Summary
Denne protokol giver en pålidelig metode til at etablere humaniserede mus med både menneskelige immunsystem og leverceller. Dual rekonstitueret immundefekt mus opnået via intrasplenisk injektion af humane hepatocytter og CD34+ hæmatopoietiske stamceller er modtagelige for human immuninsufficiens virus-1 infektion og rekapitulere leverskader som observeret i HIV-inficerede patienter.
Abstract
På trods af den øgede forventede levetid for patienter inficeret med humant immundefektvirus-1 (HIV-1), leversygdom er opstået som en almindelig årsag til deres sygelighed. Den lever immunopatologi forårsaget af HIV-1 forbliver undvigende. Små xenograft dyremodeller med humane hepatocytter og humant immunsystem kan rekapitulere den menneskelige biologi af sygdommens patogenese. Heri er en protokol beskrevet for at etablere en dual humaniseret musemodel gennem humane hepatocytter og CD34+ hæmatopoietiske Stem/progenitorceller (HSPCs) transplantation, at studere leveren immunopatologi som observeret hos HIV-inficerede patienter. For at opnå dobbelt rekonstitution, mand TK-NOG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (Alb-tk) 7-2/shijic) mus intraperitonealt injiceres med ganciclovir (gcv) doser for at eliminere mus transgene leverceller, og med treosulfan til nonmyeloablativ konditionering, som begge fremme menneskelig hepatocyt (HEP) engraftment og menneskelige immunsystem (hans) udvikling. Humant albumin (Alb) niveauer er evalueret for leveren engraftment, og tilstedeværelsen af humane immunceller i blodet detekteret af flow flowcytometri bekræfter etableringen af det menneskelige immunsystem. Den model, der er udviklet ved hjælp af protokollen beskrevet her ligner flere komponenter af leverskader fra HIV-1-infektion. Dets oprettelse kunne vise sig at være afgørende for undersøgelser af co-infektion med hepatitis virus og for evaluering af antivirale og antiretrovirale lægemidler.
Introduction
Siden fremkomsten af antiretroviral behandling, der har været et betydeligt fald i dødsfald relateret til HIV-1-monoinfektion. Men, leversygdom er opstået som en almindelig årsag til sygelighed hos HIV-inficerede patienter1,2. Coinfektioner af hepatitis virus med HIV-1-infektion er mere almindeligt, tegner sig for 10%-30% af HIV-inficerede personer i USA3,4,5.
Den Host-specificitet af HIV-1 og hepatitis vira begrænser nytten af små dyremodeller til at studere menneskelige-specifikke smitsomme sygdomme eller til at undersøge flere aspekter af HIV-1-associeret lever patogenese. Immundefekt mus, der tillader engraftment af humane celler og/eller væv (betegnet humaniseret musemodeller) er acceptable dyremodeller for prækliniske studier6,7,8. Siden introduktionen af humaniserede mus i begyndelsen af 2000 ' erne, flere prækliniske studier af kolestatisk Human levertoksicitet, humane-specifikke patogener, herunder HIV-1 og HIV-associerede neurokognitive lidelser, Epstein Barr virus, hepatitis, og andre smitsomme sygdomme, er blevet undersøgt i disse mus6,9,10,11. Flere musemodeller til CD34+ hspc'er og/eller menneskelig hepatocyt transplantation er længe blevet udviklet og er blevet forbedret med tiden for at studere sygdoms patogenesen af hepatitis B-virus (HBV)-associeret leversygdom12, 13 , 14. flere modeller for HSPC og human hepatocyt (HEP) transplantation er baseret på stammer, kendt som nog (NOD. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, og Fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull mus16. Men hver model har sine egne fordele og begrænsninger; for eksempel, AFC8 Dual humaniseret mus til HEPs og humane stamceller (HSCs) på en Balb/C-Rag2-/- γc-/- baggrund muliggør vellykket engraftment af immunceller og hscs, men der er en mangel på en antigen-specifik T-og B-celle respons i denne model12. De største betænkeligheder ved rekonstitution af dobbelte humaniserede mus omfatter suboptimal engraftment, mangel på egnede modeller til at understøtte forskellige væv, uoverensstemmende forhold, immun afvisning eller graft-versus-Host-sygdom (gvhd) og teknisk vanskeligheder, såsom risikable manipulationer med nyfødte og høj dødelighed på grund af metaboliske abnormaliteter13.
