Summary
Denne protokollen gir en pålitelig metode for å etablere humanisert mus med både humant immunsystem og leverceller. Dual rekonstituert immunodeficient mus oppnådd via intrasplenic injeksjon av menneskelig HEPATOCYTTER og CD34+ blodkreft stamceller er mottakelige for humant immunsviktvirus-1 infeksjon og recapitulate leverskader som observert i HIV-infiserte pasienter.
Abstract
Til tross for økt levealder for pasienter smittet med humant immunsviktvirus-1 (HIV-1), leversykdom har dukket opp som en vanlig årsak til sykelighet deres. Leveren immunopathology forårsaket av HIV-1 er fortsatt unnvikende. Små xenograft dyremodeller med humant hepatocytter og humant immunsystem kan recapitulate menneskets biologi av sykdoms patogenesen. Heri, en protokoll er beskrevet for å etablere en dual humanisert musemodell gjennom menneskelige hepatocytter og CD34+ blodkreft stem/stamceller (HSPCs) transplantasjon, for å studere leveren immunopathology som OBSERVERT i HIV-infiserte pasienter. For å oppnå dobbel rekonstituering, mannlig TK-NOG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (alb-tk) 7-2/ShiJic) mus er intraperitonealt injisert med ganciklovir (GCV) doser for å eliminere mus transgene leverceller, og med treosulfan for nonmyeloablative condition, som begge lette menneskelig hepatocytter (HEP) engraftment og menneskets immunsystem (HIS) utvikling. Humant albumin (ALB) nivåer er evaluert for leveren engraftment, og tilstedeværelsen av menneskelige immunceller i blodet oppdaget av Flow flowcytometri bekrefter etablering av menneskets immunsystem. Modellen utviklet ved hjelp av protokollen beskrevet her ligner flere komponenter av leverskader fra HIV-1-smitte. Dens etablering kan vise seg å være avgjørende for studier av hepatitt virus co-smitte og for evaluering av antivirale og antiretroviral narkotika.
Introduction
Siden ankomsten av antiretroviral behandling, har det vært en betydelig nedgang i dødsfall knyttet til HIV-1 monoinfection. Men, leversykdom har dukket opp som en vanlig årsak til sykelighet i HIV-infiserte pasienter1,2. Coinfections av hepatitt virus med HIV-1 infeksjon er mer vanlig, sto for 10%-30% av HIV-smittede personer i USA3,4,5.
Verten-spesifisitet av HIV-1 og hepatitt virus begrenser nytten av små dyremodeller å studere menneskelig-spesifikke smittsomme sykdommer eller å undersøke flere aspekter av HIV-1-assosiert leveren patogenesen. Immunodeficient mus som tillater engraftment av menneskelige celler og/eller vev (kalt humanisert mus modeller) er akseptable dyremodeller for prekliniske studier6,7,8. Siden innføringen av humanisert mus tidlig på 2000-tallet, flere prekliniske studier av kolestatisk Human leveren toksisitet, Human-spesifikke patogener, inkludert HIV-1 og HIV-assosiert nevrokognitive lidelser, Epstein Barr virus, hepatitt, og andre smittsomme sykdommer, har blitt undersøkt i disse musene6,9,10,11. Flere musemodeller for CD34+ HSPCs og/eller menneskelig hepatocytter transplantasjon har lenge vært utviklet og har bedret seg over tid for å studere sykdommen patogenesen av hepatitt B-viruset (HBV)-assosiert leversykdom12, 13 på alle , 14. flere modeller for HSPC og menneskelig HEPATOCYTTER (HEP) transplantasjon er basert på stammer, kjent som NOG (Nod. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (nikk. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/J)12, og Fah-/- Nod rag1-/- il2rγnull mus16. Imidlertid har hver modell sine egne fordeler og begrensninger; for eksempel, AFC8 dual humanisert mus for HEPs og humane stamceller (HSCs) på en Balb/C-Rag2-/- γc-/- bakgrunn muliggjør vellykket engraftment av immunceller og HSCs, men det er et fravær av et antigen-spesifikke T-og B-celle respons i denne modellen12. De største bekymringene i rekonstituering av doble humanisert mus inkluderer suboptimal engraftment, mangel på egnede modeller for å støtte ulike vev, feilaktige forhold, immun avvisning, eller pode-versus-host sykdom (GVHD), og teknisk vanskeligheter, slik som risikabelt manipulasjoner med nyfødte og høy dødelighet på grunn av metabolsk unormalt13.
