Summary
このプロトコルは、ヒト免疫系および肝細胞の両方を有するヒト化マウスを確立するための信頼性の高い方法を提供する。ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞の脾臓内注射を介して達成される二重再構成免疫不全マウスは、ヒト免疫不全ウイルス-1感染の影響を受けやすく、肝臓損傷を再キャパチレートするHIVに感染した患者
Abstract
ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)に感染した患者の平均余命が増加しているにもかかわらず、肝疾患は罹患率の一般的な原因として浮上している。HIV-1によって引き起こされる肝免疫病理学は、依然として不明なままである。ヒト肝細胞およびヒト免疫系を有する小さな異種移植片動物モデルは、疾患の病因のヒト生物学を要約することができる。本明細書において、ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)移植を介して二重ヒト化マウスモデルを確立するプロトコルが記載され、HIV感染患者で観察される肝臓免疫病理を研究する。二重再構成を達成するために、男性TK-NOG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgTm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic)マウスは、マウストランスジェニック肝細胞を排除するためにガンシクロビル(GCV)用量を経頭食内注射し、非筋筋形成調節のためのトレオスルファンを用いる。ヒト肝細胞(HEP)移植およびヒト免疫系(HIS)の発達を促進する。ヒトアルブミン(ALB)レベルは肝臓移植について評価され、フローサイトメトリーによって検出された血液中のヒト免疫細胞の存在は、ヒト免疫系の確立を確認する。ここで説明するプロトコルを使用して開発されたモデルは、HIV-1感染による肝臓損傷の複数の成分に似ています。その確立は、肝炎ウイルス共感染症の研究と抗ウイルス薬と抗レトロウイルス薬の評価のために不可欠であることが証明される可能性があります。
Introduction
抗レトロウイルス療法の出現以来、HIV-1単感染に関連する死亡が大幅に減少している。しかし、肝疾患はHIV感染患者1,2の罹患率の一般的な原因として現れた。HIV-1感染を伴う肝炎ウイルスの共感染はより一般的であり、米国ではHIV感染者の10%~30%を占める3、4、5を占めている。
HIV-1および肝炎ウイルスの宿主特異性は、ヒト特異的感染症を研究したり、HIV-1関連肝病因の複数の側面を調査するために、小動物モデルの有用性を制限する。ヒト細胞および/または組織の生着を可能にする免疫不欠性マウス(ヒト化マウスモデルと呼ばれています)は、前臨床試験6、7、8の許容可能な動物モデルである。2000年代初頭にヒト化マウスが導入されて以来、胆嚢突起ヒト肝毒性、HIV-1およびHIV関連神経認知障害を含むヒト特異的病原体、エプスタインバーウイルス、肝炎、および他の複数の前臨床研究感染症は、これらのマウス6、9、10、11で調査されている。CD34+HSPCおよび/またはヒト肝細胞移植のための複数のマウスモデルは、長い間開発され、B型肝炎ウイルス(HBV)関連肝疾患12の疾患病因を研究するために時間をかけて改善されてきた、13歳,14.HSPCおよびヒト肝細胞(HEP)移植のためのいくつかのモデルは、NOG(NOD)として知られている株に基づいている。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15、 バルブ/C-ラグ2-/- γ-/- γ -/- (Rag2 tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flg tm1.1Flv/J)12、および fah-/- NOD ラグ1-/--il2rγヌルマウス16.ただし、各モデルには独自の長所と制限があります。例えば、BALb/C-Rag2上のHEPおよびヒト幹細胞(HSC)のAFC8二重ヒト化マウスは、免疫細胞およびHSCの正常な生着を可能にするが、抗原特異的なT細胞およびB細胞が存在しないこのモデル12での応答 .二重ヒト化マウスの再構成における主な懸念は、最適でない生着、異なる組織をサポートするための適切なモデルの欠如、不一致の状態、免疫拒絶反応、または移植片対宿主病(GVHD)、および技術的な新生児による危険な操作や代謝異常による死亡率の高さなどの困難13.