Selv om humaniseret mus har været anvendt til hiv-forskning i mange år17,18,19, brugen af humaniserede mus til at studere leverskader forårsaget af HIV-1 har været begrænset20. Vi har tidligere rapporteret etableringen af en dual humaniseret TK-NOG musemodel og dens anvendelse i HIV-associeret leversygdom8. Denne model viser den robuste engraftment af leveren og immunceller og rekapitulerer HIV-smitte patogenese. Denne drøftelse præsenterer en detaljeret protokol, herunder de mest kritiske trin i transplantationen af humane hepatocytter. En beskrivelse af de Hspc'er, der kræves for en vellykket engraftment af HEPs og etableringen af et funktionelt immunsystem i TK-NOG mus er også præsenteret. Brugen af disse mus til at studere HIV-associeret lever immunopogenese er detaljeret. TK-nog hanmus, der bærer en lever specifik herpes simplex virus type 1 thymidinkinase (HSV-tk) transgen anvendes. Mus leverceller, der udtrykker denne transgene kan let være ablateret efter en kort udsættelse for en ikke-toksisk dosis af gcv. Transplanterede humane leverceller holdes stabilt i muse leveren uden udefrakommende lægemidler21. Musene er også konditioneret med nonmyeloablative doser af treosulfan til at skabe en niche i musens knoglemarv for humane celler8. Immunodedygtige TK-NOG-mus injiceres intrasplenisk med HEPs og Multipotente Hspc'er. Musene overvåges derefter regelmæssigt for blod og lever rekonstitution ved blod immunophenotyping og målinger af serum humant-albuminniveauer, hhv. Mus med en vellykket rekonstitution på mere end 15% for både humane immunceller og HEPs er intraperitonealt injiceret med HIV-1. Effekten af HIV på leveren kan vurderes så tidligt som 4-5 ugers post infektion. Det er vigtigt at bemærke, at fordi HIV-1 anvendes, skal alle nødvendige forholdsregler tages, mens håndtering af virus og indsprøjte det i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) ved University of Nebraska Medical Center.
Bemærk: Få godkendelse fra den lokale IACUC, før du udfører forsøg på dyr.
1. behandling af navlestrengen blod og isolering af humane Hspc'er
- Udfør alle trin i protokollen under sterile forhold i laminar flow kabinetter.
- Tag navlestrengsblod (CB), som opsamles i hepariniserede rør, og gør volumenet op til 35 mL ved tilsætning af fosfat-bufferet saltvand (PBS). Stikprøven på toppen af lymfocytter separations mediet (LSM) som illustreret i figur 1 , og CENTRIFUGER LSM med den LAGDELTE CB ved 400 x g i 35 min ved 4 °c uden bremser.
Bemærk: Fortynd blodet forsigtigt og forsigtigt for at undgå at blande på grænsefladen. - Fjern den øverste LSM og plasma laget omhyggeligt og overfør den hvide Buffy coat-grænseflade til et nyt rør ved hjælp af en overførings pipette.
- Buffy coat opslæmmes i 30-40 mL iskold buffer (PBS + 0,5% bovint serumalbumin [BSA] + 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre [EDTA]). Ved hjælp af en pipette kombineres 20 μL af cellesuspensionen med 20 μL 0,4% trypan og et blå og afpipetteres 10 μL af blandingen i den yderste åbning af et af de to kamre i en tælle slide og indsættes diaset i en automatiseret celle tæller for at tælle cellerne.
Bemærk: Brug iskold buffer i alle trin, da det hjælper med at holde cellerne levedygtige. - Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °c, og supernatanten aspirerer forsigtigt. Tilsæt derefter 300 μL iskold buffer.
- Tilsæt 100 μL humant FC-receptor blokerende reagens og 100 μL monoklonale mus anti-humane CD34 antistof-konjugeret mikroperler i op til 1 x 108 celler (Se tabellen over materialer). Inkuber i 30 min ved 4 °C, tilsæt 10 mL iskold buffer til vask af cellerne, og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °c.
Bemærk: Skalerer dette op i henhold til celle nummeret, hvis der er mere end 1 x 108 celler til stede. - Fjern forsigtigt supernatanten, resuspender pellet i 500 μL buffer, og Fortsæt med det magnetiske separations trin for at berige Hspc'erne.
- Placer en kolonne for positiv udvælgelse af LS (Se tabellen over materialer) i det magnetiske-aktiverede celle sorteringsfelt, og Send den igennem med 3 ml buffer.
- Læg prøven til LS-søjlen, der kan indfange mikroperler bundet til human CD34 + i prøver og lade den flyde under påvirkning af tyngdekraften i opsamlingsrøret.
- Vask kolonnen 3x med buffer og saml elutten i den samme opsamlings slange af CD34- brøkdel af cellerne.
- Kast søjlen med 5 ml buffer for at elueres CD34+ cellerne til en ny opsamlings slange. Gentag proceduren for at opnå en renhed på > 90%.
