Summary
Detta protokoll ger en tillförlitlig metod för att etablera humaniserade möss med både människans immunsystem och leverceller. Dubbla, rekonstituerade, immunotillräckliga möss som erhålls via intrasplenic injektion av humana hepatocyter och CD34+ hematopoietiska stamceller är mottagliga för humant immunbristvirus-1 infektion och recapitulate leverskada som observerats i HIV-infekterade patienter.
Abstract
Trots den ökade livslängden hos patienter infekterade med humant immunbristvirus-1 (HIV-1), leversjukdom har uppstått som en vanlig orsak till deras sjuklighet. Levern immunopatologi orsakad av HIV-1 förblir svårfångade. Små xenograft djurmodeller med mänskliga hepatocyter och humant immunförsvar kan recapitulate människans biologi av sjukdomens patogenes. Häri, ett protokoll beskrivs för att etablera en dubbel humaniserad musmodell genom mänskliga hepatocyter och CD34+ hematopoietiska Stem/progenitorceller (HSPCs) transplantation, att studera leverimmunopatologi som OBSERVERATS hos hiv-infekterade patienter. För att uppnå dubbel beredning, manliga TK-NOG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (ALB-tk) 7-2/shijic) möss injiceras intraperitonealt med ganciklovir (GCV) doser för att eliminera mus transgena leverceller, och med treosulfläkt för nonmyeloablativ konditionering, som båda underlätta humana hepatocyte (HEP) inympningoch människans immunsystem (hans) utveckling. Humant albumin (ALB) nivåer utvärderas för levertransplantation, och närvaron av mänskliga immunceller i blodet upptäcks av flödescytometri bekräftar inrättandet av människans immunsystem. Den modell som utvecklats med hjälp av det protokoll som beskrivs här liknar flera komponenter av leverskador från HIV-1-infektion. Dess etablering kan visa sig vara avgörande för studier av samtidig hepatitvirus-infektion och för utvärdering av antivirala och antiretrovirala läkemedel.
Introduction
Sedan tillkomsten av antiretroviral terapi, det har skett en betydande minskning av dödsfall i samband med HIV-1-monoinfektion. Emellertid, leversjukdom har uppstått som en vanlig orsak till sjuklighet hos hiv-infekterade patienter1,2. Infektioner av hepatitvirus med hiv-1-infektion är vanligare, står för 10%-30% av hiv-infekterade personer i USA3,4,5.
Värd-specificiteten av HIV-1 och hepatitvirus begränsar nyttan av små djurmodeller för att studera människospecifika infektionssjukdomar eller för att undersöka flera aspekter av HIV-1-associerad leverpatogenes. Möss med nedsatt immunförsvar som möjliggör en inympelse av mänskliga celler och/eller vävnader (s.k. humaniserade musmodeller) är acceptabla djurmodeller för prekliniska studier6,7,8. Sedan introduktionen av humaniserade möss i början av 2000-talet, flera prekliniska studier av kolestatisk Human levertoxicitet, Human-specifika patogener, inklusive HIV-1 och HIV-associerade neurokognitiva störningar, Epstein Barr-virus, hepatit och andra infektionssjukdomar, har undersökts i dessa möss6,9,10,11. Flera musmodeller för CD34+ hspcs och/eller Human hepatocyte transplantation har länge utvecklats och har förbättrats med tiden för att studera sjukdomens patogenes av hepatit B-virus (HBV)-associerad leversjukdom12, 13 , 14. flera modeller för HSPC och Human hepatocyte (HEP) transplantation baseras på stammar, känd som nog (nod. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (nod. CG-prkdcscid Il2rgtm1Wjl/szj)15, Balb/C-Rag2-/- c-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, och Fah-/- nod rag1-/- il2rγnull mus16. Men varje modell har sina egna fördelar och begränsningar; till exempel AFC8 dubbla humaniserade möss för heps och mänskliga stamceller (hscs) på en Balb/C-Rag2-/- c-/- bakgrund möjliggör en lyckad inympelse av immunceller och hscs, men det finns en avsaknad av en antigen-specifik T-och B-cell svar i denna modell12. Den stora oro för beredning av dubbla humaniserade möss inkluderar suboptimala engrafations, en brist på lämpliga modeller för att stödja olika vävnader, avvikande villkor, immun avvisande, eller graft-Versus-host sjukdom (GVHD), och tekniska svårigheter, såsom riskfyllda manipulationer med nyfödda och hög dödlighet på grund av metabola avvikelser13.