Selv om humanisert mus har blitt brukt til HIV-forskning i mange år17,18,19, har bruk av humanisert mus for å studere leverskader forårsaket av HIV-1 er begrenset20. Vi har tidligere rapportert etablering av en dobbel humanisert TK-NOG mus modell og dens anvendelse i HIV-assosiert leversykdom8. Denne modellen viser den robuste engraftment av lever og immunceller og viser HIV-smitte patogenesen. Denne diskusjonen presenterer en detaljert protokoll, inkludert de mest kritiske trinnene i transplantasjon av menneskelig hepatocytter. En beskrivelse av HSPCs som kreves for en vellykket engraftment av HEPs og etablering av et funksjonelt immunsystem i TK-NOG mus er også presentert. Bruken av disse musene å studere HIV-assosiert leveren immunopathogenesis er detaljert. TK-NOG mannlige mus bærer en lever-spesifikke herpes simplex virus type 1 tymidin kinase (HSV-TK) transgene brukes. Mus leverceller uttrykker denne transgene kan lett bli ablated etter en kort eksponering for en nontoxic dose av GCV. Transplantert menneskelige leverceller er stabilt opprettholdt i musen leveren uten eksogene narkotika21. Musene er også preconditioned med nonmyeloablative doser av treosulfan å skape en nisje i musen benmargen for menneskelige celler8. Immunodeficient TK-NOG mus er intrasplenically injisert med HEPs og Multipotent HSPCs. Musene overvåkes deretter regelmessig for blod og leveren rekonstituering av blod immunfenotyping og målinger av serum humant-albumin nivåer, henholdsvis. Mus med en vellykket rekonstituering på mer enn 15% for både humane immunceller og HEPs er intraperitonealt injisert med HIV-1. Effekten av HIV på leveren kan vurderes så tidlig som 4-5 uker postinfection. Det er viktig å merke seg at, fordi HIV-1 brukes, må alle nødvendige forholdsregler tas under håndtering av viruset og injisere det i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen er godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved University of Nebraska Medical Center.
Merk: Få godkjenning fra den lokale IACUC før du utfører eksperimenter på dyr.
1. behandling av navlestreng blod og isolering av Human HSPCs
- Utfør alle trinnene i protokollen under sterile forhold i laminær Flow skap.
- Ta navlestreng blod (CB) samlet i heparinisert rør og gjør volumet opp til 35 mL ved å tilsette fosfat-bufret saltvann (PBS). Lag prøven på toppen av lymfocytter skille medium (LSM) som illustrert i figur 1 og sentrifuger LSM med lagdelt CB på 400 x g for 35 min ved 4 ° c uten bremser.
Merk: fortynne blodet forsiktig og forsiktig for å unngå å blande i grensesnittet. - Fjern den øverste LSM og plasma laget nøye og overføre den hvite Buffy coat grensesnittet til et nytt rør ved hjelp av en overføring pipette.
- Resuspend Buffy coat i 30-40 mL av iskald buffer (PBS + 0,5% storfe serum albumin [BSA] + 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA]). Ved hjelp av en pipette kombinerer du 20 μL av celle suspensjonen med 20 μL av 0,4% trypan blå og pipette 10 μL av blandingen i den ytre åpningen av et av de to kamrene i et telle lysbilde og setter inn lysbildet i en automatisert celle teller for å telle cellene.
Merk: Bruk iskald buffer i alle trinn, da det bidrar til å holde cellene levedyktige. - Sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 min ved 4 ° c og aspirer supernatanten forsiktig. Deretter legger 300 μL av iskald buffer.
- Tilsett 100 μL av humant FC reseptor som blokkerer reagens og 100 μL av monoklonale mus anti-humant CD34 antistoff-bøyd mikroperler for opptil 1 x 108 celler (se tabell over materialer). Ruge i 30 min ved 4 ° c, tilsett 10 mL iskaldt buffer for å vaske cellene, og sentrifuger ved 300 x g i 10 min ved 4 ° c.
Merk: Skaler opp dette i henhold til celle nummeret hvis det finnes mer enn 1 x 108 celler. - Fjern forsiktig supernatanten, resuspend pellet i 500 til μL av buffer, og fortsett med det magnetiske skille trinnet for å berike HSPCs.
- Plasser en positiv markering LS kolonne (se tabellen av materialer) i det magnetiske aktivert celle sorteringsfelt og gi det gjennom med 3 ml buffer.
- Last prøven til LS kolonne som kan lure mikroperler bundet til menneskelig CD34 + i prøver og la den flyte under påvirkning av tyngdekraften inn i samlingen røret.
- Vask kolonnen 3x med buffer og samle eluere i samme samling rør av CD34- brøk av celler.
- Stupe kolonnen med 5 mL buffer for å eluere CD34+ celler i en ny samling tube. Gjenta prosedyren for å oppnå en renhet på > 90%.