ヒト化マウスは17年、18年、19年のHIV研究に長年使用されてきたが、HIV-1による肝臓損傷を研究するヒト化マウスの使用は20件に制限されている。我々は以前に、二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立とHIV関連肝疾患8におけるその応用を報告した。このモデルは、肝臓および免疫細胞の堅牢な生着を示し、HIV感染病因を要約する。この議論は、ヒト肝細胞移植における最も重要なステップを含む詳細なプロトコルを提示する。HEPの移植に成功するために必要なHSPCの説明とTK-NOGマウスにおける機能性免疫系の確立についても説明する。これらのマウスをHIV関連肝免疫病因の研究に用いることは詳細である。肝臓特異的ヘルペス単純ヘルペスウイルス1チミジンキナーゼ(HSV-TK)トランスジーンを担持するTK-NOG雄マウスが用いられる。このトランスジーンを発現するマウス肝細胞は、GCVの非毒性用量への短時間暴露後に容易にアブレートすることができる。移植されたヒト肝細胞は、外因性薬物なしでマウス肝臓内で安定に維持される21.マウスはまた、ヒト細胞8のマウス骨髄にニッチを作成するために、トレオスルファンの非骨髄切除用量で予め定められている。免疫不全のTK-NOGマウスは、HEPおよび多能性HSPCを神経中注射する。その後、マウスは、血液免疫の入力と血清ヒトアルブミンレベルの測定によって、血液および肝臓の再構成について定期的にモニタリングされる。ヒト免疫細胞とHEPの両方に対して15%以上の再構成に成功したマウスは、HIV-1を食前食内注射する。肝臓に対するHIVの効果は、早ければ4~5週間の感染後に評価することができる。HIV-1が使用されているので、ウイルスを処理し、マウスに注入する際に必要なすべての予防措置を取る必要があります。
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Protocol
このプロトコルは、ネブラスカ大学医療センターの機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注:動物実験を行う前に、地元のIACUCから承認を得る。
1. 臍帯血の処理とヒトHSPCの分離
- 層流のキャビネットの無菌条件の下で議定書のすべてのステップを行う。
- ヘパリン化チューブで採取した臍帯血(CB)を採取し、リン酸緩衝生理食生(PBS)を加えて体積を35mLにする。図1に示すように、リンパ球分離培地(LSM)の上にサンプルを重ね、ブレーキなしで4°Cで35分間400xgの層状CBでLSMを遠心分離します。
注:インターフェイスで混合を避けるために、慎重かつ穏やかに血液を希釈します。 - 上部LSMとプラズマ層を慎重に取り外し、転送ピペットを使用して白いバフィーコートインターフェイスを新しいチューブに移します。
- 冷たいバッファーの30-40 mLでバフィーコートを再中断する(PBS + 0.5% ウシ血清アルブミン [BSA] + 2 mMエチレンディアミンテトラセチン酸[EDTA])。ピペットを使用して、セルサスペンションの20 μLと0.4%トリパンブルーの20 μLと混合物のピペット10 μLをカウントスライドの2つのチャンバーのいずれかの外側の開口部に組み合わせ、細胞をカウントするために自動化されたセルカウンターにスライドを挿入します。
注:セルを実行可能に保つのに役立つため、すべてのステップで氷冷バッファーを使用します。 - 4°Cで10分間300xgで細胞を遠心分離し、上清を注意深く吸引する。 次に、300 μLの氷冷バッファーを追加します。
- ヒトFc受容体遮断試薬の100μLおよびモノクローナルマウス抗ヒトCD34抗体共役マイクロビーズを最大1x108細胞に添加する(材料表参照)。4°Cで30分間インキュベートし、細胞を洗浄するために10 mLの冷たいバッファーを加え、遠心分離機を300 x gで4°Cで10分間使用します。
注:1 x 108 個を超えるセルが存在する場合は、セル番号に従ってスケールアップします。 - 上清を慎重に取り出し、ペレットを500μLのバッファーで再サスペンドし、磁気分離工程を進め、HSPCを濃縮します。
- 磁気活性化セル選別場に正の選択LSカラム(材料表を参照)を配置し、3 mLのバッファで通過します。
- サンプルをヒトCD34+に結合したマイクロビーズをサンプルに取り込み、重力の影響を受けて回収管に流れ込むことができるLSカラムにサンプルをロードします。
- 緩衝液でカラム3xを洗浄し、CD34の同じコレクションチューブに溶出物を収集します -細胞の一部。
- 5 mL のバッファーでカラムを急降下させ、CD34+セルを新しいコレクションチューブに溶出させます。>90%の純度を達成するために手順を繰り返します。
- 血球計でトリパン青色染料を使用して、浸透したCD34+細胞を数えます。カウントした後、CD34+細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