Även humaniserade möss har använts för hiv-forskning för många år17,18,19, användning av humaniserade möss för att studera leverskador orsakade av hiv-1 har varit begränsad20. Vi rapporterade tidigare inrättandet av en dubbel humaniserad TK-NOG musmodell och dess tillämpning i HIV-associerad leversjukdom8. Denna modell visar robust inympelse av lever och immunceller och recapitulates HIV-infektion patogenes. Denna diskussion presenterar ett detaljerat protokoll, inklusive de mest kritiska stegen i transplantation av humana hepatocyter. En beskrivning av HSPCs krävs för en lyckad inympningen av HEPs och inrättandet av ett funktionellt immunförsvar i TK-NOG möss presenteras också. Användningen av dessa möss för att studera HIV-associerad lever immunopathogenes är detaljerad. TK-nog manliga möss som transporterar en leverspecifik herpes simplex virus typ 1 tymidin Kinas (HSV-tk) transgenens används. Mus leverceller som uttrycker denna transgenens kan lätt ableras efter en kort exponering för en giftfri dos av GCV. Transplanterade humana leverceller upprätthålls stabilt inom musen levern utan EXOGEN droger21. Mössen är också konditionerade med nonmyeloablativa doser av treosulfläkt att skapa en nisch i musen benmärg för mänskliga celler8. Immunobristfällig TK-NOG möss är intrasplenically injiceras med HEPs och multipotenta HSPCs. Mössen övervakas sedan regelbundet för blod-och lever beredning genom immunophenotypning av blod och mätningar av Human-albuminnivåer i serum. Möss med en lyckad beredning av mer än 15% för både humana immunceller och HEPs är intraperitonealt injiceras med HIV-1. Effekten av HIV på levern kan bedömas så tidigt som 4-5 veckor efter infektion. Det är viktigt att notera att, eftersom HIV-1 används, alla nödvändiga försiktighetsåtgärder måste vidtas vid hantering av viruset och injicera det i möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Nebraska Medical Center.
Anmärkning: Inhämta godkännande från den lokala IACUC innan djurförsök utförs.
1. behandling av navelsträngsblod och isolering av mänskliga HSPCs
- Utför alla steg i protokollet under sterila förhållanden i laminärt flödes skåp.
- Ta navelsträngsblod (CB) samlas i hepariniserad rör och göra volymen upp till 35 ml genom att tillsätta fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Lager provet ovanpå det lymfocyter separations mediet (LSM) som illustreras i figur 1 och centrifugera lsm med lager CB vid 400 x g för 35 min vid 4 ° c utan bromsar.
Obs: Späd blodet försiktigt och försiktigt för att undvika att blanda i gränssnittet. - Ta försiktigt bort det översta LSM-och plasma skiktet och överför det vita Buffy Coat-gränssnittet till ett nytt rör med en överföringspipett.
- Omsuspendera Buffy Coat i 30-40 mL ikylbuffert (PBS + 0,5% bovint serumalbumin [BSA] + 2 mM etylendiamintetraättiksyra [EDTA]). Kombinera 20 μL av cellsuspensionen med en pipett med 20 μL 0,4% trypan Blue och Pipettera 10 μL av blandningen i den yttre öppningen på någon av de två kamrarna i en räknebild och sätt in bilden i en automatiserad cell räknare för att räkna cellerna.
Anmärkning: Använd iskall buffert i alla steg, eftersom det hjälper till att hålla cellerna livskraftiga. - Centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 min vid 4 ° c och Aspirera supernatanten noggrant. Tillsätt sedan 300 μL ikylbuffert.
- Tillsätt 100 μL humant FC-receptorblockerande reagens och 100 μL monoklonal mus anti-human CD34-antikroppskonjugerade mikropärlor för upp till 1 x 108 celler (se tabell över material). Inkubera i 30 minuter vid 4 ° c, tillsätt 10 mL ikylbuffert för att tvätta cellerna och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid 4 ° c.
Anmärkning: Skala upp detta enligt cellnumret om det finns mer än 1 x 108 celler. - Ta försiktigt bort supernatanten, Omsuspendera pelleten i 500 μL buffert och fortsätt med det magnetiska separations steget för att berika HSPCs.
- Placera en positiv markering LS-kolumn (se tabell över material) i fältet magnetisk aktiverad cell sortering och passera den med 3 ml buffert.
- Ladda provet till LS-kolumnen som kan snärja mikrokulor bundna till Human CD34 + i prover och låta det flöda under påverkan av tyngdkraften i Samlingsröret.
- Tvätta kolonnen 3x med buffert och samla upp eluatet i samma samlingsrör av CD34- fraktionen av celler.