- Tæl elueret CD34+ celler ved hjælp af trypan og et blå farvestof i en hemocytometer. Efter optælling centrifugeres CD34+ cellerne ved 300 x g i 5 min., og supernatanten kasseres.
- Resuspension af CD34+ cellerne i 25 μl PBS for en injektion, der skal anvendes straks ved transplantation eller embryonog cellerne i en koncentration på 1-2 millioner/ml i fryse middel (Roswell Park Memorial Institute medium [rpmi 1640 medium] + 50% føtal kvægserum (FBS) + 10% dimethylsulfoxid [DMSO]) til videre anvendelse ved transplantation.
Bemærk: Altid genfortælle levedygtige celler, før du bruger dem i transplantation. - For at kontrollere renheden af CD34+ elute, tage 50 μl af suspensionen og inkubere den med 10 μl PE-konjugeret anti-humant CD34 antistof i 30 min ved 4 °c. Efter antistof inkubationen vaskes de farvede celler med PBS, resuspenderes dem i 100 μL PBS, og fortsæt derefter med at udføre strømnings cytometri. Tilsæt et ekstra rør af celler uden antistof til at designe porten i flow cytometer.
- Efter købet analyserer du dataene ved at vælge interesseområdet på et Forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) plot, efterfulgt af gating for enkeltceller på FSC-område og FSC-højde plots. Gate CD34-positive celler på enkeltceller i PE-kanalen og SSC-område plot.
2. fremstilling af humane hepatocytter til transplantation
- Fjern de kryopræserverede hepatocytter fra den flydende nitrogen, hurtigt nedsænkes hætteglasset i vandbad, og tø i ca 90-120 s.
- Tag hætteglasset med hætten af og hæld de optøede hepatocytter i 50 mL konisk slange af det varmede optønings medium.
- Afbryd cellerne ved at Rocking 50 mL røret i hånden i et par sekunder.
Bemærk: Du må ikke vortex røret. - Pellet cellerne ved 100 x g i 8 minutter ved stuetemperatur. De pelleterede celler vaskes i PBS med 0,1% BSA og poolerne med enten friske eller optøede Hspc'er (ratio 10:1) i PBS i et endeligt volumen på 80 μL/mus.
3. håndtering af dyr, screening, genotypebestemmelse og behandling af human HSPC og hepatocyt transplantation
- Håndtering af dyr
- Som følge af svær immundefekt, race, hus, og håndtere TK-NOG mus under aseptiske forhold.
- Bær altid en lab coat, handsker, sko covers, og en ansigtsmaske for at forhindre infektion med potentielt patogene mikroorganismer.
- Brug sterile handsker og instrumenter til kirurgi og håndtere dyrene aseptisk under hele operationen.
- Valg af TK-NOG-mus til eksperimentet
- Oprethold TK-NOG stamme koloni ved avl kvindelige TK-NOG mus med mandlige ikke-TK-NOG littermates og vælg transgene afkom ved genotypebestemmelse.
Bemærk: Udfør genotypebestemmelse (Se trin 3,3) for at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af transgenet hos nyfødte hanner og hunmus på tidspunktet for fravænning. - Vælg mænd ved 6-8 ugers alderen til transplantation på grund af deres høje følsomhed over for GCV-medieret nedbrydning af HSV-TK transgen-ekspression hepatocytter21.
- Øre-tag musene på tidspunktet for fravænning eller kirurgi for at lette identifikationen. Notér dyrenes vægt og sundhedsstatus.
- Oprethold TK-NOG stamme koloni ved avl kvindelige TK-NOG mus med mandlige ikke-TK-NOG littermates og vælg transgene afkom ved genotypebestemmelse.
- Genotypebestemmelse for tilstedeværelsen af HSV-TK-transgenet ved hjælp af kvantitativ realtids-polymerasekæde reaktion
- Udføre genotypebestemmelse på tidspunktet for fravænning (sædvanligvis ved 3-4 ugers alderen). Til genotypebestemmelse skæres et stykke af muse øret i en laminar flow biologisk sikkerhed kabinet til at opretholde sterilitet og udtrække genomisk DNA ved hjælp af en genomisk DNA isolation kit.
- Amplificere genomisk DNA ekstraheret fra ørestykket i en 20 μL reaktionsblanding til skærm for HSV-TK transgene under kontrol af humant albumin promotor ved tilsætning af 1 μL frem primer 5 '-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3 ', 1 μL omvendt primer 5 '-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3 ', 0,5 μL af FAM-sonde 5 ′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 ' og 10 μL Master mix på en real-time polymerase kædereaktion (PCR) instrument22.
- Indstil realtids-PCR-indstillingerne som følger: 60 °C i 30 s (efterfølgende stadie), 95 °C i 10 min (hold Stage), 40 cyklusser af 95 °C i 15 s og 60 °C i 1 min (PCR Stage) og 60 °C i 30 s (postread Stage).
