Summary
이 프로토콜은 인간 면역 계통 및 간 세포 둘 다로 인간화한 마우스를 설치하는 믿을 수 있는 방법을 제공합니다. 인간 간세포 및 CD34+ 조혈 줄기 세포의 경내 주사를 통해 달성된 이중 재구성 면역 결핍 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스-1 감염에 취약하고 관찰된 바와 같이 간 손상을 재현합니다. HIV에 감염된 환자.
Abstract
인간 면역 결핍 바이러스-1 (HIV-1)에 감염된 환자의 기대 수명이 증가했음에도 불구하고 간 질환은 이환율의 일반적인 원인으로 나타났습니다. HIV-1에 기인한 간 면역 병리학은 애매하게 남아 있습니다. 인간 간세포및 인간 면역 계통을 가진 작은 이종이식 동물 모형은 질병의 병인의 인간 생물학을 되풀이할 수 있습니다. 본 명세서에서, 프로토콜은 인간 간세포 및CD34+ 조혈줄기/전구세포(HSPC) 이식을 통해 이중 인간화된 마우스 모델을 확립하고, HIV 감염 환자에서 관찰된 바와 같이 간 면역병리학을 연구하기 위해 기술된다. 이중 재구성을 달성하기 위해, 남성 TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK)7-2/ShiJic) 마우스는 쥐 형질전환 간 세포를 제거하기 위해 간시 클로비르 (GCV) 투여량으로 복강 내 주입, 그리고 비 myeloablative 컨디셔닝을위한 treosulfan, 둘 다 인간 간세포 (HEP) 생착 및 인간 면역 체계 (HIS) 개발을 용이하게합니다. 인간 알부민(ALB) 수준은 간 생착에 대해 평가되고, 유세포측정에 의해 검출된 혈액내 인간 면역 세포의 존재는 인간 면역 계통의 확립을 확인한다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 개발된 모델은 HIV-1 감염으로 인한 간 손상의 여러 구성 요소와 유사합니다. 그것의 설립은 간염 바이러스 공동 감염의 연구 결과 및 항 바이러스 및 항 레트로 바이러스 약물의 평가에 필수적인 증명할 수 있었습니다.
Introduction
항 레트로 바이러스 치료의 출현 이후, HIV-1 단독 감염과 관련된 사망이 상당히 감소했습니다. 그러나, 간 질환은 HIV 감염 환자에서 이환율의 일반적인 원인으로등장하고있다 1,2. HIV-1 감염을 가진 간염 바이러스의 공동 감염은 미국에 있는 HIV 감염한 사람의 10% - 30%를 차지하는 일반적입니다3,4,5.
HIV-1 및 간염 바이러스의 호스트 특이성은 인간 특정 전염병을 연구하거나 HIV-1 관련 간 병인의 다중 양상을 조사하기 위하여 작은 동물 모형의 유용성을 제한합니다. 인간 세포 및/또는 조직(인간화마우스 모델이라고 불등)의 생생을 허용하는 면역결핍 마우스는 전임상연구에서6,7,8에허용되는 동물 모델이다. 2000 년대 초반에 인간화 된 마우스의 도입 이후, 담즙 정체 인간의 간 독성의 여러 전임상 연구, HIV-1 및 HIV 관련 신경 인지 장애를 포함한 인간 특정 병원체, 엡스타인 바 바이러스, 간염, 기타 감염성 질환은, 이들 마우스6,9,10,11에서조사되었다. CD34+ HSPC 및/또는 인간 간세포 이식에 대한 다중 마우스 모델은 오랫동안 개발되어 왔으며 시간이 지남에 따라 B형 간염 바이러스(HBV)-관련 간 질환의 질병 발병기전을 연구하기 위해 개선되었습니다12. 13세 , 14. HSPC 및 인간 간세포 (HEP) 이식에 대한 여러 모델은 NOG (NOD)로 알려진 균주를 기반으로합니다. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13,NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15,Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12,및 fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull 마우스16. 그러나 각 모델에는 고유한 장점과 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, BALb/C-Rag2-/- γc-/- 배경상에 있는 HEPs 및 인간 줄기 세포(HSC)를 위한 AFC8 이중 인간화 마우스는 면역 세포와 HSC의 성공적인 생착을 가능하게 하지만 항원 특이적 T-및 B 세포의 부재가 있습니다. 이 모델12의응답 . 이중 인간화 마우스를 재구성하는 주요 관심사는 최적이 아닌 생착, 다른 조직을 지원하기위한 적합한 모델의 부족, 불일치 조건, 면역 거부, 또는 이식편대- 숙주 질환 (GVHD) 및 기술 신생아와 함께 위험한 조작과 신진 대사 이상으로 인한 높은 사망률과 같은 어려움13.
