar.
- Tome o sangue do cordão umbilical (CB) coletado em tubos heparinizados e faça o volume até 35 mL adicionando soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). Mergulhe a amostra em cima do meio de separação de linfócitos (LSM) como ilustrado na Figura 1 e Centrifugue o LSM com o CB em camadas em 400 x g por 35 min a 4 ° c sem freios.
Nota: diluir o sangue com cuidado e suavemente para evitar a mistura na interface. - Remova o LSM superior e a camada de plasma com cuidado e transfira a relação Buffy branca do revestimento a um tubo novo usando uma pipeta de transferência.
- Ressuscita o casaco Buffy em 30-40 mL de tampão gelo-frio (PBS + 0,5% de albumina sérica bovina [BSA] + 2 mM de ácido etilenodiaminotraacético [EDTA]). Usando uma pipeta, combine 20 μl da suspensão da pilha com 20 μl do azul do Tripan de 0,4% e pipeta 10 μL da mistura na abertura exterior de uma das duas câmaras de uma corrediça de contagem e insira a corrediça em um contador automatizado da pilha para contar as pilhas.
Nota: Use o tampão Ice-Cold em todas as etapas, porque ajuda a manter as pilhas viáveis. - Centrifugue as células a 300 x g durante 10 min a 4 ° c e aspire o sobrenadante com cuidado. Em seguida, adicione 300 μL de tampão gelo-frio.
- Adicionar 100 μL de reagente de bloqueio de receptores FC humanos e 100 μL de microgrânulos conjugados de anticorpo CD34 monoclonais de camundongo para até 1 x 108 células (ver a tabela de materiais). Incubar durante 30 min a 4 ° c, adicionar 10 mL de tampão gelado para lavar as células e centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° c.
Nota: Escale isso de acordo com o número da célula se mais de 1 x 108 células estiverem presentes. - Retire cuidadosamente o sobrenadante, resuma a pelota em 500 μL de tampão e prossiga com a etapa de separação magnética para enriquecer os HSPCs.
- Coloque uma coluna LS de seleção positiva (consulte a tabela de materiais) no campo de classificação de célula ativada por magnético e passe-a com 3 ml de buffer.
- Carregue a amostra para a coluna ls que pode Trap microesferas ligado ao humano CD34 + em amostras e permitir que ele flua a influência da gravidade no tubo de coleta.
- Lave a coluna 3x com tampão e colete o eluir no mesmo tubo da coleção do CD34- fração das pilhas.
- Mergulhe a coluna com 5 ml de tampão para eluir as pilhas de CD34+ em um tubo de coleção novo. Repita o procedimento para obter uma pureza de > 90%.
- Conte as pilhas CD34+ eluidas usando o corante azul de Tripan em um Hemocytometer. Após a contagem, Centrifugue as pilhas CD34+ em 300 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
- Resuspend as pilhas de CD34+ em 25 μL de PBS para que uma injeção seja usada imediatamente no transplante ou criopreservar as pilhas em uma concentração de 1-2 milhões/ml no meio de congelação (meio do Instituto do Memorial de Roswell Park [meio de RPMI 1640] + 50% fetal soro bovino (FBS) + 10% dimetil sulfóxido [DMSO]) para posterior utilização no transplante.
Nota: Sempre recontar células viáveis antes de usá-los em transplante. - Para verificar a pureza do CD34+ elute, tomar 50 μL da suspensão e incubar-lo com 10 ΜL de PE-conjugado anti-humano CD34 anticorpo para 30 min a 4 ° c. Após a incubação do anticorpo, lave as células manchadas com PBS, ressuscitem-as em 100 μL de PBS e, em seguida, proceder para realizar a citometria de fluxo. Adicione um tubo adicional das pilhas sem o anticorpo para projetar a porta no cytometer do fluxo.