Bemærk: En cyklus af tærskel (CT) under 22 anses for positiv for HSV-TK transgen.
- Behandling med ganciclovir og treosulfan
- Ved hjælp af 27 G nål indsprøjtes TK-NOG-mus med intraperitoneal GCV-injektioner (6 mg/kg) 2x om dagen på dag 7 og på dag 5 i 100 μL saltvand før operationen for at nedbryder muslernes transgene parasympale celler (som vist i Forsøgsstrategien i figur 2)23 .
- På dag 3, 2, og 1 før operationen, forudsætning mus med nonmyeloablative intraperitoneale doser af treosulfan (1,5 g/kg/dag) i 100 μL saltvand, ved hjælp af en 27 G nål.
- En dag før operationen trækkes to til tre dråber (~ 100 μl) blod fra den submandibulære vene ved at stikkende det med en 5 mm Lancet, og isolerer serum ved centrifugering (1.500 x g i 10 min ved 4 °c) for alaninaminotransferase (alt) analyse for at vurdere stor ee af leverskader.
- Forberedelse til operationen
- Brug Clippers til at barbere musens pels omkring incisionsstedet (til venstre for peritonealdialyse væggen) før operationen.
- Juster ilttilførslen til 1 L/min og isofluran strømmen til 3%-5% i en induktions kammer ved hjælp af en mus anæstesi maskine. Placer en mus ad gangen i induktions kammeret til anæstesi.
- Fastgør den ene ende af et sterilt forlænger glas (med en holde kapacitet på 550 μL suspension; Se tabellen over materialer til specifikationer) til en 30 G nål og den anden ende til en 1 ml sprøjte.
- Fyld sprøjten med suspensionen (80 μL/mus) af poolede HEPs og Hspc'er (se punkt 2), Sæt sprøjten i hak af en gentagen dispenserings pipette, og Juster dispenseren for at dispensere 10 μL i hver presse.
- Når musene er bedøvet (normalt efter 3-4 min), skal du skifte isofluran-strømmen til næse keglen og reducere isofluran-strømningshastigheden til 2%-3%.
- Intrasplenisk transplantation af humane Hspc'er og hepatocytter hos mus
- Udfør alle operationstrin i et laminar flow kabinet under sterile forhold.
- Placer en ren steril Drapering over arbejdsoverfladen og skrubbe den venstre side af kroppen af hver mus med 10% povidon-jod efterfulgt af 70% isopropylalkohol, før du foretager et snit.
- Lav et lille snit (~ 1-1,5 cm i længden og 5 mm dyb) i huden, musklen og bughinden på venstre side af peritonealdialyse væggen med Vannas type saks for at komme ind i peritonealhulen ca. 5 mm under den nedre kant af ribbenene.
- Find milten, træk den lidt med pincet til arbejdsområdet for nem adgang, og Indsæt 30 G nålen i den nedre pol af milten.
- Låse stemplet på dispenserings pipetten op og dispensere 10 μL af volumenet ad gangen med en grænse på 60-80 μL pr. milt. Træk nålen langsomt ud, og klip milten med ligerende clips ved hjælp af en ligations applikation.
- Skub milten tilbage i kroppens hulrum med bomulds tippet applikatorer befuvet med steril PBS.
- Luk muskellag af bugvæggen ved hjælp af en absorberbare sutur afbrudt sutur mønster (ikke kontinuerlig). Opnå hudlukning med et afbrudt sutur mønster ved hjælp af ikke-absorberbare suturer.
- Brug varmt vand cirkulerende puder til at beskytte mus fra hypotermi efter operationen.
- Fjern ikke-absorbable suturer 10-14 dage efter operationen.
- Postoperative pleje
- Når det transplanterede dyr vågner, indsprøjtes analgetisk buprenorphin (0,1 mg/kg) intraperitonealt, 2x om dagen i 3 dage i træk.
- Overhold dyrene mindst 1x om dagen, indtil de vender tilbage til normale fysiske forhold.
Bemærk: Kontrollér hvert dyrs legemsvægt, da nogle mus kan tabe efter operationen. Mus typisk genvinde deres oprindelige vægt i 1 til 2 uger.
4. engraftment validering af den menneskelige lever ved ELISA og det menneskelige immun system ved flow cytometri
Bemærk: Evaluere rekonstitution af den menneskelige lever og immunsystemet månedligt, begyndende 1 måned efter transplantation af enzym-linked immunsorbent assay (ELISA) og flow cytometri, hhv.