인간화마우스는17, 18,19년동안 HIV 연구에 사용되어 왔지만, HIV-1에 의한 간 손상을 연구하기 위해 인간화된 마우스의 사용은20개에제한되어 왔다. 우리는 이전에 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델의 설립과 HIV 관련 간 질환에 그것의 응용 프로그램의설립을보고 8. 이 모형은 간 및 면역 세포의 강력한 생착을 보여주고 HIV 감염 병인을 되풀이합니다. 이 토론은 인간 간세포의 이식에 있는 가장 중요한 단계를 포함하여 상세한 프로토콜을 제출합니다. HEPs의 성공적인 생착 및 TK-NOG 마우스에서 기능성 면역 계통의 확립에 필요한 HSPC에 대한 설명도 제시된다. HIV 관련 간 면역요법을 연구하기 위하여 이 마우스의 사용은 상세한입니다. 간특이적 포진심플렉스 바이러스 타입 1티미딘 키나아제(HSV-TK)를 운반하는 TK-NOG 수컷 마우스가 이식유전자를 사용한다. 이 이식유전자를 발현하는 마우스 간 세포는 GCV의 비독성 용량에 잠깐 노출된 후에 쉽게 절제될 수 있다. 이식된 인간 간 세포는 외인성 약물 없이 마우스 간 내에서 안정적으로유지된다(21). 마우스는 또한 인간 세포에 대한 마우스 골수에 틈새 시장을 만들기 위해 treosulfan의 비myeloablative 복용량으로전제조건8. 면역결핍 TK-NOG 마우스는 HEPs 및 다능성 HSPC로 경내 주사된다. 마우스는 혈액 면역 phenotyping 및 혈청 인간 알부민 수준의 측정에 의해 혈액과 간 재구성을 위해 정기적으로 모니터링됩니다. 인간 면역 세포와 HEPs 둘 다에 대해 15% 이상의 성공적인 재구성을 가진 마우스는 복강 내 HIV-1로 주입됩니다. 간장에 대한 HIV의 효과는 감염 후 4 - 5 주 일찍 평가 할 수 있습니다. HIV-1이 사용되기 때문에 바이러스를 처리하고 마우스에 주입하는 동안 필요한 모든 예방 조치를 취해야합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 네브래스카 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 동물 실험을 수행하기 전에 현지 IACUC의 승인을 얻으실 수 있습니다.
1. 배꼽 제대혈 의 처리 와 인간 HSPC의 격리
- 층류 캐비닛의 멸균 조건하에서 프로토콜의 모든 단계를 수행합니다.
- 헤파린화 된 튜브에서 수집 된 탯줄 혈액 (CB)을 취하고 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가하여 최대 35 mL의 부피를 만듭니다. 그림 1에 도시된 바와 같이 림프구 분리 배지(LSM) 위에 샘플을 층화하고 4°C에서 4°C에서 35분 동안 400 x g의 적층 CB로 LSM을 원심분리합니다.
참고 : 인터페이스에서 혼합하지 않도록 조심스럽게 부드럽게 혈액을 희석. - 상부 LSM 및 플라즈마 층을 조심스럽게 제거하고 전사 파이펫을 사용하여 흰색 버피 코트 인터페이스를 새 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 제거합니다.
- 30- 40 mL의 얼음-차가운 완충제(PBS + 0.5% 소 혈청 알부민 [BSA] + 2 mMM에 에틸렌디아미네테트라아세트산 [EDTA])에 버피 코트를 다시 중단시켰다. 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션의 20 μL과 0.4% 트라이판 블루 및 피펫 10 μL의 혼합물을 카운팅 슬라이드의 두 챔버 중 하나의 외부 개구부로 결합하고 셀을 계수하는 자동화된 셀 카운터에 슬라이드를 삽입합니다.
참고: 세포를 생존할 수 있도록 모든 단계에서 얼음 처럼 차가운 버퍼를 사용 하십시오. - 세포를 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 상월체를 조심스럽게 흡인한다. 그런 다음 300 μL의 얼음 차가운 버퍼를 추가합니다.
- 최대 1 x 108 셀에 대한 인간 Fc 수용체 차단 시약 100 μL 및 단일 클로날 마우스 항 인간 CD34 항체 공액 마이크로 비드 100 μL을 추가합니다 (재료 표참조). 4 °C에서 30 분 동안 배양하고, 세포를 세척하기 위해 얼음 차가운 완충액 10 mL을 추가하고, 4 °C에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기를 추가합니다.