- Após a aquisição, analise os dados selecionando a região de interesse em um gráfico de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC), seguido de gating para células individuais em parcelas FSC-area e FSC-Height. Pilhas CD34-positive da porta em únicas pilhas no canal do PE e no lote da SSC-área.
2. preparação de hepatócitos humanos para transplante
- Retire os hepatócitos criopreservados do nitrogênio líquido, mergulhe rapidamente o frasco no banho de água e descongele por aproximadamente 90-120 s.
- Retire a tampa do frasco para injetáveis e despeje os hepatócitos descongelados no tubo cônico de 50 mL do meio de descongelar aquecido.
- Suspenda as células balançando o tubo 50 mL com a mão por alguns segundos.
Nota: Não vórtice o tubo. - Pellet as células em 100 x g por 8 min à temperatura ambiente. Lave as células peletizadas em PBS com 0,1% de BSA e a piscina com HSPCs frescos ou descongelados (razão 10:1) em PBS em um volume final de 80 μL/mouse.
3. manipulação animal, triagem, genotipagem e tratamento para HSPC humano e transplante de hepatócitos
- Manuseio de animais
- Como resultado de imunodeficiência grave, raça, casa, e lidar com camundongos TK-NOG condições assépticas.
- Sempre use um jaleco, luvas, capas de sapato e uma máscara facial para prevenir a infecção com microrganismos potencialmente patogênicos.
- Use luvas estéreis e instrumentos para a cirurgia e manuseie os animais assepticamente durante toda a cirurgia.
- Selecionando camundongos TK-NOG para o experimento
- Manter a colônia de estirpe TK-NOG através da criação de camundongos fêmeas TK-NOG com littermates masculinos não-TK-NOG e selecionar descendentes transgênicos por genotipagem.
Nota: Realize a genotipagem (ver etapa 3,3) para determinar a presença ou ausência do transgene em camundongos machos e fêmeas recém-nascidos no momento do desmame. - Machos seletos em 6-8 semanas da idade para a transplantação devido a sua sensibilidade elevada à depleção GCV-negociada de HSV-TK transgene-expressando hepatócitos21.
- Ear-tag os ratos no momento do desmame ou cirurgia para facilitar a identificação. Anote o peso e o estado de saúde dos animais.
- Manter a colônia de estirpe TK-NOG através da criação de camundongos fêmeas TK-NOG com littermates masculinos não-TK-NOG e selecionar descendentes transgênicos por genotipagem.
- Genotyping para a presença do transgene de HSV-TK usando a reacção em cadeia quantitativa do polymerase do tempo real
- Realize a genotipagem no momento do desmame (geralmente às 3-4 semanas de idade). Para Genotyping, corte uma parte da orelha de rato em um armário de segurança biológico do fluxo laminar para manter a esterilidade e extraia o ADN genomic usando um jogo genomic do isolamento do ADN.
- Amplificar o DNA genómico extraído da peça de orelha em uma mistura de reação de 20 μL para a tela para HSV-TK transgene o controle do promotor de albumina humana, adicionando 1 μL de primer dianteiro 5 '-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3 ', 1 μL de primer reverso 5 '-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3 ', 0,5 μL de FAM Probe 5 ′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 ', e 10 μL de Master Mix em um instrumento de reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR)22.
- Ajuste os ajustes do PCR do tempo real como segue: 60 ° c para 30 s (estágio do preread), 95 ° c por 10 minutos (estágio da preensão), 40 ciclos de 95 ° c para 15 s e 60 ° c para 1 minuto (estágio do PCR), e 60 ° c para 30 s (estágio do postread).
Nota: Um ciclo de limiar (TC) abaixo de 22 é considerado positivo para o transgene HSV-TK.
- Tratamento com ganciclovir e treosulfan
- Usando a agulha de 27 G, injete os camundongos TK-NOG com injeções intraperitoneal de GCV (6 mg/kg) 2x por dia no dia 7 e no dia 5 em 100 μL de soro fisiológico antes da cirurgia para esgotar as células parenquimatosas transgênicas dos camundongos (como mostrado na estratégia experimental na Figura 2)23 .