- Tell eluert CD34+ celler ved hjelp av trypan blått fargestoff i en hemocytometer. Etter telling, sentrifuger i CD34+ cellene ved 300 x g i 5 min og kast supernatanten.
- Resuspend den CD34+ celler i 25 ΜL av PBS for en injeksjon som skal brukes umiddelbart i transplantasjon eller lagre nedfryste cellene ved en konsentrasjon av 1-2 millioner/ml i frysing medium (Roswell Park Memorial Institute medium [RPMI 1640 medium] + 50% fosterets storfe serum (FBS) + 10% dimethyl sulfoxide [DMSO]) for videre bruk i transplantasjon.
Merk: Alltid fortelle om levedyktige celler før du bruker dem i transplantasjon. - For å sjekke renheten på CD34+ eluere, ta 50 μL av suspensjonen og ruge den med 10 ΜL av PE-bøyd anti-humant CD34 antistoff i 30 min ved 4 ° c. Etter antistoff inkubasjons, vaske farget celler med PBS, resuspend dem i 100 μL av PBS, og deretter fortsette å utføre flyt flowcytometri. Legg til et ekstra rør med celler uten antistoff for å designe porten i strømnings flowcytometer.
- Etter anskaffelsen kan du analysere dataene ved å velge interesseområdet på en frem-punktdiagram (FSC) og et side punktdiagram (SSC), etterfulgt av gating for enkeltceller i tomter i FSC-området og FSC-høyde. Gate CD34-positive celler på enkeltceller i PE kanalen og SSC området tomten.
2. utarbeidelse av Human hepatocytter for transplantasjon
- Fjern embryo hepatocytter fra det flytende nitrogen, raskt Senk hetteglasset i vannbadet, og Tin for ca 90-120 s.
- Fjern hetteglass lokket og hell den tint hepatocytter inn i 50 mL konisk rør av varmet tine medium.
- Suspendere cellene ved rocking 50 mL røret for hånd i noen sekunder.
Merk: Ikke Vortex røret. - Pellet cellene ved 100 x g i 8 min ved romtemperatur. Vask de pelleted cellene i PBS med 0,1% BSA og basseng dem med enten fersk eller tint HSPCs (ratio 10:1) i PBS i et endelig volum på 80 μL/mus.
3. Animal handling, screening, genotyperingteknologi, og behandling for Human HSPC og hepatocytter transplantasjon
- Håndtering av dyr
- Som et resultat av alvorlig immunsvikt, rase, hus, og håndtere TK-NOG mus under aseptisk forhold.
- Bruk alltid en lab frakk, hansker, sko deksler, og en ansiktsmaske for å hindre smitte med potensielt patogene mikroorganismer.
- Bruk sterile hansker og instrumenter for kirurgi og håndtere dyrene aseptisk gjennom hele operasjonen.
- Velge TK-NOG mus for eksperimentet
- Oppretthold TK-NOG stamme koloni ved avl kvinnelige TK-NOG mus med mannlige ikke-TK-NOG littermates og velg transgene avkom av genotyperingteknologi.
Merk: Utføre genotyperingteknologi (se trinn 3,3) for å bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av transgene i nyfødte mannlige og kvinnelige mus på tidspunktet for avvenning. - Velg menn på 6-8 ukers alder for transplantasjon på grunn av deres høye følsomhet for GCV-mediert forringelse av HSV-TK transgene-uttrykker hepatocytter21.
- Ear-tag musene på tidspunktet for avvenning eller kirurgi for å lette identifisering. Skrive ned vekt og helse status av dyrene.
- Oppretthold TK-NOG stamme koloni ved avl kvinnelige TK-NOG mus med mannlige ikke-TK-NOG littermates og velg transgene avkom av genotyperingteknologi.
- Genotyperingteknologi for tilstedeværelsen av HSV-TK-transgene ved hjelp av kvantitativ sann tids polymerase kjedere reaksjon
- Utfør genotyperingteknologi på tidspunktet for avvenning (vanligvis på 3-4 ukers alder). For genotyperingteknologi, skjære et stykke av musen øret i en laminær Flow biologiske sikkerhetskabinett for å opprettholde sterilitet og ekstrakt genomisk DNA ved hjelp av en genomisk DNA isolasjon Kit.
- Forsterk genomisk DNA utvunnet fra ørestykket i en 20 μL reaksjons blanding til skjermen for HSV-TK-transgene under kontroll av humant albumin-formidler ved å tilsette 1 μL fremover primer 5 '-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3 ', 1 μL av omvendt primer 5 '-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3 ', 0,5 μL av FAM probe 5 '-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 ', og 10 μL av Master Mix på en sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR) instrument22.