- Blodprøver udtages fra den submandibulære vene ved hjælp af lancetter i EDTA-rør, og centrifugeres ved 1.500 x g i 10 minutter ved 4 °c. Isoler serum til at kontrollere humane albuminniveauer for at vurdere engraftment effektivitet af muse leveren for transplanterede humane hepatocytter, ved hjælp af en human albumin ELISA kvantitation sæt (Se tabellen over materialer) ved at følge producentens Instruktioner.
Bemærk: Du må ikke kassere pellet og bruge pelleteret celler til en flow flowcytometri analyse til at evaluere det humane immunsystem rekonstitution. - Celle pellet uden serum opslæmmes i 35 μL FACS-buffer (PBS + 2% FBS) og farves med 5 μL muse specifik CD45 (koncentration 0,5 mg/mL) 5 μL hvert af de humane specifikke antistoffer CD45 (0,1 mg/mL), CD3 (0,2 mg/mL), CD8 (0,1 mg/mL) og CD19 (0,5 mg/mL) , og 20 μL CD4 (0,25 mg/mL) og CD14 (0,25 mg/mL) hver i 30 minutter ved 4 °C for at kontrollere udviklingen af et funktionelt immunsystem fra CD34+ hspc'er.
Bemærk: Overvej at tilføje et ekstra rør af ufarvede celler for at bestemme gating af de farvede celler. - Efter inkubation overføres den farvede suspension (~ 100 μl) i et polystyren rund bund flow flowcytometri-rør, og der anvendes 2 ml 1x lysis-buffer (Se tabellen over materialer) ved fortynding af 1 del af 10x lysis-buffer med 9 dele destilleret vand og inkubations 10- 15 min til at lyserøde blodlegemer.
Bemærk: observere turbiditet at evaluere den røde blodlegemer lyse. Når prøven bliver klar, er lysis færdig. - Efter lysis tilsættes 3 mL af FACS-bufferen i røret og centrifugeres ved 300 x g ved 4 °c i 5 minutter for at få en pellet. Vask ved at tilsætte 3 mL FACS buffer til pellet og centrifugeres ved 300 x g ved 4 °c i 5 min.
- Fix cellerne i frisklavet 1% PARAFORMALDEHYD (PFA) og erhverve farvede celler på flow cytometer, analyseret med flow software.
- Til analysen skal du vælge lymfocytter gating på et FSC/SSC plot, efterfulgt af en enkelt celle gating på FSC-område/FSC-højde.
- Desuden Gate for human-specifikke CD45 (hCD45) om enkelt celle befolkning og omfatter muse-specifikke CD45 (mCD45) for udelukkelse af celler af murine oprindelse. Strategize gating af den farvede befolkning baseret på gating af ufarvede celler.
- Gate hCD45+ celler til at bestemme hyppigheden af CD3+ T-celler og CD19+ B- celler. Til at bestemme CD4-og CD8-delsættene. For at evaluere monocytter, Gate på hCD45 at bestemme CD14+ monocytter.
5. HIV-infektion af TK-NOG-mus og dens virkning på den menneskelige lever og immunsystemet
- Håndtere HIV-1-virus og alle inficerede mus i et udpeget biosikkerhedsniveau 2-anlæg.
Forsigtig: Autoklave og kassere alt HIV-inficeret affald i dobbelte Biohazard poser. Af sikkerhedsmæssige årsager bør du bære skære bestandige handsker, mens du afleverer HIV-inficerede mus. - Bær personligt beskyttelsesudstyr (PPE), herunder en engangsbeklædning, sko betræk, en ansigtsmaske, og dobbelt handsker på alle tidspunkter, mens du arbejder med virus.
- Vælg mus med en rekonstitution på mere end 15% af humane CD45+ celler (testet i trin 4,7) og med en tilstedeværelse af humant albumin i serum for HIV-1-infektion (testet i trin 4,1).
- Injicer musene med 1 x 103 til 1 x 104 vævskultur infektiøse DOSER 50 (TCID50) HIV-1ADA i et volumen på 100-200 μl pr. mus, intraperitonealt.
- Euthanize de HIV-inficerede mus 5 uger efter infektion ved hjælp af isofluran (med en isofluran dampkoncentration på > 5%).
- Efter euthanizing musene, indsamle blod i EDTA rør ved en kardiel punktering til isolering af serum, for at se effekten af HIV-1 på leveren ved at evaluere humane-specifikke albuminniveauer ved ELISA (Se trin 4,1) og blodlegemer til at kontrollere for ændringer i det humane immun celler ved hjælp af flowcytometri (Se trin 4,2-4,8).
Bemærk: Vurder den perifere virusbelastning 5 uger efter infektion på en bioanalysator for at bekræfte, om musene er inficeret. - Efter tegning blod, punktafgiftspligtige leveren fra aflives mus.