- Nos dias 3, 2 e 1 antes da cirurgia, camundongos pré-condicionantes com doses intraperitoneal nonmyeloablative do treosulfan (1,5 g/kg/day) em 100 μL do soro fisiológico, usando uma agulha de 27 G.
- Um dia antes da cirurgia, desenhe duas a três gotas (~ 100 μL) de sangue da veia submandibular, picando-a com uma lanceta de 5 mm, e isolar o soro por centrifugação (1.500 x g por 10 min a 4 ° c) para o ensaio de alanina AMINOTRANSFERASE (Alt) para avaliar o degr de danos hepáticos.
- Preparação para a cirurgia
- Use Clippers para raspar a pele do mouse em torno do local da incisão (à esquerda da parede peritoneal) antes da cirurgia.
- Ajuste o fluxo de oxigênio para 1 L/min e o fluxo de isoflurano para 3%-5% em uma câmara de indução usando uma máquina de anestesia do mouse. Coloque um rato de cada vez na câmara de indução para anestesia.
- Fixar a extremidade de um tubo de extensão estéril (com uma capacidade de retenção de 550 μL de suspensão; ver a tabela de materiais para especificações) a uma agulha de 30 G e a outra extremidade a uma seringa de 1 ml.
- Encha a seringa com a suspensão (80 μL/rato) de HEPs e HSPCs agrupados (ver secção 2), encaixe a seringa no entalhe de uma pipeta de dosagem repetitiva e ajuste o dispensador para dispensar 10 μL em cada prensa.
- Uma vez que os camundongos são anestesiados (geralmente após 3-4 min), alterne o fluxo de isoflurano para o cone do nariz e reduza a vazão de isoflurano para 2%-3%.
- Transplante intrasplenic de HSPCs humanos e hepatócitos em camundongos
- Realize todas as etapas da cirurgia em um armário do fluxo laminar circunstâncias estéreis.
- Coloc um Drape estéril limpo sobre a superfície de funcionamento e esfregue o lado esquerdo do corpo de cada rato com o Povidone-Iodo de 10% seguido pelo álcool do isopropílico de 70%, antes de fazer uma incisão.
- Faça uma pequena incisão (~ 1-1,5 cm de comprimento e 5 mm de profundidade) na pele, músculo e peritônio à esquerda da parede peritoneal com a tesoura tipo Vanna para entrar na cavidade peritoneal aproximadamente 5 mm abaixo da borda inferior da caixa torácica.
- Localize o baço, puxe-o ligeiramente com fórceps para a área de operação para facilitar o acesso, e insira a agulha de 30 G no pólo inferior do baço.
- Desbloqueie o êmbolo da pipeta doseadora e dispense 10 μL do volume de cada vez, com um limite de 60-80 μL por baço. Retraia a agulha lentamente e grampeie o baço com grampos de ligação usando um aplicador de ligadura.
- Empurre o baço de volta para a cavidade do corpo com os aplicadores com ponta de algodão umedados com PBS estéril.
- Feche a camada muscular da parede abdominal usando uma sutura absorvível padrão de sutura interrompida (não contínua). Realize o fechamento da pele com um padrão de sutura interrompido usando suturas não absorvíveis.
- Use almofadas de circulação da água morna para proteger os ratos da hipotermia após a cirurgia.
- Remover suturas não absorvíveis 10-14 dias após a cirurgia.
- Cuidados pós-operatórios
- Quando o animal transplantado acordar, injete a buprenorfina analgésica (0,1 mg/kg) intraperitonealmente, 2x por dia durante 3 dias consecutivos.
- Observe os animais pelo menos 1x por dia até que retornem às condições físicas normais.
Nota: Verifique o peso corporal de cada animal, uma vez que alguns camundongos podem perder peso pós-cirurgia. Os camundongos normalmente recuperam seu peso original em 1 a 2 semanas.