- Angi PCR-innstillingene i sanntid som følger: 60 ° c i 30 s (preread trinn), 95 ° c i 10 min (hold Stadium), 40 sykluser av 95 ° c i 15 s og 60 ° c i 1 min (PCR-etappe), og 60 ° c i 30 s (postread-stadiet).
Merk: En syklus av terskel (CT) under 22 anses positivt for HSV-TK transgene.
- Behandling ved hjelp av ganciklovir og treosulfan
- Bruk 27 G nål, Injiser TK-NOG mus med intraperitoneal GCV injeksjoner (6 mg/kg) 2x en dag på dag 7 og ved dag 5 i 100 μL av saltvann før kirurgi for å tømme musene transgene parenkymatøs celler (som vist i eksperimentell strategi i figur 2)23 .
- På dag 3, 2 og 1 før operasjonen, forutsetning mus med nonmyeloablative intraperitoneal doser av treosulfan (1,5 g/kg/dag) i 100 μL av saltvann, ved hjelp av en 27 G nål.
- En dag før operasjonen, trekke to til tre dråper (~ 100 μL) av blod fra submandibular vene ved pricking den med en 5 mm Lancet, og isolere serum ved sentrifugering (1 500 x g i 10 min ved 4 ° c) for alanin ALANINAMINOTRANSFERASE (alt) analysen for å vurdere degr EE av leverskader.
- Forberedelse til operasjonen
- Bruk avklipt å barbere musa ' fur omringer det innsnitt sted (til venstre av det bukhulen mur) tidligere kirurgi.
- Juster oksygenstrømmen til 1 L/min og isoflurane Flow til 3%-5% i en induksjon kammer ved hjelp av en mus anestesi maskin. Plasser en mus om gangen i induksjon kammeret for anestesi.
- Fest den ene enden av et sterilt forlengelsesrør (med en kapasitet på 550 μL av suspensjon, se tabell over materialer for spesifikasjoner) til en 30 G nål og den andre enden til en 1 ml sprøyte.
- Fyll sprøyten med suspensjonen (80 μL/mus) av sammenslåtte HEPs og HSPCs (se pkt. 2), Monter sprøyten i hakket på en repeterende doserings pipette, og Juster uttaket for å dispensere 10 μL i hvert trykk.
- Når musene er anesthetized (vanligvis etter 3-4 min), bytte isoflurane flyt til nesen kjegle og redusere isoflurane strømningshastighet til 2%-3%.
- Intrasplenic transplantasjon av menneskelig HSPCs og hepatocytter i mus
- Utfør alle operasjons trinn i et laminær strømnings kabinett under sterile forhold.
- Plasser en ren steril gardin over arbeidsflaten og skrubbe venstre side av kroppen av hver mus med 10% povidon-jod etterfulgt av 70% isopropylalkohol alkohol, før du gjør et snitt.
- Lag et lite snitt (~ 1-1,5 cm i lengde og 5 mm dyp) i huden, muskel, og peritoneum på venstre side av bukhulen med Vanna ' s type saks å gå inn i bukhulen ca 5 mm under den nedre kanten av ribbeinet buret.
- Finn milten, trekk den litt med pinsett til driftsområdet for enkel tilgang, og sett inn 30 G nålen inn i nedre pol av milten.
- Lås opp stempelet på doserings pipette og dispensere 10 μL av volumet om gangen, med en grense på 60-80 μL per milt. Trekk nålen langsomt og klem milten med ligating klipp ved hjelp av en ligation applier.
- Skyv milten tilbake i kroppen hulrom med bomull-tippet applikatorer fuktet med sterile PBS.
- Lukk muskellaget av bukveggen ved hjelp av en absorberbare Sutur avbrutt Sutur mønster (ikke kontinuerlig). Oppnå hud lukking med et avbrutt Sutur mønster ved hjelp av ikke-absorberbare sting.
- Bruk varmt vann sirkulerende pads for å beskytte mus fra nedkjøling etter operasjonen.
- Fjern ikke-absorberbare sting 10-14 dager etter operasjonen.
- Postoperativ behandling
- Når den transplanterte dyret wakens, injisere smertestillende buprenorfin (0,1 mg/kg) intraperitonealt, 2x en dag for en påfølgende 3 dager.
- Observer dyrene minst 1x om dagen til de kommer tilbake til normale fysiske forhold.
Merk: Sjekk hver dyrene ' kropp vekt, siden noe mus kanskje miste vekt postsurgery. Mus vanligvis gjenvinne sin opprinnelige vekt i 1 til 2 uker.
4. engraftment validering av Human Liver av ELISA og menneskets immun system ved Flow flowcytometri
Merk: Evaluere rekonstituering av den menneskelige lever og immunsystem månedlig, starter 1 måned posttransplantation av enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (ELISA) og flyt flowcytometri, henholdsvis.