참고: 1 x 108 셀이 존재하는 경우 셀 수에 따라 이 것을 확장하십시오. - 상판을 조심스럽게 제거하고 500 μL의 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단하고 자성 분리 단계를 진행하여 HSPC를 풍부하게합니다.
- 자기 활성화 셀 정렬 필드에 양수 선택 LS 열(재료 표참조)을 배치하고 3mL의 버퍼로 통과합니다.
- 샘플에서 인간 CD34+에 결합된 마이크로비드를 포획할 수 있는 LS 컬럼에 샘플을 로드하고 중력의 영향으로 수집 튜브로 흐르도록 합니다.
- 완충액으로 컬럼 3x를 세척하고 CD34의 동일한 수집 튜브에서 용루를 수집- 세포의 분율.
- CD34+ 셀을 새 컬렉션 튜브에 용해시키기 위해 5 mL의 버퍼로 컬럼을 급락시다. >90%의 순도를 달성하기 위해 절차를 반복합니다.
- 혈세포계에서 트라이판 블루 염료를 사용하여 용출 된 CD34+ 세포를 계산합니다. 계산 한 후 CD34+ 세포를 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 상한자를 버립니다.
- 동결 배지에서 1-2백만/mL의 농도로 세포를 이식또는 냉동 보존에 즉시 사용할 주사를 위해 PBS의 25 μL에CD34+ 세포를 다시 일시 중단합니다(로스웰 파크 기념 연구소 매체 [RPMI 1640 배지] + 50% 태아 소 혈청 (FBS) + 10 % 디메틸 설폭사이드 [DMSO]) 이식에 추가 사용을 위해.
참고: 이식에 사용하기 전에 항상 생존 가능한 세포를 다시 이야기하십시오. - CD34+ 용황의 순도를 확인하려면, 현탁액의 50 μL을 취하고 4 °C에서 30 분 동안 PE 컨쥬게이트 항 인간 CD34 항체의 10 μL로 배양하십시오. 항체 배양 후, 염색된 세포를 PBS로 세척하고, PBS의 100 μL에서 이를 재중단한 다음, 유세포측정을 진행한다. 유세포계에서 게이트를 설계하기 위해 항체가 없는 세포의 튜브를 추가합니다.
- 수집 후, 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 플롯에서 관심 영역을 선택한 다음 FSC 영역 및 FSC 높이 플롯에서 단일 셀에 대한 게이팅을 선택하여 데이터를 분석합니다. PE 채널 및 SSC 영역 플롯에서 단일 셀에 게이트 CD34 양성 세포.
2. 이식용 인간 간세포 의 준비
- 액체 질소에서 냉동 보존 된 간세포를 제거하고 수조에서 유리병을 신속하게 침수하고 약 90 - 120 s용 해동하십시오.
- 바이알 캡을 제거하고 해동된 간세포를 데운 해동 매체의 50 mL 원엽 튜브에 붓습니다.
- 50 mL 튜브를 몇 초 동안 손으로 흔들어 세포를 일시 중단하십시오.
참고: 튜브를 소용돌이하지 마십시오. - 실온에서 8 분 동안 100 x g에서 세포를 펠렛. 0.1% BSA로 PBS에서 펠릿 세포를 세척하고 80 μL/마우스의 최종 부피에서 PBS에서 신선하거나 해동된 HSPC(비율 10:1)로 풀을 합니다.
3. 인간 HSPC 및 간세포 이식에 대한 동물 취급, 선별, 지질 기능 미성년 및 치료
- 동물 취급
- 심한 면역 결핍의 결과로, 품종, 집, 무균 조건하에서 TK-NOG 마우스를 처리.
- 항상 실험실 코트, 장갑, 신발 커버 및 잠재적으로 병원성 미생물과의 감염을 방지하기 위해 얼굴 마스크를 착용하십시오.
- 수술에 멸균 장갑과 악기를 사용하고 수술 내내 동물을 무균처리하십시오.
- 실험을 위한 TK-NOG 마우스 선택
- TK-NOG 균주 콜로니를 수컷 비-TK-NOG 리터메이트와 암컷 TK-NOG 마우스를 사육하고 유전자 변형에 의해 형질전환 자손을 선택한다.
참고: 유질 검사를 수행 (단계 참조 3.3) 유동시에 신생아 남성 및 여성 마우스에서 이식 유전자의 존재 또는 부재를 결정합니다. - HSV-TK 이식유전자 발현 간세포21의GCV 매개 고갈에 대한 높은 민감도 로 인해 이식에 대한 6-8주에서 남성을 선택한다.