4. validação do Engraftment do fígado humano por ELISA e pelo sistema imunitário humano pelo fluxo cytometry
Nota: Avalie a reconstituição do fígado humano e do sistema imunológico mensalmente, iniciando 1 mês pós-transplante por ensaio imunoenzimático (ELISA) e citometria de fluxo, respectivamente.
- Colete amostras de sangue da veia submandibular usando lancetas em tubos de EDTA, e Centrifugue a 1.500 x g por 10 min a 4 ° c. Isolar o soro para verificar os níveis de albumina humana para avaliar a eficiência do Engraftment do fígado do rato para hepatócitos humanos transplantados, utilizando um conjunto de quantificação ELISA de albumina humana (ver a tabela de materiais) seguindo o Instruções.
Nota: Não descarte o pellet e use as células peletizadas para uma análise de citometria de fluxo para avaliar a reconstituição do sistema imunológico humano. - Ressuscitem o pellet celular sem soro em 35 μL de tampão FACS (PBS + 2% FBS) e corados com 5 μL de CD45 (concentração 0,5 mg/mL), 5 μL de anticorpos humanos específicos CD45 (0,1 mg/mL), CD3 (0,2 mg/mL), CD8 (0,1 mg/mL) e CD19 (0,5 mg/mL) , e 20 μL de CD4 (0,25 mg/mL) e CD14 (0,25 mg/mL) cada um por 30 min a 4 ° c, para verificar o desenvolvimento de um sistema imunológico funcional de CD34+ hspcs.
Nota: Considere adicionar um tubo adicional de células não manchadas para determinar a gating das células manchadas. - Após a incubação, transfira a suspensão manchada (~ 100 μL) em um tubo de citometria de fluxo de fundo redondo de poliestireno e use 2 mL de tampão de Lise 1x (veja a tabela de materiais) diluindo 1 parte do tampão de Lise 10x com 9 partes de água destilada e incubando 10- 15 min para lyse glóbulos vermelhos.
Nota: observar a turbidez para avaliar a Lise das células vermelhas do sangue. Uma vez que a amostra se torna desobstruída, o lysis está completo. - Após o lysis, adicione 3 mL do tampão de FACS no tubo e Centrifugue -o em 300 x g em 4 ° c por 5 minutos para começ um pellet. Repita a lavagem adicionando 3 mL de tampão FACS ao pellet e Centrifugue a 300 x g a 4 ° c por 5 min.
- Fixar as células na recém-feita 1% paraformaldeído (PFA) e adquirir células manchadas no citometro de fluxo, analisado com software de fluxo.
- Para a análise, selecione os linfócitos que gating em um lote de FSC/SSC, seguido pela única-pilha que gating na FSC-área/FSC-altura.
- Promova, porta para o CD45 humano-específico (hCD45) na população da único-pilha e inclua o rato-específico CD45 (mCD45) para a exclusão das pilhas da origem murino. Strategize a gating da população manchada baseada no gating de pilhas unmanchadas.
- Porta hCD45+ Cells para determinar a frequência de células T CD3+ e células CD19+ B. Células T da porta para determinar os subconjuntos CD4 e CD8. Para avaliar monócitos, portão em hCD45 para determinar CD14+ monócitos.
5. infecção por HIV de camundongos TK-NOG e seu efeito sobre o fígado humano e sistema imunológico
- Manuseie o vírus HIV-1 e todos os camundongos infectados em uma instalação de nível 2 de biossegurança designada.
Atenção: Autoclave e descarte todos os resíduos infectados pelo HIV em sacos de dupla Biohazard. Por razões de segurança, use luvas resistentes ao corte ao entregar camundongos infectados pelo HIV. - Use equipamentos de proteção individual (EPI), incluindo um vestido de Coverall descartável, capas de sapato, uma máscara facial, e luvas duplas em todos os momentos enquanto trabalhava com o vírus.