- 凍結培地中に1-200万/mLの濃度で細胞を移植または凍結保存するために注射用のPBSの25 μLでCD34+細胞を再中断する(ロズウェルパーク記念研究所培地[RPMI 1640培地]+50%胎児牛血清(FBS)+10%ジメチルスルホキシド[DMSO])移植のさらなる使用のため。
注:移植でそれらを使用する前に、常に生存細胞を再計算します。 - CD34+溶出液の純度を確認するには、懸濁液の50 μLを取り、4°Cで30分間PE結合抗ヒトCD34抗体の10 μLでそれをインキュベートします。抗体インキュベーション後、染色した細胞をPBSで洗浄し、100μLのPBSで再定酸化し、次いで、フローサイトメトリーを行う。フローサイトメーターでゲートを設計するために抗体を持たない細胞の追加チューブを追加します。
- 取得後、前方散布図(FSC)およびサイドスキャッタ(SSC)プロットの対象領域を選択してデータを分析し、その後、FSC領域およびFSC高さのプロット上の単一セルのゲーティングを行います。PEチャネルおよびSSC領域プロット内の単一細胞上のゲートCD34陽性細胞。
2. 移植用ヒト肝細胞の調製
- 液体窒素から凍結保存された肝細胞を取り出し、すぐに水浴中のバイアルを沈め、約90〜120sのために解凍する。
- バイアルキャップを取り外し、解凍した肝細胞を温めた解凍媒体の50 mL円錐管に注ぎます。
- 50 mLチューブを数秒間手で揺らして細胞を吊り下します。
注:チューブを渦に入れさらわさわ - 細胞を室温で8分間100xgでペレットする。 0.1%BSAでPBSでペレット化した細胞を洗浄し、80 μL/マウスの最終体積でPBSの新鮮または解凍されたHSPC(比10:1)でプールします。
3. ヒトHSPCおよび肝細胞移植に対する動物の取り扱い、スクリーニング、ジェノタイピングおよび治療
- 動物の取り扱い
- 重度の免疫不全の結果として、品種、家、および無菌条件下でTK-NOGマウスを処理する。
- 常にラボコート、手袋、靴カバー、フェイスマスクを着用して、病原性微生物の感染を防ぎます。
- 手術には滅菌手袋と器具を使用し、手術を通して動物を無菌的に処理します。
- 実験用のTK-NOGマウスの選択
- オスの非TK-NOGリッターメートで雌のTK-NOGマウスを繁殖させ、ジェノタイピングによりトランスジェニック子孫を選択することにより、TK-NOG株コロニーを維持する。
注:ジェノタイピング(ステップ3.3参照)を実行して、離離時の新生児の雄マウスおよび雌マウスにおけるトランスジーンの有無を決定する。 - HSV-TKトランスジーン発現肝細胞21のGCV媒介枯渇に対する高い感受性による移植のための6〜8週齢の男性を選択する。
- 同種確認を容易にするために、引き取りや手術時にマウスに耳タグを付けます。動物の体重と健康状態をメモします。
- オスの非TK-NOGリッターメートで雌のTK-NOGマウスを繁殖させ、ジェノタイピングによりトランスジェニック子孫を選択することにより、TK-NOG株コロニーを維持する。
- 定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いたHSV-TKトランスジーンの存在に対するジェノタイピング
- 分別時にジェノタイピングを行う(通常、生後3~4週)。ジェノタイピングの場合は、マウスの耳を層流の生物学的安全キャビネットに切り取り、無菌性を維持し、ゲノムDNA分離キットを使用してゲノムDNAを抽出します。
- 20μL反応混合物で耳から抽出したゲノムDNAを20μL反応混合物で増幅し、フォワードプライマー5'-CCATGCACGTGTTTCCTTTTGG-3'、1 μLのリバースプライマー5'-TAGTTGCGCGCGCGCGCCC-3'-0μLを加えることで、ヒトアルブミンプロモーターの制御下でHSV-TKトランスジーンのスクリーニングを行う。FAMプローブ5'-FAM-AATCGCGCCCCGC-MGB-3'、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)器械22上のマスターミックスの10 μL。
- リアルタイム PCR 設定を次のように設定します:30 s (プリリードステージ)、95 °C (ホールドステージ)、15 s の場合は 95 °C、1 分間 60 °C の 40 サイクル (PCR ステージ)、30 s (ポストリードステージ) の 60 °C を設定します。
注:22未満の閾値(Ct)のサイクルは、HSV-TKトランスジーンに対して陽性と見なされる。
- ガンシクロビルとトレオスルファンを用いての治療
- 27G針を使用して、TK-NOGマウスに対して、手術前の生理食べ物の100μLで1日2xの食前GCV注射(6mg/kg)を1日2倍注射し、マウスのトランスジェニック・マレンキマル細胞を枯渇させる(図2の実験戦略に示すように)23.