- Doppa kolonnen med 5 mL buffert för att eluera CD34+ -cellerna i ett nytt samlingsrör. Upprepa proceduren för att uppnå en renhet på > 90%.
- Räkna eluerade CD34+ celler med trypan blått färgämne i en hemocytometer. Efter att ha räknat, Centrifugera CD34+ cellerna vid 300 x g i 5 min och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera CD34+ -cellerna i 25 μl PBS för en injektion som ska användas omedelbart vid transplantation eller kryopreserve cellerna vid en koncentration av 1-2 miljoner/ml i frys medium (Roswell Park Memorial Institute medium [rpmi 1640 medium] + 50% foster bovint serum (FBS) + 10% dimetylsulfoxid [DMSO]) för vidare användning vid transplantation.
Anmärkning: Omräkna alltid livskraftiga celler innan de använder dem vid transplantation. - För att kontrollera renheten hos CD34+ elute, ta 50 μl av suspensionen och inkubera den med 10 μl PE-konjugerad anti-human CD34-antikropp under 30 min vid 4 ° c. Efter antikropps inkubationen, tvätta de färgade cellerna med PBS, Omsuspendera dem i 100 μL PBS, och fortsätt sedan att utföra flödescytometri. Tillsätt en extra tub med celler utan antikroppar för att designa grinden i flödescytometern.
- Efter förvärvet, analysera data genom att välja den region av intresse på en Forward scatter (FSC) och Side scatter (SSC) tomt, följt av gating för enskilda celler på FSC-området och FSC-höjd tomter. Gate CD34-positiva celler på enstaka celler i PE-kanalen och SSC-området tomt.
2. beredning av humana hepatocyter för transplantation
- Ta bort de kryopreserverade hepatocyterna från det flytande kvävet, sänk snabbt injektionsflaskan i vattenbadet och Tina för cirka 90-120 s.
- Ta bort locket till injektionsflaskan och häll de tinade hepatocyterna i 50 mL koniska röret i det värmda upptinande mediet.
- Suspendera cellerna genom att gunga 50 mL-röret för hand i några sekunder.
Anmärkning: Vortexblanda inte röret. - Pelleten cellerna vid 100 x g för 8 min vid rumstemperatur. Tvätta pelleterade celler i PBS med 0,1% BSA och pool dem med antingen färska eller tinade HSPCs (ratio 10:1) i PBS i en slutlig volym av 80 μL/mus.
3. djurhantering, screening, genotypning och behandling av Human HSPC och hepatocyte transplantation
- Djurhantering
- Som ett resultat av svår immunbrist, ras, hus, och hantera TK-NOG möss under aseptiska förhållanden.
- Använd alltid en labbrock, handskar, skoskydd och en ansiktsmask för att förhindra infektion med potentiellt patogena mikroorganismer.
- Använd sterila handskar och instrument för kirurgi och hantera djuren aseptiskt under hela operationen.
- Välja TK-NOG möss för experimentet
- Upprätthålla TK-NOG stam koloni av avel kvinnliga TK-NOG möss med manliga icke-TK-NOG littermates och välj transgena avkomma genom genotypning.
Anmärkning: Utför genotypning (se steg 3,3) för att bestämma förekomst eller frånvaro av transgenen hos nyfödda manliga och kvinnliga möss vid avvänjning. - Välj hanar vid 6-8 veckors ålder för transplantation på grund av deras höga känslighet för GCV-medierad utarmning av HSV-TK Transgene-uttrycker hepatocyter21.
- Öron-tag möss vid tidpunkten för avvänjning eller kirurgi för att underlätta identifieringen. Anteckna djurens vikt och hälsostatus.
- Upprätthålla TK-NOG stam koloni av avel kvinnliga TK-NOG möss med manliga icke-TK-NOG littermates och välj transgena avkomma genom genotypning.
- Genotypning för förekomst av HSV-tk transgenens med hjälp av kvantitativ realtid polymeras kedjereaktion
- Utför genotypning vid avvänjning (vanligtvis vid 3-4 veckors ålder). För genotypning, skär en bit av mus örat i ett laminärt flöde biologiskt säkerhetsskåp för att bibehålla sterilitet och extrahera genomisk DNA med hjälp av en genomisk DNA-isolerings sats.
- Förstärka genomiskt DNA som utvinns ur öronsnäckan i en 20 μL reaktionsblandning för att avskärma för HSV-TK transgenens under kontroll av humant albumin promotor genom att tillsätta 1 μL framåtriktad primer 5 '-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3 ', 1 μL omvänd primer 5 '-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3 ', 0,5 μL av FAM sond 5 ′-fam-aatcgcccgccggctgc-MGB-3 ', och 10 μl Master Mix på en realtid polymeras kedjereaktion (PCR) instrument22.