- For leveren excision, udsætte bughulen ved at gøre et snit på 1,5-2 cm lang og 0,5 cm dybt i huden, muskler, og peritoneum, fra xyphoid. Lav et snit vinkelret på rygsøjlen mellem leveren og mellem gulvet. Løft leveren og bryde eventuelle membraner, der fastgør den til maven og tarmene.
- Saml og Fix leveren i 4% PARAFORMALDEHYD natten over og følg en standard immunhistokemisk protokol for at evaluere effekten af HIV på CK18+ hepatocytter ved hjælp af human-specifikke CK18 antistof8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etableringen af en dobbelt humaniseret musemodel med humane lever-og immunceller kan let overvåges ved hvert trin med meget enkel ELISA og flow cytometri hhv. Flow cytometri udføres regelmæssigt for at evaluere udviklingen af et funktionelt immunsystem og for at se effekten af HIV-infektion på immunceller. I dobbelte humaniserede mus kan udviklingen af funktionelle immunceller variere fra 15% til 90% af lymfocyt porten. Repræsentative undergrupper af immunceller er vist i prik plots (figur 3). Til evaluering af engraftment af humane hepatocytter, ELISA for humane-specifikke albuminniveauer udføres månedligt på mus serum. Mus indpodet med både Hspc'er og HEPs viser humant-specifikke albuminniveauer spænder fra ~ 7 μg/mL til 377 μg/mL på en måned, fortsætter med at vokse over observationstidspunktet (6 måneder) (figur 4). Effekten af HIV-infektion på humane immunceller i blodet af dobbelte humaniserede mus overvåges af flowcytometri og på HEPs i leveren ved Human-specifikke albumin ELISA. Ved 5 uger, HIV-1 forårsager et fald i humant albuminniveauer i serum, som vurderet af ELISA, og der er en udtømning af humane CK18+ hepatocytter i leveren sektioner af Dual humaniseret mus, som evalueret af immun histokemi (figur 5). Et lavere forhold mellem CD4: CD8 er typisk observeret, ved flow cytometri, i blodet og leveren af HIV-inficerede mus, sammenlignet med niveauer noteret i samme mus før infektion (figur 6). Alle reagenser og materialer, der er vigtige for protokollen, diskuteres i tabellen over materialer.
Figur 1 : Skematisk berigelse af CD34+ celler fra navlestrengsblod. (A) navlestrengsblod er lagdelt på lymfocytter separations medium (LSM) og centrifugeret for at isolere Buffy coat. B) ls-kolonnerne anbringes på en magnetisk stander og SKYLLES med BSA-buffer efterfulgt af en tilføjelse af Buffy coat. Celler, der er positive for CD34, er fanget i kolonnerne,og CD34 celler eluppes i separate rør. Fanget CD34+ celler i kolonne harpiks er kastet med et stempel, og cellerne opsamles i et nyt rør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Skematisk visning af det eksperimentelle design til dobbelt rekonstitution af humaniserede lever-og immunsystem-mus, efterfulgt af HIV 1-infektion. TK-NOG-mus injiceres med ganciclovir (GCV) i en dosis på 6 mg/kg, 2x om dagen, på dag-7 og dag-5, efterfulgt af en treosulfan injektion på dage-3,-2 og-1. For at screene musene til transplantationen (TX) udføres en alaninaminotransferase (ALT)-analyse en dag før operationen, og mus med ALAT-niveauer på > 200 og < 600 U/L er valgt. Efter transplantation kontrolleres musene for en rekonstitution af det humane immunsystem ved flowcytometri (FACS) og for lever rekonstitution ved at vurdere deres albumin niveau ved hjælp af ELISA. Musene er inficeret med HIV-1 5 uger før de ofres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Flow flowcytometri analyse gating strategi for human Cell distribution af blod. (A) for det første er lymfocytter indhegnet på fuldblod baseret på FSC-a og SSC-a. (B) enkeltceller er indhegnet på lymfocytter. (C) humane CD45+ leukocytter er gated på enkeltceller ved hjælp af mus CD45 og menneskelige CD45. D) CD3+ T- celler og CD19+ B-celler identificeres på gated CD45+ humane leukocytter. E) CD4+ t- hjælpe celler og CD8+ cytotoksiske t-celler identificeres i gated CD3+ t- celler. (F) CD14+ monocytter er INDHEGNET fra humane CD45+ leukocytter. De resultater, der er repræsenteret her, er fra én mus transplanteret med dobbelte humane hepatocytter og Hspc'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Albumin koncentrationen måles ved hjælp af Elisa i serum af dobbelte humaniserede mus. Musene transplanteres med både humane hepatocytter (HEPs) og