- 手術前の3日目、2日目、および1日目に、27G針を用いて100μLの生理食食のトレオスルファン(1.5g/kg/日)の非骨髄切除性食後用量を有するマウスを予言した。
- 手術の1日前に、5mmランセットで刺すことによって下顎静脈から血液の2〜3滴(〜100μL)を引き出し、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)のアサイザーについて遠心分離(1,500 x g、4°Cで10分間)で血清を分離し、デグラーを評価する肝臓の損傷のee。
- 手術の準備
- 切開部位(腹膜壁の左側)を取り囲むマウスの毛皮を手術前に剃るためにバリカンを使用してください。
- 酸素の流れを1 L/min に調整し、マウス麻酔機を使用して誘導室でイソファランの流れを3%~5%に調整します。麻酔用の誘導室にマウスを1匹ずつ置きます。
- 滅菌延長管の一方の端(サスペンションの保持容量550 μL、仕様については材料表を参照)を30G針に取り付け、もう一方の端を1mLシリンジに取り付けます。
- スポイリングスをプールされたHEPとHSPC(セクション2参照)の懸濁液(80 μL/マウス)で充填し、繰り返し分配ピペットのノッチにシリンジをフィットさせ、ディスペンサーを調整して各プレスで10μLを分配します。
- マウスが麻酔を受けたら(通常3~4分後)、イソファランの流れをノーズコーンに切り替え、イソファランの流量を2%~3%に減らす。
- マウスにおけるヒトHSPCおよび肝細胞の脾臓移植
- 無菌条件下で層流キャビネット内のすべての手術ステップを実行します。
- 作業面の上にきれいな無菌ドレープを置き、切開を行う前に、10%のポビドンヨウ素に続いて70%のイソプロピルアルコールで各マウスの体の左側をスクラブします。
- 胸壁の左側の皮膚、筋肉、胸膜に小さな切開(長さ~1.5cm、深さ5mm)を、バンナ型はさみで、肋骨ケージの下端から約5mm下の胸膜腔に入る。
- 脾臓を見つけ、操作領域に鉗子でわずかに引っ張り、30Gの針を脾臓の下の極に挿入します。
- 分配ピペットのプランジャーのロックを解除し、脾臓あたり60-80 μLの制限で、一度に10 μLの体積を分配します。針をゆっくりと引き込み、ライゲーション・プリジャーを使用して、ライゲーション・プリジャーを使用して、ライゲーション・クリップで脾臓をクリップします。
- 脾臓を体腔に押し戻し、無菌のPBSで濡らした綿の先端のアプリケーターを使用します。
- 吸収性縫合中断縫合パターン(連続ではない)を使用して腹壁の筋肉層を閉じる。非吸収性縫合糸を使用して中断された縫合パターンで皮膚閉鎖を達成する。
- 手術後の低体温からマウスを保護するために、温水循環パッドを使用してください。
- 手術後10~14日後に非吸収性縫合糸を取り除く。
- 術後ケア
- 移植された動物が目覚めるとき、鎮痛薬ブプレノルフィン(0.1mg/kg)を食後3日間連続して1日2倍に注入する。
- 彼らは正常な物理的な状態に戻るまで、少なくとも1日1回動物を観察してください。
注:一部のマウスは体重の後部手術を失う可能性があるため、各動物の体重を確認してください。マウスは通常、1~2週間で元の体重を取り戻す。
4. ELISAによるヒト肝臓の移植検証とフローサイトメトリーによるヒト免疫系
注:ヒト肝臓と免疫系の再構成を毎月評価し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)とフローサイトメトリーによる移植後1ヶ月をそれぞれ開始する。
- EDTAチューブのランセットを用いて下顎静脈から血液サンプルを採取し、4°Cで10分間1,500xgの遠心分離機を採取する。ヒトアルブミンレベルをチェックする血清を分離し、ヒト肝細胞移植に対するマウス肝臓の生着効率を評価し、ヒトアルブミンELISA定量セット(材料の表を参照)を用いて、製造業者の従い方を行う。指示。
注:ペレットを捨てて、フローサイトメトリー分析のためにペレット化された細胞を使用して、ヒト免疫系の再構成を評価しないでください。 - FACSバッファーの35 μL(PBS + 2%FBS)で血清を含まない細胞ペレットを再定重し、マウス特異的CD45(濃度0.5mg/mL)、ヒト特異的抗体CD45(0.1mg/mL)、CD3(0.2mg/mL)、CD8(0.1mg/mL)、CD8(0.1mg/mL)、5μLのマウス特異的CD45(濃度0.5mg/mL)で染色と、CD4(0.25mg/mL)及びCD14(0.25mg/mL)の20μLを4°Cで30分間それぞれ、CD34+HSPCからの機能性免疫系の発達を確認した。