- Ställ in realtids PCR-inställningarna enligt följande: 60 ° c för 30 s (förinspelningsstadium), 95 ° c i 10 min (håll stadiet), 40 cykler på 95 ° c för 15 s och 60 ° c i 1 min (PCR-stadiet) och 60 ° c för 30 s (postread Stage).
Anmärkning: En cykel av tröskel (CT) under 22 anses positivt för HSV-TK Transgene.
- Behandling med ganciklovir och treosulfläkt
- Med hjälp av 27 G nål, injicera TK-NOG möss med intraperitoneala GCV injektioner (6 mg/kg) 2x en dag på dag 7 och dag 5 i 100 μL av saltlösning före operation för att tömma mössen är transgena parenkymala celler (som visas i den experimentella strategin i figur 2)23 .
- På dag 3, 2, och 1 före operationen, förutsättning möss med nonmyeloablativa intraperitoneala doser av treosulfläkt (1,5 g/kg/dag) i 100 μL av saltlösning, med en 27 G nål.
- En dag före operationen, dra två till tre droppar (~ 100 μL) av blod från submandibular ven genom att prickning den med en 5 mm Lancet, och isolera serum genom centrifugering (1 500 x g för 10 min vid 4 ° c) för alaninaminotransferas (ALAT) analys för att bedöma Degr ee av leverskada.
- Förberedelser inför operationen
- Använd Clippers för att raka musens päls som omger snitt platsen (till vänster om peritonealväggen) före operationen.
- Justera syreflödet till 1 L/min och isofluran flödet till 3%-5% i en induktions kammare med hjälp av en mus anestesi maskin. Placera en mus i taget i induktions kammaren för anestesi.
- Fäst den ena änden av ett sterilt förlängningsrör (med en håll kapacitet på 550 μL suspension; se tabellen med material för specifikationer) till en 30 G nål och den andra änden till en 1 ml spruta.
- Fyll sprutan med suspensionen (80 μL/mus) av poolade HEPs och HSPCs (se avsnitt 2), montera sprutan i skåran på en upprepad dispenseringspipett och justera dispensern för att fördela 10 μL i varje tryck.
- När mössen är sövda (vanligtvis efter 3-4 min), växla isofluran flödet till näsan konen och minska isofluran flödet till 2%-3%.
- Intrasplenic transplantation av humana HSPCs och hepatocyter hos möss
- Utför alla kirurgiska ingrepp i ett laminärt flödes skåp under sterila förhållanden.
- Placera en ren steril drapera över arbetsytan och skrubba vänster sida av kroppen av varje mus med 10% povidon-jod följt av 70% isopropylalkohol, innan du gör ett snitt.
- Gör ett litet snitt (~ 1-1,5 cm i längd och 5 mm djup) i huden, muskeln, och bukhinnan till vänster om peritonealväggen med Vanna ' s typ sax för att komma in i bukhålan cirka 5 mm under den nedre kanten av bröstkorgen.
- Lokalisera mjälten, dra den något med tång till operationsområdet för enkel åtkomst, och sätt in 30 G nål i den nedre Polen av mjälte.
- Lås upp kolven på dispenseringspipetten och fördela 10 μL av volymen i taget, med en gräns på 60-80 μL per mjälte. Dra tillbaka nålen långsamt och klipp mjälten med ligating klipp med en ligering applier.
- Tryck in mjälten tillbaka i kroppen hålighet med bomull tippade applikatorer fuktad med steril PBS.
- Stäng muskellagret i bukväggen med hjälp av en resorberbar sutur avbruten sutur mönster (inte kontinuerlig). Utför hud stängning med ett avbrutet sutur mönster med hjälp av icke-resorberbara suturer.
- Använd varmt vatten cirkulerande kuddar för att skydda möss från hypotermi efter operationen.
- Ta bort icke-resorberbara suturer 10-14 dagar efter operationen.
- Postoperativ vård
- När det transplanterade djuret vaknar, injicera smärtstillande buprenorfin (0,1 mg/kg) intraperitonealt, 2x en dag för en på varandra följande 3 dagar.
- Observera djuren minst 1x om dagen tills de återgår till normala fysiska förhållanden.
Anmärkning: Kontrollera varje djurs kroppsvikt, eftersom vissa möss kan gå ner i vikt efter operationen. Möss återfå vanligtvis sin ursprungliga vikt i 1 till 2 veckor.