CD34+ hæmatopoietiske Stem/stamceller (Hspc'er) (n = 11). Serum opsamles på forskellige tidspunkter ved 1, 4 og 6 måneders post transplantation, og fortyndinger foretages for at justere de ukendte prøve koncentrationer i rækken af standarder. Hvert symbol repræsenterer en enkelt muse værdi. Resultaterne repræsenterer median, samt individuelle værdier. * P < 0,05, af en-vejs ANOVA. Dette tal er blevet modificeret fra Dagur et al.8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Effekt på HIV-1 på albuminniveauer i serum og nedbrydningen af CK18+ humane hepatocytter i leveren af dobbelte humaniserede mus. A) albumin koncentrationerne overvåges i ikke-inficerede mus (n = 9), der transplanteres med både humane heps og hspc'er i 1 og 4 måneder. Musene er inficeret (n = 10) med HIV ved 4-5 måneders post transplantation og ofret 5 ugers post infektion. Hvert symbol repræsenterer en enkelt muse værdi. Resultaterne repræsenterer median, samt individuelle værdier. * P < 0,05, af en-vejs ANOVA. Dette tal er blevet modificeret fra Dagur et al. 8. (B) fem-micron lever sektioner fra ikke-inficerede (heps + hspc'er, venstre panel) og HIV-inficerede TK-nog mus (heps + hspcs + hiv, højre panel) er faste, paraffinindlejret, og farvede for anti-humant cytokeratin-18 (CK18) antistof. HIV-1 forårsager en udtømning af CK18+ hepatocytter er dokumenteret ved en mindre besat område af CK18+ humane celler. De resultater, der er repræsenteret her, er fra en ikke-inficeret og en HIV-inficeret mus transplanteret med dobbelte humane hepatocytter og Hspc'er. skala stænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Forholdet mellem CD4+ -celler og CD8+ T-celler i perifert blod og i leveren af to REKONSTITUEREDE ikke-inficerede og HIV 1-inficerede mus. For dobbelt rekonstituerede ikke-inficerede mus: lukket cirkel; HEPs + Hspc'er; blod n = 7; lever n = 6. For HIV 1-inficerede mus: åbne cirkler; HEPs + HSPCs + HIV; blod n = 10; lever n = 11. Resultaterne repræsenterer median, samt individuelle værdier. * P < 0,05, ved en-vejs-ANOVA-test mellem HIV-inficerede og ikke-inficerede mus. Dette tal er blevet modificeret fra Dagur et al.8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leveren er kompromitteret og beskadiget hos HIV-inficerede patienter24. Eksperimentelle små dyremodeller til at studere menneskelige leversygdomme i nærværelse af HIV-1 er yderst begrænset, på trods af tilgængeligheden af et par cotransplanterede dyremodeller med CD34+ hspc'er og hepatocytter7,12, 25. I in vitro forsøg, hepatocytter er vist at have lav-niveau HIV-1-infektion26. Humaniserede mus, der bærer begge typer af humane celler er en ønskelig model. Lever af mus rekonstitueret med kun humant immunsystem har vist sig at være påvirket af hiv-infektion under eksperimentel udtømning af humane regulatoriske T-celler20,27. Men, forskellen i immun og funktionelle egenskaber af mus og humane hepatocytter kan understrege forskellene i deres respons på HIV-1 og immunceller. I denne gennemgang er en protokol beskrevet til at rekonstruere både humant immunsystem og leveren og til at behandle HIV-1-associeret lever immunopatologi, som observeret hos HIV 1-inficerede patienter. TK-NOG hanmus blev udvalgt på grund af deres lever-selektive høje mRNA ekspression af HSV-TK transgene og modtagelighed af GCV toksicitet for mus transgene lever21. Desuden kan de opretholdes i lange perioder efter transplantation uden brug af udefrakommende lægemidler og ikke udvikler spontane systemiske sygdomme28. For at etablere humant immunsystem og lever rekonstitution, ablation af mus immunsystemet og beskadigelse af muse-specifikke leverceller er påkrævet og opnås ved hjælp af nonmyeloablative doser af treosulfan og GCV, som vist tidligere i TK-NOG mandlige mus13 ,23. Mus injiceres med GCV og treosulfan i en alder af 6-8 uger, som ekspression af transgene og GCV-induceret hepatisk skade som vurderet af ALAT niveauer er optimale, derefter, for at give niche-til-transplanterede humane celler21. Mus, der viser ALAT-niveauer på > 200 U/L, men < 600 U/L, udvælges sædvanligvis til transplantation. Mus, der viser ALT niveauer af > 600 U/L er i en større risiko for døden som humane hepatocytter er ikke i stand til at redde den beskadigede mus leverfunktion.