- 귀 태그 마우스를 귀 에 이의를 쉽게 식별하기 위해 위닝 또는 수술시. 동물의 체중과 건강 상태를 기록하십시오.
- TK-NOG 균주 콜로니를 수컷 비-TK-NOG 리터메이트와 암컷 TK-NOG 마우스를 사육하고 유전자 변형에 의해 형질전환 자손을 선택한다.
- 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 HSV-TK 이식유전자의 존재에 대한 유전자 변형
- (일반적으로 3 - 4 주에) 위닝시 에 헤비 티핑을 수행합니다. 게노티핑의 경우, 마우스 귀의 조각을 층류 생물학적 안전 캐비닛에 잘라 멸균을 유지하고 게놈 DNA 분리 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다.
- 20 μL 반응 혼합물에서 귀조각에서 추출된 게놈 DNA증폭은 HSV-TK 트랜스유전자를 위해 인간 알부민 프로모터의 제어하에 1 μL의 전방 프라이머 5'-CCATGCACGTCTTTGG-3', 1 μL의 역프라이머 5'-TAAGTTGCGCGCGCGC-3', 0.5l의 FAM 프로브 5′-FAM-AATCGCCCCGC-3', 및 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)계측기(22)에대한 마스터 믹스의 10 μL.
- 다음과 같이 실시간 PCR 설정을 설정합니다: 30s에 대한 60°C(프리레드 스테이지), 10분 동안 95°C(홀드 스테이지), 15s용 95°C의 40°C, 1분 동안 60°C(PCR 단계), 30초용 60°C(포스트레드 스테이지).
참고: 임계값(Ct)의 주기는 HSV-TK 이식유전자에 대해 양성으로 간주됩니다.
- 간시클로비르와 트레오술판을 이용한 치료
- 27 G 바늘을 사용하여, TK-NOG 마우스를 복강 내 GCV 주사로 주입 (6 mg/kg) 하루에 2 x 7 일째에 및 식염수의 100 μL에 5 에 100 식염수의 생쥐의 형질 전환 실세포를 고갈 (그림 2의실험 전략에 도시 된 바와 같이)23 .
- 수술 전 3일, 2일 및 1일, 27 G 바늘을 사용하여 식염수 100 μL에서 treosulfan (1.5 g/kg/day)의 비근육내 투여량으로 마우스를 미리 조건화한다.
- 수술 하루 전, 5 mm 랜싯으로 찌르면 하악 정맥에서 혈액을 2 ~3 방울 (~100 μL)하고, 알라닌 아미노 트랜스퍼 라제 (ALT)를 평가하기 위해 원심 분리 (4 °C에서 10 분 동안 1,500 x g)로 혈청을 분리합니다. 간 손상의 ee.
- 수술 준비
- 수술 전에 클리퍼를 사용하여 절개 부위(복막 벽 왼쪽)를 둘러싼 마우스의 털을 면도합니다.
- 마우스 마취 기계를 사용하여 유도 챔버에서 산소 흐름을 1 L / min으로 조정하고 이소플루란 흐름을 3 % - 5 %로 조정하십시오. 마취를 위한 유도 챔버에 한 번에 한 개의 마우스를 놓습니다.
- 멸균 연장 튜브의 한쪽 끝(현탁액 의 보유 용량 550 μL; 사양에 대한 재료 표 참조)을 30G 바늘에 연결하고 다른 쪽 끝은 1mL 주사기에 부착합니다.
- 풀링된 HEPs 및 HSPC(섹션 2 참조)의 서스펜션(80 μL/mouse)으로 주사기를 채우고, 반복적인 디스펜싱 파이펫의 노치에 주사기를 맞추고, 디스펜서를 조정하여 각 프레스에서 10 μL을 분배합니다.
- 일단 마우스가 마취되면 (보통 3 - 4 분 후), 이소플루란 흐름을 코콘으로 전환하고 이소플루란 유량을 2 % - 3 %로 줄입니다.
- 마우스에 있는 인간 HSPC 그리고 간세포의 경내 이식
- 멸균 조건하에서 층류 캐비닛에서 모든 수술 단계를 수행합니다.
- 깨끗한 멸균 드레이프를 작업 표면에 놓고 각 마우스의 왼쪽을 10 % 포비도 요오드로 문질러 70 % 이소 프로필 알코올을 제거한 다음 절개를하십시오.
- Vanna의 형 가위로 복막 벽 왼쪽의 피부, 근육 및 복막에 작은 절개 (~1 - 1-1.5 cm 및 깊이 5mm)를 만들어 흉막 케이지의 아래쪽 가장자리보다 약 5mm 아래복 구멍에 들어갑니다.