4. engrafering validering av Human levern av ELISA och människans immun system genom flödescytometri
Anmärkning: Utvärdera rekonstituering av Human levern och immunsystemet varje månad, med början 1 månad efter transplantation med enzymkopplad immunosorbent assay (ELISA) och flödescytometri, respektive.
- Samla blodprov från submandibular ven med lansetter i EDTA rör, och centrifugera vid 1 500 x g i 10 min vid 4 ° c. Isolera serum för att kontrollera humana albuminnivåer för att bedöma effektiviteten hos mus levern för transplanterade humana hepatocyter, med hjälp av en humant albumin ELISA-kvantitetsuppsättning (se tabell över material) genom att följa tillverkarens Instruktioner.
Anmärkning: Kassera inte pelleten och Använd pelleterade celler för en flödescytometrianalys för att utvärdera människans immunsystem beredning. - Omsuspendera cellpelleten utan serum i 35 μL FACS-buffert (PBS + 2% FBS) och färgas med 5 μL musspecifik CD45 (koncentration 0,5 mg/mL), 5 μL var och en av humana-specifika antikroppar CD45 (0,1 mg/mL), CD3 (0,2 mg/mL), CD8 (0,1 mg/mL) och CD19 (0,5 mg/mL) , och 20 μL CD4 (0,25 mg/mL) och CD14 (0,25 mg/mL) vardera i 30 min vid 4 ° c, för att kontrollera utvecklingen av ett funktionellt immunsystem från CD34+ hspcs.
Anmärkning: Överväg att lägga till ytterligare en tub obefläckade celler för att bestämma gating av de färgade cellerna. - Efter inkubering, överför den färgade suspensionen (~ 100 μL) i en polystyren rund-botten flödescytometri röret och Använd 2 mL 1x lyseringsbuffert (se tabellen av material) genom att späda 1 del av 10X lysis buffert med 9 delar av destillerat vatten och inkuberande 10- 15 min för att lysera röda blodkroppar.
Anmärkning: Observera grumlighet för att utvärdera röda blodkroppar Lys. När provet blir klart, Lys är klar. - Efter Lys, tillsätt 3 mL av FACS buffert i röret och centrifugera vid 300 x g vid 4 ° c i 5 min för att få en pellet. Upprepa tvätten genom att tillsätta 3 mL FACS-buffert till pelleten och centrifugera vid 300 x g vid 4 ° c i 5 min.
- Fix cellerna i nytillverkat 1% PARAFORMALDEHYD (PFA) och förvärva färgade celler på flödescytometern, analyseras med Flow programvara.
- För analysen, Välj lymfocyter gating på en FSC/SSC Plot, följt av Single-cell gating på FSC-område/FSC-höjd.
- Vidare, Gate för Human-specifika CD45 (hCD45) på encelliga populationen och inkludera mus-specifika CD45 (mCD45) för uteslutning av celler av murina ursprung. Strategize gating av den färgade befolkningen baserat på gating av obefläckade celler.
- Gate hCD45+ celler för att bestämma frekvensen av CD3+ T celler och CD19+ B-celler. Gate T-celler för att bestämma CD4 och CD8 subsets. För att utvärdera monocyter, Gate på hCD45 att bestämma CD14+ monocyter.
5. HIV-infektion av TK-NOG möss och dess effekt på den mänskliga levern och immunförsvaret
- Hantera HIV-1-viruset och alla infekterade möss i en utsedd biosäkerhet nivå 2 anläggning.
Försiktighet: Autoklav och kassera alla HIV-infekterade avfall i dubbla biologiskt farliga påsar. Av säkerhetsskäl ska du använda Skärskyddshandskar när du lämnar HIV-infekterade möss. - Använd personlig skyddsutrustning (PPE), inklusive en engångsoverall klänning, skoöverdrag, en ansiktsmask och dubbla handskar hela tiden medan du arbetar med viruset.
- Välj möss med en beredning av mer än 15% av humana CD45+ -celler (testade i steg 4,7) och med en förekomst av humant albumin i serum för hiv-1-infektion (testat i steg 4,1).
- Injicera möss med 1 x 103 till 1 x 104 vävnadskulturer infektiösa doser 50 (TCID50) hiv-1ADA i en volym av 100-200 μl per mus, intraperitonealt.
- Euthanize den HIV-infekterade möss 5 veckor efter infektion med isofluran (med en isofluran ångkoncentration av > 5%).
- Efter euthanizing möss, samla in blod i EDTA rör av en hjärt punktering för isolering av serum, att se effekten av HIV-1 på levern genom att utvärdera Human-specifika albuminnivåer av ELISA (se steg 4,1) och blodkroppar för att kontrollera om förändringar i människans immun celler som använder flödescytometri (se steg 4,2-4,8).