I øjeblikket, dobbelt menneskeliggørelse er vist ved transplantation af humane CD34+ hspc'er og føtale leverceller; men manipulation af nyfødte dyr skaber tekniske problemer13,14. Hspc'er kan udledes eller isoleres fra flere kilder, såsom føtal leverceller (Flc'er), embryonale stamceller (ESCs) og CB. Etiske spørgsmål begrænser imidlertid brugen af Esc'er og Flc'er. CB har ikke en sådan begrænsning og er et yderst nyttigt alternativ til at opnå Hspc'er, samt at være en dyrebar kilde til primitiv hæmatopoietisk stamcelle og progenitorceller, der kan rekonstruere den funktionelle immun System. Navlestrengsblod bør ikke være ældre end en dag, når det bruges til at isolere Hspc'er, da udbyttet af Hspc'er er stærkt påvirket af alder. Renheden af de isolerede Hspc'er skal kontrolleres, før cellerne kryopreserverer. Krydskontaminering af CD3+ T-celler undgås, da det kan føre til systemisk mus graft-versus-Host sygdom og akut Allorejection af heps mens Trans plering med uoverensstemmende celler.
Kommercielt tilgængelige hepatocytter blev brugt som en kilde til lever rekonstitution8,13. Voksne hepatocytter foretrækkes til at etablere lever rekonstitution på grund af deres øgede effektivitet i engraftment og bæredygtighed for en lang periode29.
Tilstedeværelsen af humant immunsystem i en musemodel øget Alb niveauer, som vist tidligere30,31. Men, effektiviteten af hepatocytter og immunsystemet rekonstitution kan variere med forskellige kilder til donorceller og afhænge af modtageren musen. Så, hver mus skal vurderes for engraftment, og den mest kritiske del er at udnytte de antistoffer eller reagens, der er menneskelige-specifikke og ikke kryds reagere med museceller. De humane-specifikke reagenser og antistoffer, der anvendes i undersøgelsen præsenteret her er beskrevet i tabellen over materialer. Hvis andre antistoffer end dem, der er angivet i tabellen over materialer , anvendes til studiet, skal du sørge for at kontrollere den menneskelige specificitet.
Den optimale tilstand ville være transplantation af syngeneiske celler; Det er imidlertid teknisk vanskeligt at opnå. Når det er muligt, bør Hspc'er og hepatocytter samles fra donorer med delvist matchede humane leukocyt klasse-1 antigener (som HLA-a2).
For at screene mus for HIV-undersøgelser, blod er trukket på flere tidspunkter for at bestemme den optimale immun og lever rekonstitution; flow cytometri og ELISA foretrækkes, da de kan udføres med kun en lille mængde blod. Blodlegemer og serum fra samme prøve kunne anvendes til henholdsvis flowcytometri og ELISA. Det er vigtigt at foretage passende fortyndinger af serum på hvert tidspunkt (1.000-40.000-området) for at evaluere ALB-niveauerne, således at de ukendte koncentrationer kan bringes inden for intervallet af standardkoncentrationer (kit Range: 6,25-400 ng/mL).
Proinflammatoriske cytokiner som respons på HIV-1-infektion i tilstedeværelse af humant immunsystem kan også være nyttige i håndteringen af samspillet mellem hepatocytter og immunceller. Modellen er nyttig til at vise immunopogenesen af HIV-1-induceret leversygdom, da det rekapitulerer leverskader på samme måde som hos mennesker, dokumenteret ved et lavt forhold af CD4: CD8, et fald i Alb niveauer, humane hepatocyt død, og lever immun Aktivering. Modellen har også nogle begrænsninger, såsom et lavt niveau af cytotoksiske T-celler aktivitet og nedsat immunglobulin klasse Skift. På grund af tilstedeværelsen af både menneskelige immunsystem og leveren, den model, der præsenteres her er lovende for Studi coinfektioner af HIV-1 og hepatitis vira, kronisk hepatitis infektion (at præcisere mekanismerne i anti-hepatitis immunrespons), og som en cirrhose Model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health Grant R24OD018546 (til L.Y.P. og S.G.). Forfatterne vil gerne takke weizhe Li, ph.d., for hjælp i kirurgiske procedurer, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng for immunohistologi, unmc flow flowcytometri forsknings facilitets medlemmer direktør Phillip hexley, ph.D., Victoria B. Smith, B.S., og Samantha Wall, b.s., unmc avanceret mikroskopi Core Facility medlemmer Janice A. Taylor, b.s., og James R. talaska, b.s., for teknisk support. Forfatterne anerkender DRs. Mamoru Ito og Hiroshi Suemizu fra CIEA for at give TK-NOG mus og Dr. Joachim Baumgart for at give treosulfan. Forfatterne takker Dr. Adrian Koesters, UNMC, for hendes redaktionelle bidrag til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