- 비장을 찾아서 집게로 약간 당겨 서 쉽게 접근할 수 있도록 30G 바늘을 비장의 하부 기둥에 삽입합니다.
- 디스펜싱 파이펫의 플런저를 잠금 해제하고 비장당 60 ~ 80 μL의 제한으로 한 번에 부피 10 μL을 분배합니다. 바늘을 천천히 후퇴시키고 결찰 을 사용하여 클립을 결찰하여 비장을 클립합니다.
- 멸균 된 PBS로 적신 면 팁 어플리케이터로 비장을 다시 신체 구멍으로 밀어 넣습니다.
- 흡수성 봉합사 중단 봉합사 패턴을 사용하여 복벽의 근육 층을 닫습니다 (연속적이지 않음). 흡수할 수 없는 봉합사를 사용하여 중단된 봉합사 패턴으로 피부 폐쇄를 달성합니다.
- 수술 후 저체온증으로부터 마우스를 보호하기 위해 따뜻한 물 순환 패드를 사용합니다.
- 수술 후 10-14일 후에 흡수할 수 없는 봉합사를 제거하십시오.
- 수술 후 치료
- 이식된 동물이 깨어나면, 진통 부프레노르핀(0.1 mg/kg)을 복강 내로 주입하고, 하루 에 2회 연속 3일 동안 주사하십시오.
- 동물이 정상적인 신체 상태로 돌아올 때까지 하루에 적어도 1 회 관찰하십시오.
참고: 일부 마우스는 수술 후 체중을 잃을 수 있기 때문에 각 동물의 체중을 확인합니다. 마우스는 전형적으로 1 2 주에 있는 그들의 본래 무게를 회복합니다.
4. ELISA에 의한 인간 간 이식 검증 및 유세포 측정에 의한 인간 면역 체계
참고: 인체 간 및 면역 계통의 재구성을 매달 평가하고, 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA) 및 유세포 분석에 의한 이식 후 1개월 후부터 각각 평가한다.
- EDTA 관에 있는 랜싯을 사용하여 하정맥 정맥에서 혈액 샘플을 수집하고, 4°C에서 10분 동안 1,500 x g에서 원심분리기를 채취합니다. 인간 알부민 수준을 확인하기 위해 인간 알부민 수준을 확인하여 인간 간이식 에 대한 마우스 간 생착 효율을 평가하고, 인간 알부민 ELISA 정량 세트(재료 표참조)를 이용하여 제조사의 지침.
참고: 펠릿을 폐기하지 말고 유세포 분석용 펠릿 세포를 사용하여 인간 면역 체계 재구성을 평가한다. - FACS 완충액(PBS + 2% FBS)의 35 μL에서 혈청 없이 세포 펠릿을 다시 일시 중단하고 5 μL의 마우스 특이적 CD45(농도 0.5 mg/mL), 5 μL로 염색했습니다. 각 인간 특이적 항체 CD45(0.1 mg/mL), CD3(0.2 mg/mL), CD8(0.1 mg/mL), CD19(0.5 mg/mL) , CD4(0.25 mg/mL) 및 CD14(0.25 mg/mL)의 20 μL을 각각 4°C에서 30분 동안,CD34+ HSPC로부터 기능성 면역 체계의 발달을 점검하였다.
참고: 염색되지 않은 세포의 게이팅을 결정하기 위해 얼룩이 없는 세포의 튜브를 하나 더 추가하는 것을 고려하십시오. - 배양 후, 폴리스티렌 바닥 유동 세포 분석 튜브에 스테인드 서스펜션(~100 μL)을 옮기고 1x 용해 완충액 2mL(재료 표참조)를 사용하여 10x 용해 완충제의 1부분을 희석하고 9부분의 증류수와 배양 10-0-0 적혈구를 15 분 동안 적혈구를 포리합니다.
참고 : 적혈구 포액을 평가하기 위해 탁도를 관찰하십시오. 샘플이 명확해지면, lysis가 완료됩니다. - 용해 후, 펠릿을 얻기 위해 4°C에서 300 x g에서 300 x g에서 FACS 완충제 3 mL을 첨가한다. 펠릿 및 원심분리기에 3 mL의 FACS 버퍼를 추가하여 세척을 반복하고 300 x g에서 4°C에서 5분 동안.
- 새로 만든 1% 파라포름알데히드(PFA)에서 세포를 고정시키고 유동 세포계에 염색된 세포를 획득하고, 유량 소프트웨어로 분석하였다.
- 분석을 위해 FSC/SSC 플롯에서 림프구 게이팅을 선택한 다음 FSC 영역/FSC 높이에서 단일 셀 게이팅을 선택합니다.