Anmärkning: Bedöm den perifera virusbelastningen 5 veckor efter infektion på en bioanalyzer för att bekräfta om möss är infekterade. - Efter att ha ritat blod, accis levern från de euthanized möss.
- För levern excision, exponera bukhålan genom att göra ett snitt av 1,5-2 cm lång och 0,5 cm djupt i huden, muskler, och peritoneum, från xyfoid. Gör ett snittvinkel rätt mot ryggraden mellan levern och mellangärdet. Lyft levern och bryta alla membran fästa den till magen och tarmarna.
- Samla och fixera levern i 4% PARAFORMALDEHYD över natten och följ en standard immunohistokemisk protokoll för att utvärdera effekten av HIV på CK18+ hepatocyter med hjälp av Human-specifik CK18 antikropp8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inrättandet av en dubbel humaniserad musmodell med mänskliga levern och immunceller kan lätt övervakas vid varje steg med mycket enkel ELISA och flödescytometri, respektive. Flödescytometri utförs regelbundet för att utvärdera utvecklingen av ett funktionellt immunsystem och för att se effekten av HIV-infektion på immunceller. I dubbla humaniserade möss, utveckling av funktionella immunceller kan variera från 15% till 90% av lymfocytgrinden. Representativa undergrupper av immunceller visas i punktdiagram (figur 3). För utvärdering av engrafering av humana hepatocyter, ELISA för Human-specifika albuminnivåer utförs varje månad på mus serum. Möss som inympas med både HSPCs och HEPs visar humana albuminnivåer som sträcker sig från ~ 7 μg/mL till 377 μg/mL på en månad och fortsätter att växa under observationstiden (6 månader) (figur 4). Effekten av HIV-infektion på människans immunceller i blodet av dubbla humaniserade möss övervakas av flödescytometri och HEPs i levern av Human-specifika albumin ELISA. Av 5 veckor, HIV-1 orsakar en minskning av humana albuminnivåer i serum, enligt bedömning av ELISA, och det finns en utarmning av Human CK18+ hepatocyter i levern delar av dubbla humaniserade möss, som utvärderats av immunohistokemi (figur 5). Ett lägre förhållande av CD4: CD8 observeras vanligtvis, genom flödescytometri, i blodet och levern av HIV-infekterade möss, jämfört med nivåer noterade i samma mus före infektion (figur 6). Alla reagenser och material som är viktiga för protokollet diskuteras i material tabellen.
Figur 1 : Schematisk av berikningen av CD34+ celler från navelsträngsblod. (A) navelsträngsblod är skiktat på lymfocyter separation medium (LSM) och centrifugeras för att isolera Buffy Coat. (B) LS-kolonnerna placeras på ett magnetiskt stativ och sköljs med BSA-buffert, följt av tillsats av Buffy Coat. Celler positiva för CD34 är fångade i kolumnerna, och CD34- celler elueras i separata rör. Fångade CD34+ celler i kolonnen hartser är störtade med en kolv, och cellerna samlas i ett nytt rör. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Schematisk bild av experimentell design för dubbel beredning av humaniserad lever-och immunsystem möss, följt av hiv-1-infektion. TK-NOG möss injiceras med ganciklovir (GCV) vid en dos av 6 mg/kg, 2x en dag, på dag-7 och dag-5, följt av en treosulfläkt injektion på dagar-3,-2 och-1. För att avskärma möss för transplantation (TX), en alaninaminotransferas (ALAT) analys utförs en dag före operationen, och möss med ALAT-nivåer av > 200 och < 600 U/L väljs. Efter transplantation, möss kontrolleras för en beredning av människans immunsystem genom flödescytometri (FACS) och för lever beredning genom att bedöma deras albumin nivå med hjälp av ELISA. Mössen är infekterade med HIV-1 5 veckor innan de offras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Flow flödescytometrianalys analys gating strategi för människans cell distribution av blod. A) för det första är lymfocyter gated på helblod baserat på FSC-a och SSC-a. (B) enstaka celler är gated på lymfocyter. (C) Human CD45+ leukocyter är gated på enstaka celler med hjälp av mus CD45 och mänskliga CD45. DCD3+ T-celler och CD19+ B-celler identifieras på gated CD45+ humana leukocyter. (E) CD4 + t Helper celler och CD8+ cytotoxiska t-celler identifieras i gated CD3+ t celler. (F) CD14+ monocyter är gated från Human CD45+ leukocyter. De resultat som representeras här är från en mus transplanteras med dubbla humana hepatocyter och HSPCs. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Albuminkoncentrationen mäts med Elisa i serum hos dubbla humaniserade möss. Mössen transplanteras med både humana hepatocyter (HEPs) och CD34+ hematopoietiska Stem/progenitorceller (HSPCs) (n = 11). Serum samlas vid olika tidpunkter vid 1, 4 och 6 månader efter transplantation, och spädningar görs för att justera de okända provkoncentrationerna i olika standarder. Varje symbol representerar ett enskilt musvärde. Resultaten representerar medianvärdet, samt individuella värden. * P < 0,05, med enkelriktad ANOVA. Denna siffra har modifierats från Dagur et al.8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Effekt på hiv-1 på albuminnivåer i serum och utarmning av CK18+ humana hepatocyter i levern av dubbla humaniserade möss. (A) albuminkoncentrationer övervakas hos icke-infekterade möss (n = 9) som transplanterats med både humana heps och hspcs vid 1 och 4 månader. Mössen är infekterade (n = 10) med HIV vid 4-5 månader efter transplantation och offrade 5 veckor efter infektion. Varje symbol representerar ett enskilt musvärde. Resultaten representerar medianvärdet, samt individuella värden. * P < 0,05, med enkelriktad ANOVA. Denna siffra har modifierats från Dagur et al. 8. (B) fem micron lever sektioner från icke-infekterade (heps + hspcs, vänster panel) och hiv-infekterade TK-nog möss (heps + hspcs + hiv, höger panel) är fasta, paraffin inbäddade, och färgade för anti-human cytokeratin-18 (CK18) antikropp. HIV-1 orsakar en utarmning av CK18+ hepatocyter framgår av ett mindre ockuperat område av CK18+ mänskliga celler. De resultat som representeras här är från en oinfekterade och en HIV-infekterade mus transplanteras med dubbla mänskliga hepatocyter och HSPCs. skala staplar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Förhållandet mellan CD4+ celler och CD8+ T-celler i perifert blod och i levern av dubbla upplösta oinfekterade och hiv-1-infekterade möss. För dubbla rekonstituerade oinfekterade möss: sluten cirkel; HEPs + HSPCs; blod n = 7; lever n = 6. För HIV-1-infekterade möss: öppna cirklar; HEPs + HSPCs + HIV; blod n = 10; lever n = 11. Resultaten representerar medianvärdet, samt individuella värden. * P < 0,05, genom enkelriktad ANOVA-test mellan hiv-infekterade och icke-infekterade möss. Denna siffra har modifierats från Dagur et al.8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levern äventyras och skadas hos HIV-infekterade patienter24. Experimentella små djurmodeller för att studera mänskliga leversjukdomar i närvaro av HIV-1 är extremt begränsad, trots tillgängligheten av några cotransplanted djurmodeller med CD34+ hspcs och hepatocyter7,12, 25. I in vitro-experiment, hepatocyter visas ha låg nivå HIV-1-infektion26. Humaniserade möss som bär båda typerna av mänskliga celler är en önskvärd modell. Levern av möss som rekonstituerats med endast humant immunsystem har visat sig påverkas av hiv-infektion under experimentell utarmning av mänskliga reglerande T-celler20,27. Emellertid, skillnaden i immun och funktionella egenskaper hos mus och mänskliga hepatocyter kan understryka skillnaderna i deras svar på HIV-1 och immunceller. I denna översyn, ett protokoll beskrivs för att rekonstruera både människans immunsystem och levern och att ta itu med HIV-1-associerad lever immunopatologi, som observerats hos HIV-1-infekterade patienter. TK-NOG manliga möss valdes på grund av deras lever-selektiva höga mRNA uttryck för HSV-TK transgenens och känsligheten för GCV toxicitet för mus transgena levern21. Dessutom kan de bibehållas under långa perioder efter transplantation utan användning av exogena läkemedel och utvecklar inte spontana systemiska sjukdomar28. För att fastställa människans immunsystem och lever beredning, ablation av mus immunsystemet och skador på mus-specifika leverceller krävs och uppnås med hjälp av nonmyeloablative doser av treosulfläkt och GCV, som visas tidigare i TK-NOG manliga möss13 ,23. Möss injiceras med GCV och treosulfläkt vid en ålder av 6-8 veckor, eftersom uttrycket av transgenens och GCV-inducerad leverskada enligt bedömning av ALAT-nivåer är optimala, då, för att tillhandahålla nisch-till-transplanterade mänskliga celler21. Möss som visar ALAT-nivåer på > 200 U/L, men < 600 U/L, väljs vanligen för transplantation. Möss som visar ALAT-nivåer av > 600 U/L har en större risk för dödsfall eftersom humana hepatocyter inte kan rädda den skadade mus leverfunktionen.