- Selecione camundongos com uma reconstituição de mais de 15% das células CD45+ humanas (testadas na etapa 4,7) e com a presença de albumina humana no soro para infecção pelo HIV-1 (testado na etapa 4,1).
- Injete os camundongos com 1 x 103 a 1 x 104 cultura do tecido doses infecciosas 50 (TCID50) HIV-1ADA em um volume de 100-200 μl por rato, intraperitoneally.
- Eutanizar os camundongos infectados pelo HIV 5 semanas após a infecção pelo uso de isoflurano (com uma concentração de vapor de isoflurano de > 5%).
- Após a eutanização dos camundongos, coletar sangue em tubos de EDTA por uma punção cardíaca para o isolamento do soro, para ver o efeito do HIV-1 no fígado, avaliando os níveis de albumina específicos do homem por ELISA (ver passo 4,1) e células sanguíneas para verificar se há alterações no imune humano células utilizando citometria de fluxo (ver passos 4,2-4,8).
Nota: Avalie a carga viral periférica 5 semanas pós-infecção em um bioanalisador para confirmar se os camundongos estão infectados. - Depois de extrair sangue, extirpar o fígado dos ratos eutanasiados.
- Para a excisão do fígado, expor a cavidade abdominal, fazendo uma incisão de 1,5-2 cm de comprimento e 0,5 cm de profundidade na pele, músculos e peritônio, a partir do xyphoid. Faça um corte perpendicular à coluna vertebral entre o fígado e o diafragma. Levante o fígado e cortar todas as membranas anexá-lo ao estômago e intestinos.
- Coletar e fixar o fígado em 4% paraformaldeído durante a noite e seguir um protocolo imunoistoquímico padrão para avaliar o efeito do HIV em CK18+ hepatócitos, usando o anticorpo humano-específico CK188.
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Representative Results
O estabelecimento de um modelo humanizado duplo do rato com fígado humano e pilhas imunes pode facilmente ser monitorado em cada etapa com ELISA muito simples e cytometry do fluxo, respectivamente. A citometria de fluxo é realizada regularmente para avaliar o desenvolvimento de um sistema imunológico funcional e para ver o efeito da infecção pelo HIV nas células imunes. Em camundongos humanizados duplos, o desenvolvimento de células imunes funcionais pode variar de 15% a 90% da porta do linfócito. Subconjuntos representativos de células imunes são mostrados em parcelas de pontos (Figura 3). Para a avaliação do Engraftment de hepatocytes humanos, ELISA para níveis humano-específicos da albumina é executada mensalmente no soro do rato. Camundongos enenxertados com HSPCs e HEPs mostram níveis de albumina específicos de humanos variando de ~ 7 μg/mL a 377 μg/mL em um mês, continuando a crescer ao longo do tempo de observação (6 meses) (Figura 4). O efeito da infecção pelo HIV em células imunes humanas no sangue de camundongos humanizados duplos é monitorado por citometria de fluxo e em HEPs no fígado por ELISA de albumina específica humana. Por 5 semanas, o HIV-1 causa uma diminuição nos níveis de albumina humana no soro, como avaliado por ELISA, e há um esgotamento de CK18+ hepatócitos humanos nas seções do fígado de ratos humanizados duplos, como avaliados por immunohistochemistry (Figura 5). Uma menor proporção de CD4: CD8 é tipicamente observada, por citometria de fluxo, no sangue e no fígado de camundongos infectados pelo HIV, em comparação com os níveis observados no mesmo camundongo antes da infecção (Figura 6). Todos os reagentes e materiais importantes para o protocolo são discutidos na tabela de materiais.