- 또한, 단일 세포 집단상인간 특이적 CD45(hCD45)에 대한 게이트및 뮤린 기원의 세포의 배제를 위한 마우스 특이적 CD45(mCD45)를 포함한다. 스테인드 되지 않은 세포의 게이팅에 따라 스테인드 집단의 게이팅을 전략화합니다.
- 게이트 hCD45+ 셀은CD3+ T 세포 및 CD19+ B 세포의 빈도를 결정한다. 게이트 T 셀은 CD4 및 CD8 서브세트를 결정한다. 단핵구를 평가하기 위해 hCD45의 게이트를 사용하여 CD14+ 단핵구를 결정합니다.
5. TK-NOG 마우스의 HIV 감염과 인간의 간 및 면역 체계에 미치는 영향
- 지정된 생물 안전 수준 2 시설에서 HIV-1 바이러스 및 모든 감염된 마우스를 처리합니다.
주의 사항: 이중 생물학적 위험 봉투에 모든 HIV 감염 폐기물을 오토클레이브하고 폐기하십시오. 안전상의 이유로, HIV에 감염된 마우스를 건네면서 절단 방지 장갑을 착용하십시오. - 바이러스를 다루는 동안 일회용 커버올 가운, 신발 커버, 얼굴 마스크 및 이중 장갑을 포함한 개인 보호 장비(PPE)를 항상 착용하십시오.
- 인간 CD45+ 세포의 15% 이상의 재구성을 가진 마우스를 선택(단계 4.7에서 시험) 및 HIV-1 감염을 위한 혈청에 인간 알부민의 존재 (단계 4.1에서 시험).
- 마우스를 1 x 103 대 1 x 104 조직 배양 전염성 용량 50 (TCID50)HIV-1ADA를 마우스 당 100 - 200 μL의 부피로 주입하고 복강 내로 주입한다.
- 이소플루란(isoflurane)을 사용하여 감염 후 5주 동안 HIV에 감염된 마우스를 안락사시킵니다(이소플루란 증기 농도 >5%).
- 마우스를 안락사 한 후, 혈청의 격리를위한 심장 천자에 의해 EDTA 튜브에 혈액을 수집, ELISA에 의해 인간 특정 알부민 수준을 평가하여 간HIV-1의 효과를 볼 수 (단계 4.1 참조) 및 혈액 세포는 인간의 면역의 변화를 확인 유세포 분석기를 사용하는 세포(단계 4.2 - 4.8 참조).
참고: 마우스가 감염되었는지 확인하기 위해 바이오 분석기에서 감염 후 5 주 말초 바이러스 부하를 평가하십시오. - 혈액을 뽑은 후 안락사 된 마우스에서 간을 절제하십시오.
- 간 절제의 경우, 자시포이드에서 피부, 근육 및 복막에 1.5 - 2cm 길이 및 0.5 cm 깊이의 절개를하여 복강을 노출하십시오. 간과 횡격막 사이의 척추에 수직으로 절단합니다. 간을 들어 올리고 위장과 내장에 부착하는 막을 끊습니다.
- 하룻밤 동안 4% 파라포름알데히드에서 간을 수집하고 고치고 표준 면역성 화학 프로토콜을 따라 인간 특이적 CK18 항체8을사용하여 CK18+ 간세포에 대한 HIV의 효과를 평가하였다.
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Representative Results
인간의 간 및 면역 세포를 가진 이중 인간화 마우스 모형의 설치는 각각 아주 간단한 ELISA 및 유세포 측정을 가진 각 단계에서 쉽게 감시될 수 있습니다. 유세포측정은 기능성 면역 계통의 발달을 평가하고 면역 세포에 대한 HIV 감염의 효과를 보기 위해 정기적으로 수행된다. 이중 인간화 마우스에서 기능성 면역 세포의 발달은 림프구 게이트의 15 %에서 90 %까지 다양할 수 있습니다. 면역 세포의 대표적인 서브세트는 도트 도표에 나타내다(그림3). 인간 간세포의 생착의 평가를 위해, 인간 특이적 알부민 수준에 대한 ELISA는 마우스 혈청에서 매월 수행된다. HSPC 와 HEPs 둘 다로 이식된 마우스는 한 달에 ~ 7 μg/mL에서 377 μg/mL에 이르는 인간 특이적 알부민 수준을 나타내며, 관찰 시간 동안 계속 증가합니다(6개월)(그림4). 이중 인간화 마우스의 혈액에서 인간 면역 세포에 HIV 감염의 효과 유세포 측정및 인간 특정 알부민 ELISA에 의해 간에서 HEPs에 모니터링. 5주에 의해, HIV-1은 ELISA에 의해 평가된 바와 같이 혈청내의 인간 알부민 수치의 감소를 야기하고, 면역성화학에 의해 평가된 바와 같이 이중 인간화 마우스의 간 절편에서 인간 CK18+ 간세포의 고갈이 있다(도5). CD4:CD8의 더 낮은 비율은 전형적으로, 유세포측정에 의해, HIV 감염 마우스의 혈액 및 간에서, 감염 전 동일한 마우스에서 언급된 수준에 비해 관찰된다(도6). 프로토콜에 중요한 모든 시약 및 재료는 재료 표에서설명합니다.