注:染色されていない細胞のチューブを1つ追加して、染色された細胞のゲーティングを決定することを検討してください。 - インキュベーション後、染色された懸濁液(~100μL)をポリスチレン丸底流れサイトメトリーチューブに移し、蒸留水の9部で10x分解バッファーの1部を希釈し、10をインキュベートして2mLの1x分解バッファーを使用する(材料の表を参照)。赤血球をリゼする15分
注:赤血球リシスを評価するために濁りを観察します。サンプルが明確になると、リシスが完了します。 - リシス後、チューブ内のFACSバッファーの3 mLを追加し、ペレットを得るために5分間4°Cで300 x gで遠心分離機を追加します。ペレットと遠心分離機に3mLのFACSバッファーを3mL加えて4°Cで5分間洗浄を繰り返します。
- 作りたての1%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定し、フローサイトメーター上の染色細胞を取得し、フローソフトウェアで分析します。
- 分析のために、FSC/SSCプロット上のゲーティングを選択し、続いてFSC領域/FSC高さに単細胞ゲーティングを行います。
- また、単細胞集団上のヒト特異的CD45(hCD45)に対するゲートは、マウス由来の細胞を排除するためのマウス特異的CD45(mCD45)を含む。染色されていない細胞のゲーティングに基づいて染色された集団のゲーティングを戦略化する。
- ゲートhCD45+細胞は、CD3+T細胞およびCD19+B細胞の周波数を決定する。ゲート T セルを使用して、CD4 および CD8 サブセットを決定します。単球を評価するには、hCD45上のゲートでCD14+単球を決定する。
5. TK-NOGマウスのHIV感染とヒト肝臓および免疫系への影響
- HIV-1ウイルスおよびすべての感染マウスを指定されたバイオセーフティレベル2施設で処理します。
注意:オートクレーブと二重バイオハザードバッグにすべてのHIV感染廃棄物を廃棄します。安全上の理由から、HIV感染マウスを手渡す間、切り傷に強い手袋を着用してください。 - 使い捨てカバーオールガウン、靴カバー、フェイスマスク、ダブルグローブを含むパーソナルプロテクション機器(PPE)を常に着用してください。
- ヒトCD45+細胞の15%以上(ステップ4.7で試験)とHIV-1感染のための血清中にヒトアルブミンの存在を有するマウスを選択する(ステップ4.1でテスト)。
- マウスに1 x 103 x 1 x 104組織培養感染用量50(TCID50)HIV-1ADAをマウス当たり100~200μLの体積で注射する。
- イソファラン(イソファラン蒸気濃度>5%)を用いて感染後5週間をHIV感染マウスに安楽死させる。
- マウスを安楽死させた後、血清の単離のための心臓穿刺によってEDTAチューブに血液を採取し、ELISA(ステップ4.1参照)と血液細胞によるヒト特異的アルブミンレベルを評価して肝臓に対するHIV-1の効果を確認し、ヒト免疫の変化をチェックする。フローサイトメトリーを使用する細胞(手順4.2~4.8を参照)。
注:バイオアナリサータで感染後5週間の末梢ウイルス負荷を評価し、マウスが感染しているかどうかを確認する。 - 血液を採取した後、安楽死マウスから肝臓を取り除く。
- 肝臓切除の場合は、キシフォイドから皮膚、筋肉、腹膜に長さ1.5~2cm、深さ0.5cmの切開を行い、腹腔を露出させる。肝臓と横隔膜の間の脊椎に垂直なカットを行います。肝臓を持ち上げ、胃や腸に付着する膜を切断します。
- 肝臓を一晩4%パラホルムアルデヒドで回収して固定し、標準的な免疫組織化学プロトコルに従って、ヒト特異的CK18抗体8を用いてCK18+肝細胞に対するHIVの効果を評価する。
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Representative Results