Figura 1 : Esquemático do enriquecimento de células CD34+ do sangue do cordão umbilical. (A) o sangue do cordão umbilical é mergulhado no meio de separação dos linfócitos (LSM) e centrifugado para isolar o revestimento Buffy. (B) ls colunas são colocadas em um suporte magnético e enxaguados com tampão BSA, seguido pela adição de casaco Buffy. As pilhas positivas para CD34 são prendidas nas colunas, e os CD34- Cells são eluída em tubos separados. Células CD34+ presas em resinas de coluna são mergulhada com um êmbolo, e as células são coletadas em um novo tubo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Visão esquemática do delineamento experimental para a dupla reconstituição de camundongos humanizados do fígado e do sistema imunológico, seguida de infecção pelo HIV-1. Os camundongos TK-NOG são injetados com ganciclovir (GCV) na dose de 6 mg/kg, 2x por dia, no dia-7 e dia-5, seguidos por uma injeção de treosulfano nos dias-3,-2 e-1. Para a tela dos camundongos para o transplante (TX), um ensaio de alanina aminotransferase (ALT) é realizado um dia antes da cirurgia, e camundongos com níveis de ALT de > 200 e < 600 U/L são selecionados. Após o transplante, os camundongos são verificados para uma reconstituição do sistema imunológico humano por citometria de fluxo (FACS) e para a reconstituição do fígado, avaliando o seu nível de albumina usando ELISA. Os camundongos estão infectados com HIV-1 5 semanas antes de serem sacrificados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise da citometria de fluxo que gating a estratégia para a distribuição humana da pilha do sangue. (A) primeiramente, os linfócitos são fechados no sangue inteiro baseado em FSC-a e em SSC-a. (B) as únicas células são bloqueadas em linfócitos. (C) humanos CD45+ leucócitos são fechados em células simples usando mouse CD45 e CD45 humano. (D) células T CD3+ e células CD19+ B são identificadas nos leucócitos CD45+ humanos fechados. (E) as pilhas do ajudante de CD4+ t e as pilhas de t CD8+ citotóxica são identificadas em pilhas gated de CD3+ t. (F) CD14+ monócitos são fechados a partir de CD45+ leucocitos humanos. Os resultados aqui representados são de um rato transplantado com hepatócitos humanos duplos e HSPCs. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : A concentração de albumina é medida por Elisa no soro de camundongos humanizados duplos. Os camundongos são transplantados com hepatócitos humanos (HEPs) e células de tronco/progenitoras hematopoiéticas CD34+ (HSPCs) (n = 11). O soro é coletado em épocas diferentes em 1, 4, e 6 meses de posttransplante, e as diluições são feitas para ajustar as concentrações desconhecidas da amostra na escala dos padrões. Cada símbolo representa um valor de mouse individual. Os resultados representam a mediana, bem como os valores individuais. * P < 0, 5, por ANOVA One-Way. Este número foi modificado de Dagur et al.8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Efeito sobre o HIV-1 em níveis de albumina no soro e a depleção de CK18+ hepatócitos humanos no fígado de camundongos humanizados duplos. (A) as concentrações de albumina são monitoradas em camundongos não infectados (n = 9) transplantados com Heps e hspcs humanos em 1 e 4 meses. Os camundongos estão infectados (n = 10) com HIV em 4-5 meses pós-transplante e sacrificados 5 semanas pós-infecção. Cada símbolo representa um valor de mouse individual. Os resultados representam a mediana, bem como os valores individuais. * P < 0, 5, por ANOVA One-Way. Este número foi modificado de Dagur et al. 8. (B) as seções do fígado de cinco mícron de não infectados (Heps + hspcs, painel esquerdo) e camundongos HIV-contaminados de TK-Nog (Heps + hspcs + HIV, painel direito) são fixos, parafina encaixadas, e manchados para o anticorpo anti-humano de Cytokeratin-18 (CK18). O HIV-1 causando uma depleção de hepatócitos CK18+ é evidenciado por uma área menos ocupada pelas células humanas CK18+ . Os resultados aqui representados são de um rato não infectado e um infectado pelo VIH transplantado com hepatócitos humanos duplos