- Samle blodprøver fra submandibular vene ved hjelp av lansetter i EDTA-rør, og sentrifuger på 1 500 x g i 10 min ved 4 ° c. Isolere serum å sjekke menneskelige albumin nivåer for å vurdere engraftment effektiviteten av musen leveren for transplanterte menneskelige hepatocytter, ved hjelp av en menneskelig albumin ELISA kvantifisering sett (se tabellen av materialer) ved å følge produsentens Instruksjoner.
Merk: Ikke kast pellet og bruke pelleted celler for en flyt flowcytometri analyse for å evaluere menneskets immunsystem rekonstituering. - Resuspend celle pellet uten serum i 35 μL av FACS buffer (PBS + 2% FBS) og beiset med 5 μL av mus-spesifikk CD45 (konsentrasjon 0,5 mg/mL), 5 μL hver av Human-spesifikke antistoffer CD45 (0,1 mg/mL), CD3 (0,2 mg/mL), CD8 (0,1 mg/mL), og CD19 (0,5 mg/mL) , og 20 μL av CD4 (0,25 mg/mL) og CD14 (0,25 mg/mL) hver for 30 min ved 4 ° c, for å sjekke utviklingen av et funksjonelt immunsystem fra CD34+ HSPCs.
Merk: Vurder å legge til en ekstra tube med unstained celler for å bestemme gating av fargede celler. - Etter inkubasjons, Overfør beiset suspensjonen (~ 100 μL) i en polystyren rundt-bunn Flow flowcytometri tube og bruk 2 mL 1x lyseringsbuffer (se tabell over materialer) ved å fortynne 1 del av 10x lyse buffer med 9 deler av destillert vann og incubating 10- 15 min. til lyse røde blodlegemer.
Merk: Observer turbiditet for å evaluere den røde blod cellelyse. Når prøven blir klar, er lyse er fullført. - Etter lyse, tilsett 3 mL av FACS buffer i røret og sentrifuger på 300 x g ved 4 ° c i 5 min å få en pellet. Gjenta vask ved å legge 3 mL FACS buffer til pellet og sentrifuge ved 300 x g ved 4 ° c i 5 min.
- Fix cellene i fersk laget 1% paraformaldehyde (PFA) og tilegne seg fargede celler på flyten flowcytometer, analysert med flyt programvare.
- For analysen, Velg lymfocytter gating på en FSC/SSC plot, etterfulgt av single-celle gating på FSC-området/FSC-høyde.
- Videre gate for menneskelig-spesifikke CD45 (hCD45) på single-celle befolkningen og inkluderer mus-spesifikke CD45 (mCD45) for utelukkelse av celler av murine opprinnelse. Strategi gating av farget befolkning basert på gating av unstained celler.
- Gate hCD45+ celler for å bestemme FREKVENSEN av CD3+ T celler og CD19+ B celler. Gate T-celler for å bestemme CD4 og CD8 delsett. For å evaluere monocytter, port på hCD45 å avgjøre CD14+ monocytter.
5. HIV-smitte av TK-NOG mus og dens effekt på Human Liver og immun system
- Håndter HIV-1-viruset og alle infiserte mus i et utpekt biosafety nivå 2-anlegg.
Forsiktig: Autoklav og forkaste alle HIV-infiserte avfall i doble Biohazard poser. Av sikkerhetsmessige grunner, bruk kuttbestandige hansker mens du leverer HIV-infiserte mus. - Bruk personlig verneutstyr (PPE), inkludert en disponibel kjeledress kappe, sko deksler, en ansiktsmaske, og dobbel hansker til enhver tid mens du arbeider med viruset.
- Velg mus med en rekonstituering på mer enn 15% av humant CD45+ Cells (testet i trinn 4,7) og med en tilstedeværelse av humant albumin i serum for HIV-1-infeksjon (testet i trinn 4,1).
- Injisere musene med 1 x 103 til 1 x 104 vev kultur smittsomme doser 50 (TCID50) HIV-1ADA i et volum på 100-200 μL per mus, intraperitonealt.
- Euthanize den HIV-infiserte mus 5 uker postinfection ved hjelp av isoflurane (med en isoflurane dampkonsentrasjon av > 5%).
- Etter euthanizing musene, samle blod i EDTA-rør av en CARDIAC punktering for isolering av serum, for å se effekten av HIV-1 på leveren ved å evaluere menneskelig spesifikke albumin nivåer av ELISA (se trinn 4,1) og blodceller for å se etter endringer i menneskets immun celler ved hjelp av Flow flowcytometri (se trinn 4,2-4,8).