ヒト肝臓および免疫細胞を用いた二重ヒト化マウスモデルの確立は、それぞれ非常に簡単なELISAおよびフローサイトメトリーで各ステップで容易に監視することができる。フローサイトメトリーは、機能性免疫系の発達を評価し、免疫細胞に対するHIV感染の影響を確認するために定期的に行われる。二重ヒト化マウスでは、機能性免疫細胞の発達は、リンパ球門の15%から90%の範囲である。免疫細胞の代表的なサブセットをドットプロットに示す(図3)。ヒト肝細胞の生着の評価のために、ヒト特異的アルブミンレベルに対するELISAはマウス血清上で毎月行われる。HSPCとHEPの両方で移植されたマウスは、1ヶ月で〜7 μg/mLから377 μg/mLまでのヒト固有のアルブミンレベルを示し、観察の時間(6ヶ月)にわたって成長し続ける(図4)。二重ヒト化マウスの血液中のヒト免疫細胞に対するHIV感染の影響は、ヒト特異的アルブミンELISAによって肝臓のフローサイトメトリーおよびHEPによってモニタリングされる。5週間までに、HIV-1は、ELISAによって評価された血清中のヒトアルブミンレベルの低下を引き起こし、および免疫組織化学によって評価された二重ヒトマウスの肝臓部におけるヒトCK18+肝細胞の枯渇がある(図5)。CD4:CD8の低い比率は、典型的には、フローサイトメトリーによって、HIV感染マウスの血液および肝臓において、感染前に同じマウスで指摘されたレベルと比較して観察される(図6)。プロトコルにとって重要なすべての試薬および材料は、材料の表で議論される。
図 1:臍帯血からのCD34+細胞の濃縮の概略図。(A)臍帯血は、リンパ球分離培地(LSM)上に重ね、遠心分離してバフィーコートを分離する。(B)LSカラムを磁気スタンドに置き、BSAバッファですすいで、続いてバフィーコートを追加します。CD34に対して陽性の細胞は列に閉じ込められ、CD34-細胞は別々の管でelitされる。カラム樹脂中の閉じ込められたCD34+細胞はプランジャーで急落し、細胞は新しい管で集められる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: ヒト化肝および免疫系マウスの二重再構成のための実験計画の概略図, HIV-1感染が続く.TK-NOGマウスは、6mg/kg、2x日、7日目および日-5の用量でガンシクロビル(GCV)を注射し、続いて-3、-2および-1にトレオスルファン注射を行う。移植用のマウスをスクリーニングするために(Tx)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)アッセイは手術の1日前に行われ、ALTレベルの>200および<600 U/Lを有するマウスが選択される。移植後、マウスはELISAを用いてアルブミンレベルを評価することにより、フローサイトメトリー(FACS)によるヒト免疫系の再構成と肝臓の再構成についてチェックされる。マウスは、彼らが犠牲にされる5週間前にHIV-1に感染しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:血液のヒト細胞分布に対するフローサイトメトリー分析ゲーティング戦略(A)まず、リンパ球は、FSC-AおよびSSC-Aに基づいて全血にゲートされる。(B)単一細胞はリンパ球にゲートされる。(C)ヒトCD45+ロイコサイトは、マウスCD45およびヒトCD45を用いて単一細胞上でゲートされる。(D)CD3+T細胞およびCD19+B細胞は、ゲートCD45+ヒト白血病細胞上で同定される。(E)CD4+Tヘルパー細胞およびCD8+細胞傷害性T細胞は、ゲートCD3+T細胞において同定される。(F)CD14+単球は、ヒトCD45+白球細胞からゲートされる。ここに示される結果は、二重ヒト肝細胞とHSPCで移植された1匹のマウスからのものです。
図 4:アルブミン濃度は、二重ヒト化マウスの血清中のELISAによって測定される。マウスは、ヒト肝細胞(HEP)およびCD34+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)(n=11)の両方で移植される。血清は移植後1、4、6ヶ月で異なる時間に採取され、希釈は標準の範囲で未知のサンプル濃度を調節するためになされる。各シンボルは、個々のマウス値を表します。結果は、中央値と個々の値を表します。* P < 0.05, 片道分散分析.この図は、Dagurら8.から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 血清中のアルブミンレベルとCK18+ヒト肝細胞の枯渇に対するHIV-1に及ぼす影響(A)アルブミン濃度は、ヒトHEPとHSPCの両方を1ヶ月および4ヶ月で移植した未感染マウス(n=9)でモニタリングされる。マウスは移植後4~5ヶ月でHIVに感染し(n=10)、感染後5週間を犠牲にした。各シンボルは、個々のマウス値を表します。