e HSPCs. barras de escala = 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Relação das pilhas de CD4+ às pilhas de T CD8+ no sangue periférico e no fígado de ratos não infectados e HIV-1-infectados reconstituídos duplos. Para camundongos não infectados reconstituídos duplos: círculo fechado; HEPs + HSPCs; sangue n = 7; fígado n = 6. Para camundongos infectados pelo HIV-1: círculos abertos; HEPs + HSPCs + HIV; sangue n = 10; fígado n = 11. Os resultados representam a mediana, bem como os valores individuais. * P < 0, 5, por teste de ANOVA de sentido único entre camundongos infectados pelo HIV e não infectados. Este número foi modificado de Dagur et al.8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O fígado está comprometido e danificado em pacientes infectados pelo HIV24. Modelos experimentais de animais pequenos para o estudo de doenças hepáticas humanas na presença de HIV-1 é extremamente limitado, apesar da disponibilidade de alguns modelos animais cotransplantados com CD34+ hspcs e hepatócitos7,12, a 25. Em experimentos in vitro, os hepatócitos são mostrados para ter infecção por HIV-1 de baixo nível26. Camundongos humanizados que carregam ambos os tipos de células humanas são um modelo desejável. O fígado de camundongos reconstituídos com apenas o sistema imunológico humano demonstrou ser afetado pela infecção pelo HIV a depleção experimental de células T reguladoras humanas20,27. Entretanto, a diferença nas propriedades imunes e funcionais do rato e dos hepatócitos humanos pode sublinhar as diferenças em suas respostas ao HIV-1 e às pilhas imunes. Nesta revisão, um protocolo é descrito para reconstituir o sistema imunológico humano e o fígado e para abordar a Imunopatologia hepática associada ao HIV-1, como observado em pacientes infectados pelo HIV-1. Os ratos masculinos de TK-Nog foram selecionados devido a sua expressão elevada fígado-seletiva do mRNA do transgene de HSV-TK e a susceptibilidade da toxicidade de GCV ao fígado transgênicas21do rato. Além disso, podem ser mantidos por longos períodos após o transplante sem o uso de drogas exógenas e não desenvolvem doenças sistêmicas espontâneas28. Para estabelecer o sistema imunológico humano e a reconstituição hepática, a ablação do sistema imunológico do mouse e os danos às células hepáticas específicas do mouse são necessários e conseguidos usando doses não mieloablativas de treosulfano e GCV, como mostrado anteriormente em camundongos machos TK-NOG13 ,23. Os camundongos são injetados com GCV e treosulfan na idade de 6-8 semanas, como a expressão de transgene e ferimento hepatic GCV-induzido como avaliado por níveis de ALT são ideais, então, para fornecer pilhas humanas nicho-à-transplantadas21. Camundongos mostrando níveis de ALT de > 200 U/L, mas < 600 U/L, geralmente são selecionados para transplante. Camundongos mostrando níveis de ALT de > 600 U/L estão em maior risco de morte como hepatócitos humanos não são capazes de resgatar a função hepática do mouse danificado.
Atualmente, a humanização dupla é mostrada pelo transplante de humanos CD34+ hspcs e células hepáticas fetais; no entanto, a manipulação de animais recém-nascidos gera problemas técnicos13,14. Os HSPCs podem ser derivados ou isolados de múltiplas fontes, como células hepáticas fetais (FLCs), células-tronco embrionárias (ESCs) e CB. No entanto, as questões éticas restringem o uso de ESCs e FLCs. CB não tem tal restrição e é uma alternativa mais útil para obter HSPCs, bem como ser uma fonte preciosa de células hematopoiéticas primitivas tronco e progenitoras que podem reconstituir o imune funcional Sistema. O sangue do cordão umbilical não deve ser mais velho que um dia quando usado para isolar os HSPCs, pois o rendimento dos HSPCs é altamente afetado pela idade. A pureza dos HSPCs isolados precisa de ser verific antes de cryopreserve as pilhas. A contaminação cruzada de pilhas de T CD3+ é evitada, porque pode conduzir à doença sistemática do enxerto-contra-anfitrião do rato e ao allorejecção agudo dos Heps ao transplantar com pilhas incompatíveis.