Merk: Vurdere perifere viral Load 5 uker postinfection på en bioanalyzer for å bekrefte om musene er smittet. - Etter tegning blod, avgiftsdirektoratet leveren fra euthanized mus.
- For leveren forbruker, utsette bukhulen ved å lage et snitt på 1,5-2 cm lang og 0,5 cm dypt i huden, muskler, og peritoneum, fra xyphoid. Lag et kutt vinkelrett på ryggraden mellom leveren og membranen. Løft leveren og bryte noen membraner feste den til magen og tarmene.
- Samle og fikse leveren i 4% paraformaldehyde over natten og følge en standard immunhistokjemiske protokoll for å evaluere effekten av HIV på CK18+ hepatocytter ved hjelp av menneskelig spesifikke CK18 antistoff8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etableringen av en dual humanisert musemodell med menneskelige lever og immunceller kan lett overvåkes på hvert trinn med svært enkel ELISA og Flow flowcytometri, henholdsvis. Flow flowcytometri utføres regelmessig for å evaluere utviklingen av et funksjonelt immunsystem og å se effekten av HIV-smitte på immunceller. I dual humanisert mus, kan utviklingen av funksjonelle immunceller varierer fra 15% til 90% av lymfocytter porten. Representative delsett av immunceller er vist i prikken tomter (Figur 3). For evalueringen av engraftment av menneskelig hepatocytter, ELISA for Human-spesifikke albumin nivåer utføres månedlig på mus serum. Mus engrafted med både HSPCs og HEPs viser humant-spesifikke albumin nivåer fra ~ 7 μg/mL til 377 μg/mL på en måned, fortsetter å vokse over tidspunktet for observasjon (6 måneder) (Figur 4). Effekten av HIV-smitte på humane immunceller i blodet av dual humanisert mus overvåkes av Flow flowcytometri og på HEPs i leveren av menneskelig-spesifikke albumin ELISA. Ved 5 uker, HIV-1 forårsaker en nedgang i humant albumin i serum, som vurdert av ELISA, og det er en nedbryting av menneskelig CK18+ hepatocytter i leveren deler av dual humanisert mus, som evaluert av immunhistokjemi (figur 5). En lavere ratio av CD4: CD8 er vanligvis observert, ved Flow flowcytometri, i blod og lever av HIV-infiserte mus, sammenlignet med nivåer notert i samme mus før infeksjon (figur 6). Alle reagenser og materialer som er viktige for protokollen, drøftes i materialfortegnelsen.
Figur 1 : Skjematisk av berikelse av CD34+ celler fra ledningen blod. (A) ledningen blod er lagdelt på lymfocytter separasjon medium (LSM) og sentrifugert å isolere Buffy coat. (B) ls kolonner er plassert på et magnetisk stativ og SKYLLES med BSA buffer, etterfulgt av å legge Buffy coat. Celler positive for CD34 er fanget i kolonnene, og CD34- celler er eluert i separate rør. Fanget CD34+ celler i kolonnen harpiks er styrtet med et stempel, og cellene er samlet i et nytt rør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Skjematisk visning av eksperimentell design for den doble rekonstituering av humanisert lever-og immunsystem mus, etterfulgt av HIV-1-smitte. TK-NOG mus injiseres med ganciklovir (GCV) i en dose på 6 mg/kg, 2x daglig, på dag-7 og dag-5, etterfulgt av en treosulfan injeksjon på dager-3,-2 og-1. Til skjermen musene for transplantasjon (TX), en alanin alaninaminotransferase (ALT) analysen er utført en dag før operasjonen, og mus med ALT nivåer av > 200 og < 600 U/L er valgt. Etter transplantasjon, er musene sjekket for en rekonstituering av menneskets immunsystem ved Flow flowcytometri (FACS) og for leveren rekonstituering ved å vurdere deres albumin nivå ved hjelp av ELISA. Musene er smittet med HIV-1 5 uker før de blir ofret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Flow flowcytometri analyse gating strategi for den menneskelige celle distribusjon av blod. (A) først, lymfocytter er gated på hele blod basert på FSC-a og SSC-a. (B) enkeltceller er gated på lymfocytter. (C) Human CD45+ leukocytter er gated på enkeltceller ved hjelp av MUSEN CD45 og menneskelig CD45. (D) CD3+ T celler og CD19+ B celler er identifisert på gated CD45+ menneskelige leukocytter. (E) CD4+ t hjelper celler og CD8+ cytotoksisk T celler er identifisert i gated CD3+ t celler. (F) CD14+ monocytter er inngjerdet fra humant CD45+ leukocytter. Resultatene representert her er fra en mus transplantert med dual Human hepatocytter og HSPCs. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Albumin konsentrasjon måles ved Elisa i serum av dual humanisert mus. Musene er transplantert med både menneskelige hepatocytter (HEPs) og CD34+ blodkreft stem/stamceller (HSPCs) (n = 11). Serum samles til forskjellige tider ved 1, 4 og 6 måneders posttransplantation, og fortynninger er laget for å justere de ukjente prøve konsentrasjonene i de ulike standardene. Hvert symbol representerer en individuell muse verdi. Resultatene representerer medianen, samt individuelle verdier. * P < 0,05, med enveis Anova. Dette tallet er blitt modifisert fra Dagur et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Effekt på HIV-1 på albumin nivåer i serum og forringelse av CK18+ humant hepatocytter i leveren av dual humanisert mus. (A) albumin konsentrasjoner overvåkes i infisert mus (n = 9) transplantert med både menneskelige heps og HSPCs på 1 og 4 måneder. Musene er smittet (n = 10) med HIV på 4-5 måneder posttransplantation og ofret 5 uker postinfection. Hvert symbol representerer en individuell muse verdi. Resultatene representerer medianen, samt individuelle verdier. * P < 0,05, med enveis Anova. Dette tallet har blitt modifisert fra Dagur et al. 8. (B) Five-mikron lever seksjoner fra infisert (heps + HSPCs, venstre panel) og HIV-infiserte tk-NOG mus (HEPS + HSPCs + HIV, høyre panel) er fast, parafin embedded, og beiset for anti-menneskelige cytokeratin (CK18) antistoff. HIV-1 forårsaker en reduksjon av CK18+ hepatocytter er dokumentert av et mindre okkupert område av CK18+ menneskelige celler. Resultatene som er representert her er fra en infisert og en HIV-smittet mus transplantert med dual Human hepatocytter og HSPCs. skala bars = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Ratio av CD4+ celler til CD8+ T celler i perifert blod og i leveren av dobbelt rekonstituert infisert og HIV-1-infiserte mus. For dobbelt rekonstituert infisert mus: lukket sirkel; HEPs + HSPCs; blod n = 7; leveren n = 6. For HIV-1 infiserte mus: åpne sirkler; HEPs + HSPCs + HIV; blod n = 10; leveren n = 11. Resultatene representerer medianen, samt individuelle verdier. * P < 0,05, ved enveis Anova test mellom HIV-infiserte og friske mus. Dette tallet er blitt modifisert fra Dagur et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leveren er kompromittert og skadet i HIV-infiserte pasienter24. Eksperimentelle små dyremodeller for å studere Human leversykdommer i nærvær av HIV-1 er svært begrenset, til tross for tilgjengeligheten av et par cotransplanted dyr modeller med CD34+ HSPCs og hepatocytter7,12, 25på. I in vitro eksperimenter, hepatocytter er vist å ha lavt nivå HIV-1 infeksjon26. Humanisert mus som bærer begge typer menneskelige celler er en ønskelig modell. Leveren av mus tilberedt med bare menneskets immunsystem har vist å være påvirket av HIV-smitte under eksperimentell reduksjon av menneskelig regulering T celler20,27. Imidlertid kan forskjellen i uimottakelig og funksjonelle egenskaper av mus og menneskelig hepatocytter understreke forskjellene i deres svar på HIV-1 og immunceller. I denne gjennomgangen er en protokoll beskrevet for å Rekonstituer både menneskets immunsystem og lever og å ta opp HIV-1-assosiert leveren immunopathology, som observert i HIV-1-infiserte pasienter. TK-NOG mannlige mus ble valgt på grunn av deres lever-selektiv høy mRNA uttrykk for HSV-TK transgene og mottakelighet for GCV toksisitet til mus transgene leveren21. Videre kan de opprettholdes i lange perioder etter transplantasjon uten bruk av eksogene narkotika og ikke utvikle spontane systemiske sykdommer28. Å etablere menneskelige immunsystem og leveren rekonstituering, ablasjon av musen immunsystemet og skade på mus-spesifikke leverceller er nødvendig og oppnådd ved hjelp av nonmyeloablative doser av treosulfan og GCV, som vist tidligere i TK-NOG mannlige mus13 ,23. Mus injiseres med GCV og treosulfan i en alder av 6-8 uker, som uttrykk for transgene og GCV-indusert leverskader som vurdert av ALT nivåer er optimale, da, for å gi nisje-til-transplanterte menneskelige celler21. Mus som viser ALT-nivåer på > 200 U/L, men < 600 U/L, er vanligvis valgt for transplantasjon. Mus som viser ALT nivåer av > 600 U/L er på en større risiko for død som menneskelige hepatocytter er ikke i stand til å redde den skadede musen leveren funksjon.