結果は、中央値と個々の値を表します。* P < 0.05, 片道分散分析.この図は Dagurらから変更されています。8.(B)未感染の5ミクロン肝切片(HEP+HSPC、左パネル)およびHIV感染TK-NOGマウス(HEP+HSPC+HIV、右パネル)は固定され、パラフィンを埋め込み、抗ヒトサイトケラチン-18(CK18)抗体用に染色した。CK18+肝細胞の枯渇を引き起こすHIV-1は、CK18+ヒト細胞による占有面積の少ない領域によって証明される。ここに示される結果は、二重ヒト肝細胞とHSPCで移植された1つの未感染マウスと1匹のHIV感染マウスからのものです。
図 6: 末梢血および二重再構成未感染およびHIV-1感染マウスの肝臓におけるCD4+細胞のCD8+T細胞の比率。二重再構成された未感染マウスの場合:閉じた円;HEP + HSPC;血液n = 7;肝臓n = 6.HIV-1感染マウスの場合: 開いている円;HEP + HSPC + HIV;血液n = 10;肝臓n = 11.結果は、中央値と個々の値を表します。*P < 0.05, HIV感染マウスと未感染マウスの間の一方通行の分散分析による.この図は、Dagurら8.から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
肝臓は、HIV感染患者24で侵害され、損傷を受けている。HIV-1の存在下でヒト肝疾患を研究するための実験的な小動物モデルは、CD34 +HSPCおよび肝細胞7、12を有するいくつかの共移植動物モデルの利用可能性にもかかわらず、極めて限られている。 25.インビトロ実験では、肝細胞は低レベルのHIV-1感染26を有することが示されている。両方のタイプのヒト細胞を運ぶヒト化マウスは、望ましいモデルである。ヒト免疫系のみで再構成されたマウスの肝臓は、ヒト調節T細胞20,27の実験的枯渇下下でHIV感染の影響を受けることが示されている。しかし、マウスとヒト肝細胞の免疫および機能特性の違いは、HIV-1および免疫細胞に対する応答の違いを強調する可能性がある。このレビューでは、ヒト免疫系と肝臓の両方を再構成し、HIV-1感染患者で観察されるHIV-1関連肝免疫病理学に対処するためのプロトコルが記載されている。TK-NOG雄マウスは、HSV-TKトランスジーンの肝選択的高mRNA発現およびマウストランスジェニック肝21に対するGCV毒性の感受性のために選択された。また、それらは外因性薬物を使用せずに移植後長期間維持することができ、自発的な全身性疾患を発症しない28.ヒト免疫系と肝臓の再構成を確立するためには、TK-NOGオスマウス13に示したように、マウス免疫系のアブレーションとマウス特異的肝細胞への損傷が必要であり、トレオスファンおよびGCVの非骨髄切除用量を用いて達成される。 、23.マウスは、6〜8週齢でGCVおよびトレオスルファンを注射し、ALTレベルによって評価されたトランスジーンおよびGCV誘発肝傷害の発現が最適であると、次いで、ニッチ移植ヒト細胞21を提供するために。>200 U/LのALTレベルを示すマウスは、通常、移植のために選択される<600 U/Lである。>600 U/LのALTレベルを示すマウスは、ヒト肝細胞が損傷したマウス肝機能を救出できないため、死亡のリスクが高い。
現在、二重ヒト化は、ヒトCD34+HSPCおよび胎児肝細胞の移植によって示されている。しかし、新生児動物の操作は、技術的な問題を作成します 13,14.HSPCは、胎児肝細胞(FLC)、胚性幹細胞(ESC)、CBなどの複数の供給源から誘導または単離することができる。しかし、倫理的な問題は、ESCとFLCの使用を制限し、そのような制限を持っておらず、HSPCを得るための最も有用な代替手段であるだけでなく、機能性免疫を再構成することができる原始造血幹細胞および前駆細胞の貴重な供給源である。システム。HSPCの収量は年齢の影響を受けるので、臍帯血は、HSPCを分離するために使用される1日よりも古くすべきではありません。単離されたHSPCの純度は、細胞を凍結保存する前にチェックする必要があります。CD3+T細胞のクロスコンタミネーションは、不一致の細胞で移植しながら、全身マウス移植片対-宿主病およびHEPの急性同種拒絶反応を引き起こす可能性があるため、回避される。
市販の肝細胞は、肝臓再構成8,13の供給源として使用された。成人肝細胞は、長期間の移植および持続可能性の効率の向上に起因する肝臓再構成を確立するために好ましい29.