Os hepatócitos disponíveis comercialmente foram utilizados como fonte de reconstituição hepática,8,13. Os hepatócitos adultos são preferidos para estabelecer a reconstituição hepática devido à sua maior eficiência no Engraftment e sustentabilidade por um longo período de tempo29.
A presença do sistema imunológico humano em um modelo de camundongo aumentou os níveis de Alb, como mostrado anteriormente30,31. No entanto, a eficiência dos hepatócitos e reconstituição do sistema imunológico pode variar com diferentes fontes de células doadoras e dependem do mouse receptor. Assim, cada rato precisa de ser avaliado para o Engraftment, e a parte a mais crítica é utilizar os anticorpos ou o reagente que são humano-específicos e não reage cruzada com pilhas do rato. Os reagentes e anticorpos humanos específicos utilizados no estudo aqui apresentados são detalhados na tabela de materiais. Se os anticorpos que não forem fornecidos na tabela de materiais forem utilizados para o estudo, certifique-se de verificar a especificidade humana.
A condição óptima seria a transplantação de pilhas syngeneic; no entanto, isso é tecnicamente difícil de alcançar. Sempre que possível, os hspcs e os hepatócitos devem ser agrupados dos doadores com os antígenos humanos parcialmente combinados da classe-1 da leucócito (como HLA-a2).
Para a tela de camundongos para estudos de HIV, o sangue é desenhado em vários pontos de tempo para determinar a reconstituição imune e hepática ideal; a citometria do fluxo e o ELISA são preferidos porque podem ser executados com somente uma pequena quantidade de sangue. As células sanguíneas e o soro da mesma amostra podem ser utilizados para citometria de fluxo e ELISA, respectivamente. É importante fazer diluições apropriadas de soro em cada ponto de tempo (1.000-40.000 intervalo) para avaliar os níveis de ALB de modo que as concentrações desconhecidas podem ser trazidas dentro da gama de concentrações padrão (gama de kits: 6,25-400 ng/mL).
As citocinas pró-inflamatórias em resposta à infecção pelo HIV-1 na presença do sistema imunológico humano também podem ser úteis para abordar a interação de hepatócitos e células imunes. O modelo é útil para mostrar a imunopatogênese da doença hepática induzida pelo HIV-1, uma vez que recapitula os danos hepáticos da mesma maneira que nos seres humanos, evidenciado por uma baixa proporção de CD4: CD8, uma diminuição nos níveis de ALB, morte de hepatócitos humanos e fígado imune Ativação. O modelo também tem algumas limitações, como um baixo nível de atividade das células T citotóxicas e troca de classe de imunoglobulina prejudicada. Devido à presença do sistema imunológico humano e do fígado, o modelo aqui apresentado é promissor para as coinfecções de Studi de HIV-1 e vírus da hepatite, infecção crônica da hepatite (para esclarecer os mecanismos da resposta imune antihepatite), e como uma cirrose Modelo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde conceder R24OD018546 (para L.Y.P. e SG). Os autores gostariam de agradecer a Weizhe li, Ph.D., pela ajuda em procedimentos cirúrgicos, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng para imunohistologia, membros da unidade de pesquisa de citometria de fluxo da UNMC diretor Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., e Samantha Wall, B.S., UNMC avançada microscopia membros do núcleo da instalação Janice A. Taylor, B.S., e James R. talaska, B.S., para o apoio técnico. Os autores reconhecem os Drs. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu da CIEA por fornecerem camundongos TK-NOG e o Dr. Joachim Baumgart por fornecerem treosulfan. Os autores agradecem ao Dr. Adrian Koesters, UNMC, por sua contribuição editorial para o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
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