그림 1 : CD34+ 제대혈세포의 농축도. (A)제대혈을 림프구 분리 배지(LSM)에 적층하고 원심분리하여 버피 코트를 분리한다. (B)LS 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓고 BSA 버퍼로 헹구고 버피 코트를 추가합니다. CD34에 대한 양성 세포는 컬럼에 갇혀 있고, CD34-세포는 별도의 튜브에서 용출된다. 컬럼 수지에 갇힌 CD34+ 세포는 플런저로 급락하고, 세포는 새로운 튜브에서 수집된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 인간화된 간 및 면역 체계 마우스의 이중 재구성을 위한 실험 설계의 개략적 관점, HIV-1 감염이 뒤따릅니다. TK-NOG 마우스는 간시클로비르(GCV)를 6 mg/kg, 하루 2회, 1일-7일 및 -5일째에 주입한 다음, 1일째 -3, -2 및 -1일에 treosulfan 주사를 실시한다. 이식(Tx)을 위한 마우스를 스크리밍하기 위해, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 분석제가 수술 1일 전에 수행되고, ALT 수준과 >200 및 <600 U/L의 마우스가 선택된다. 이식 후, 마우스는 유세포측정(FACS)에 의해 인간 면역 계통의 재구성을 검사하고 ELISA를 사용하여 알부민 수준을 평가하여 간 재구성을 확인하였다. 마우스는 HIV-1 5 주 전에 희생되기 전에 감염됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 혈액의 인간 세포 분포를 위한 유세포 분석 분석 게이팅 전략. (A)첫째, 림프구는 FSC-A 및 SSC-A를 기반으로 전혈에 문이 매착됩니다. (B)단일 세포는 림프구에 문이 있습니다. (C)인간 CD45+ 백혈구는 마우스 CD45 및 인간 CD45를 사용하여 단일 세포에 게이트된다. (D)CD3+ T 세포 및 CD19+ B 세포는 문이 닫힌 CD45+ 인간 백혈구에서 확인된다. (E)CD4+ T 도우미 세포 및 CD8+ 세포 독성 T 세포는 문이 있는 CD3+ T 세포에서 확인된다. (F)CD14+ 단핵구는 인간 CD45+ 백혈구로부터 게이트됩니다. 여기에 표시된 결과는 이중 인간 간세포 및 HSPC로 이식된 한 마우스에서 나온 것입니다.
그림 4 : 알부민 농도는 이중 인간화된 마우스의 혈청에서 ELISA에 의해 측정됩니다. 마우스는 인간 간세포(HEPs) 및CD34+ 조혈줄기/전구 세포(HSPC) (n=11)로 이식된다. 혈청은 이식 후 1, 4 및 6 개월에서 다른 시간에 수집되며, 희석은 표준 범위에서 알려지지 않은 샘플 농도를 조정하기 위해 만들어집니다. 각 기호는 개별 마우스 값을 나타냅니다. 결과는 개별 값뿐만 아니라 중앙값을 나타냅니다. * P < 0.05, 단방향 ANOVA. 이 그림은 다구르 외8에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : HIV-1이 혈청의 알부민 수치에 미치는 영향과 이중 인간화된 마우스의 간에서 CK18+ 인간 간세포의 고갈. (a)알부민 농도는 1 및 4개월에 인간 HEPs 및 HSPC 둘 다로 이식된 감염되지 않은 마우스(n=9)에서 모니터링된다. 마우스는 4-5개월 이식 후 HIV로 감염되고 감염 후 5주 동안 희생된다. 각 기호는 개별 마우스 값을 나타냅니다. 결과는 개별 값뿐만 아니라 중앙값을 나타냅니다. * P < 0.05, 단방향 ANOVA. 이 그림은 다구르 외에서 수정되었습니다. 8.. - B) 감염되지 않은 (HEPs + HSPC, 왼쪽 패널) 및 HIV 감염 TK-NOG 마우스 (HEPs + HSPC + HIV, 오른쪽 패널)에서 5 미크론 간 절편은 고정, 파라핀 내장, 및 항 인간 시토 커라틴-18 (CK18) 항체에 대한 염색. CK18+ 간세포의 고갈을 일으키는 HIV-1은 CK18+ 인간 세포에 의해 덜 점유된 영역에 의해 입증된다. 여기에 표시된 결과는 이중 인간 간세포 및 HSPC로 이식된 감염되지 않은 마우스 1개및 HIV 감염 마우스 1개에서 나온 것입니다.