マウスモデルにおけるヒト免疫系の存在は、前述の30,31に示すようにALBレベルを増加させた。しかし、肝細胞および免疫系の再構成の効率は、ドナー細胞の異なる供給源によって異なり、レシピエントマウスに依存してもよい。したがって、各マウスは生着を評価する必要があり、最も重要な部分は、ヒト特異的であり、マウス細胞と交差反応しない抗体または試薬を利用することです。ここに提示された研究で使用されるヒト特異的試薬および抗体は、材料の表に詳述されている。材料表に記載されている以外の抗体を研究に使用する場合は、必ずヒトの特異性を確認してください。
最適な条件は、合成細胞の移植であろう。しかし、それは技術的に達成することは困難です。可能な限り、HSPCおよび肝細胞は、部分的に一致したヒト白血病細胞クラス1抗原(HLA-A2のような)を有するドナーからプールされるべきである。
HIV研究のためのマウスをスクリーニングするには、血液は、最適な免疫と肝臓の再構成を決定するために、複数の時点で描画されます。フローサイトメトリーとELISAは、少量の血液で行うことができるので好ましい。同じ試料からの血液細胞および血清は、それぞれフローサイトメトリーおよびELISAに用いることができる。未知の濃度が標準濃度の範囲内に収まるように、ALBレベルを評価するために、各時点(1,000~40,000~)で血清を適切に希釈することが重要です(キット範囲:6.25~400ng/mL)。
ヒト免疫系の存在下でHIV-1感染に応答する炎症性サイトカインは、肝細胞および免疫細胞の相互作用に対処するのにも有用であり得る。このモデルは、HIV-1誘発性肝疾患の免疫化を示すのに有用であり、ヒトと同様に肝臓損傷を再構成することを考えると、CD4:CD8の低い比率、ALBレベルの減少、ヒト肝細胞死、および肝臓免疫によって証明される。活性 化。このモデルには、細胞傷害性T細胞活性の低さや免疫グロブリンクラスの切り替え障害など、いくつかの制限があります。ヒト免疫系と肝臓の両方の存在により、HIV-1ウイルスと肝炎ウイルスの共感染、慢性肝炎感染(抗肝炎免疫応答のメカニズムを明らかにする)、肝硬変として有望である。モデル。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所の助成金R24OD018546(L.Y.P.およびS.G.)によって支援されました。著者らは、外科的処置の助けに対して、アマンダ・ブランチ・ウッズ、B.S.、免疫組織学のためのヤン・チェン、UNMCフローサイトメトリー研究施設メンバーのフィリップ・ヘクスリー、博士、ビクトリア・B・スミス、B.S.、サマンサの助けに感謝したいと思います。ウォール、B.S.、UNMCは、技術サポートのためのジャニスA.テイラー、B.S.、およびジェームズR.Talaska、B.S.の高度な顕微鏡検査コア施設メンバー。著者らは、TK-NOGマウスとヨアヒム・バウムガート博士がトレオスルファンを提供したことを認めている。著者は、原稿への彼女の編集貢献のために、UNMCのエイドリアン・コエスター博士に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
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