Foreløpig er dual menneskeliggjøring vist ved transplantasjon av menneskelig CD34+ HSPCs og fosterets leverceller; imidlertid skaper manipulering av nyfødte dyr tekniske problemer13,14. HSPCs kan utledes eller isoleres fra flere kilder, for eksempel Foster leverceller (FLCs), embryonale stamceller (ESCs), og CB. Men etiske problemstillinger begrense bruken av ESCs og FLCs. CB har ingen slik begrensning og er et mest nyttig alternativ for å få HSPCs, samt å være en dyrebar kilde til primitive blodkreft stem og stamceller som kan Rekonstituer den funksjonelle immunforsvaret System. Cord blod bør ikke være eldre enn en dag når den brukes til å isolere HSPCs, som avkastningen av HSPCs er svært påvirket av alder. Renheten av den isolerte HSPCs må kontrolleres før cryopreserving cellene. Krysskontaminering av CD3+ T celler unngås, da det kan føre til systemisk mus pode-versus-host sykdom og akutt allorejection av heps mens transplantere med feilaktige celler.
Kommersielt tilgjengelige hepatocytter ble brukt som kilde for leveren rekonstituering8,13. Voksen hepatocytter foretrekkes for å etablere leveren rekonstituering på grunn av deres økt effektivitet i engraftment og bærekraft i lang tid29.
Tilstedeværelsen av menneskets immunsystem i en mus modell økte alb nivåer, som vist tidligere30,31. Imidlertid kan effektiviteten av hepatocytter og immunsystemet rekonstituering variere med ulike kilder til donor celler og avhenger av mottakerens mus. Så hver mus må vurderes for engraftment, og den mest kritiske delen er å utnytte antistoffer eller reagens som er menneskelig-spesifikke og ikke kryss-reagere med muse celler. Den menneskelige-spesifikke reagenser og antistoffer som brukes i studien presenteres her er beskrevet i tabellen av materialer. Hvis antistoffer annet enn gitt i tabellen av materialer brukes til studien, må du kontrollere for den menneskelige spesifisitet.
Den optimale tilstanden ville være transplantasjon av syngeneic celler; Det er imidlertid teknisk vanskelig å oppnå. Der det er mulig, bør HSPCs og hepatocytter samles fra givere med delvis matchet Human leukocytter klasse-1 antigener (som HLA-a2).
Til skjerm mus for HIV-studier, blod trekkes på flere tidspunkt punkter for å bestemme den optimale immun-og leveren rekonstituering; Flow flowcytometri og ELISA er foretrukket som de kan utføres med bare en liten mengde blod. Blodceller og serum fra samme prøve kan brukes til strømnings flowcytometri og ELISA, henholdsvis. Det er viktig å gjøre riktig fortynninger av serum på hvert tidspunkt (1 000-40 000 rekkevidde) for å evaluere ALB-nivåene, slik at de ukjente konsentrasjonene kan bringes innenfor rekkevidden av standard konsentrasjoner (sett område: 6,25-400 ng/mL).
Proinflammatoriske cytokiner som svar på HIV-1 infeksjon i nærvær av menneskets immunsystem kan også være nyttig i adressering samspillet mellom hepatocytter og immunceller. Modellen er nyttig for å vise immunopathogenesis av HIV-1-indusert leversykdom, gitt at det viser leverskader på samme måte som hos mennesker, dokumentert ved en lav ratio av CD4: CD8, en nedgang i ALB nivåer, menneskelig hepatocytter død, og lever immune Aktivisering. Modellen har også noen begrensninger, for eksempel et lavt nivå av cytotoksisk T celler aktivitet og svekket immunglobulin klasse veksling. På grunn av tilstedeværelsen av både menneskelig immunsystem og lever, modellen som presenteres her er lovende for Studi coinfections av HIV-1 og hepatitt virus, kronisk hepatitt infeksjon (for å avklare mekanismer av anti-hepatitt immunrespons), og som en skrumplever Modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health Grant R24OD018546 (til L.Y.P. og S.G.). Forfatterne vil gjerne takke Weizhe Li, Ph.D., for hjelp i kirurgiske prosedyrer, Amanda Branch Woods, BS, Yan Cheng for immunohistology, UNMC flyt flowcytometri forskningsanlegg medlemmer direktør Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, BS, og Samantha Wall, B.S., UNMC avanserte mikroskopi Core Facility medlemmer Janice A. Taylor, BS, og James R. Talaska, BS, for teknisk støtte. Forfatterne erkjenner DRS. Mamoru Ito og Hiroshi Suemizu fra CIEA for å gi TK-NOG mus og Dr. Joachim Baumgart for å gi treosulfan. Forfatterne takker Dr. Adrian Koesters, UNMC, for hennes redaksjonelle bidrag til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