För närvarande, dubbla humanisering visas genom transplantation av Human CD34+ hspcs och foster leverceller; manipulationen av nyfödda djur skapar dock tekniska problem13,14. HSPCs kan härledas eller isoleras från flera källor, såsom foster leverceller (FLCs), embryonala stamceller (ESCs), och CB. Men etiska frågor begränsa användningen av ESCs och FLCs. CB har ingen sådan begränsning och är ett mycket användbart alternativ för att få HSPCs, samt vara en värdefull källa till primitiva hematopoietiska stamceller och stamceller som kan Rekonstituera den funktionella immun System. Navelsträngsblod bör inte vara äldre än en dag när den används för att isolera HSPCs, eftersom avkastningen av HSPCs är mycket drabbade av ålder. Renheten hos de isolerade HSPCs måste kontrolleras före kryopreservering av cellerna. Korskontaminering av CD3+ T celler undviks, eftersom det kan leda till systemisk mus graft-Versus-host sjukdom och akut Allorejection av heps medan transplantation med inkompatibla celler.
Kommersiellt tillgängliga hepatocyter användes som källa för beredning av levern8,13. Vuxna hepatocyter är att föredra för att etablera levern beredning på grund av deras ökad effektivitet i engrafering och hållbarhet under en lång tid29.
Närvaron av människans immunsystem i en musmodell ökade ALB nivåer, som visas tidigare30,31. Emellertid, effektiviteten av hepatocyter och immunsystemet beredning kan variera med olika källor av givar celler och beror på mottagaren musen. Så, varje mus måste bedömas för inympelse, och den mest kritiska delen är att använda antikroppar eller reagens som är mänskliga-specifika och inte korsreagerar med musceller. De Human-specifika reagenser och antikroppar som används i studien presenteras här beskrivs i tabellen av material. Om andra antikroppar än de som anges i tabellen av material används för studien, se till att kontrollera om människans specificitet.
Det optimala tillståndet skulle vara transplantation av uterustransplantat celler; Det är dock tekniskt svårt att uppnå. Där så är möjligt bör HSPCs och hepatocyter poolas från donatorer med delvis matchade humana leukocyt klass 1-antigener (som HLA-a2).
För att Screen möss för HIV-studier, blod dras vid flera tidpunkter för att bestämma den optimala immun-och levern beredning; flödescytometri och ELISA är att föredra eftersom de kan utföras med endast en liten mängd blod. Blodkroppar och serum från samma prov kan användas för flödescytometri respektive ELISA. Det är viktigt att göra riktiga utspädningar av serum vid varje tidpunkt (1 000-40 000 intervall) för att utvärdera ALB nivåer så att de okända koncentrationerna kan föras inom intervallet av standardkoncentrationer (kit område: 6,25-400 ng/mL).
Proinflammatoriska cytokiner som svar på HIV-1 infektion i närvaro av människans immunsystem kan också vara till nytta för att ta itu med samspelet mellan hepatocyter och immunceller. Modellen är användbar för att Visa immunopathogenes av HIV-1-inducerad leversjukdom, med tanke på att det recapitulates leverskada på samma sätt som hos människor, framgår av ett lågt förhållande av CD4: CD8, en minskning av ALB nivåer, mänskliga hepatocyte död, och lever immun Aktiveringen. Modellen har också vissa begränsningar, såsom en låg nivå av cytotoxiska T-celler aktivitet och nedsatt immunglobulin klass växling. På grund av närvaron av både humant immunförsvar och lever, den modell som presenteras här är lovande för Studi coinfektionerna av HIV-1 och hepatitvirus, kronisk hepatit infektion (för att klargöra mekanismerna för anti-hepatit immunsvar), och som en cirros Modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Health Grant R24OD018546 (till L.Y.P. och S.G.). Författarna vill tacka Weizhe Li, Ph.D., för hjälpen i kirurgiska ingrepp, Amanda Branch Woods, BS, Yan Cheng för immunohistology, UNMC Flow flödescytometrianalys forskningsanläggning medlemmar regissören Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, BS, och Samantha Wall, BS, UNMC avancerad mikroskopi Core facility medlemmar Janice A. Taylor, BS, och James R. Talaska, BS, för teknisk support. Författarna erkänner DRS. Mamoru Ito och Hiroshi Suemizu från CIEA för att tillhandahålla TK-NOG möss och Dr Joachim Baumgart för att ge treosulfläkt. Författarna tackar Dr Adrian Koesters, UNMC, för hennes redaktionella bidrag till manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