그림 6 : CD4+ 세포와 CD8+ T 세포의 비율과 이중 재구성된 감염되지 않은 마우스및 HIV-1 감염 마우스의 간에서. 이중 재구성되지 않은 감염되지 않은 마우스의 경우: 닫힌 원; HEPs + HSPC; 혈액 n = 7; 간 n = 6. HIV-1 감염된 마우스의 경우: 열린 원; HEPs + HSPC + HIV; 혈액 n = 10; 간 n = 11. 결과는 개별 값뿐만 아니라 중앙값을 나타냅니다. * P < 0.05, HIV 감염 및 감염되지 않은 마우스 사이의 단방향 ANOVA 테스트. 이 그림은 다구르 외8에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
간은 HIV에 감염된 환자24에서손상되고 손상됩니다. HIV-1의 존재에 있는 인간적인 간 질병을 공부하기 위한 실험적인 작은 동물 모형은 CD34+ HSPC 및 간세포7,12를가진 몇몇 공동 이식한 동물 모형의 가용성에도 불구하고, 극단적으로 제한됩니다 25. 시험관 내 실험에서, 간세포는 낮은 수준의 HIV-1 감염(26)을가지고 있는 것으로 나타났다. 인간 세포의 두 모형을 전송하는 인간화한 마우스는 바람직한 모형입니다. 인간 면역계로만 재구성된 마우스의 간은 인간 조절 T 세포의 실험적 고갈하에 HIV 감염에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다20,27. 그러나, 마우스와 인간 간세포의 면역 성 및 기능적 특성의 차이는 HIV-1 및 면역 세포에 대한 반응의 차이를 강조 할 수있다. 이 검토에서, 프로토콜은 인간 면역 계통 및 간 둘 다를 재구성하고 HIV-1 감염한 환자에서 관찰된 것과 같이 HIV-1 관련 간 면역 병리학을 해결하기 위하여 기술됩니다. TK-NOG 수컷 마우스는 HSV-TK 이식유전자의 간 선택적 높은 mRNA 발현 및 마우스형질전환간(21)에대한 GCV 독성의 감수성 으로 인해 선택되었다. 더욱이, 이들은 외인성 약물을 사용하지 않고 이식 후 장기간 유지될 수 있으며 자발적인 전신질환(28)을개발하지 않는다. 인간의 면역 체계와 간 재구성을 확립하기 위해, TK-NOG 수컷 마우스 13에 앞서 나타난 바와 같이, 마우스 면역 계통의 절제 및 마우스 특이적 간 세포에 대한 손상이 필요하고 treosulfan 및 GCV의 비myloablative 복용량을 사용하여 달성된다 ,23. 마우스는 6-8주 령에 GCV 및 treosulfan을 주입하고, ALT 수준에 의해 평가된 바와 같이 이식유전자 및 GCV 유도 간 손상의 발현이 최적이며, 이어서, 틈새-이식된 인간세포(21)를제공한다. >200 U/L의 ALT 수준을 나타내는 마우스,하지만 <600 U/L, 일반적으로 이식에 대 한 선택. >600 U/L의 ALT 수준을 보여주는 마우스는 인간의 간세포가 손상된 마우스 간 기능을 구출 할 수 없습니다으로 죽음의 더 큰 위험에 있습니다.
현재, 이중 인간화는 인간 CD34+ HSPC 및 태아 간 세포의 이식에 의해 도시된다; 그러나, 신생아 동물의 조작은 기술적 인 문제를 만듭니다13,14. HSPC는 태아 간 세포 (FLC), 배아 줄기 세포 (ESCs) 및 CB와 같은 다중 근원에서 파생되거나 단리될 수 있습니다. 그러나 윤리적 문제는 ESC와 FLC의 사용을 제한합니다. CB는 이러한 제한이 없으며 HSPC를 얻기위한 가장 유용한 대안일 뿐만 아니라 기능적 면역을 재구성 할 수있는 원시 조혈 줄기 및 전구 세포의 귀중한 공급원입니다. 시스템. HSPC의 수율은 나이에 의해 높게 영향을 않기 때문에 코드 혈액은 HSPC를 격리하기 위하여 이용될 때 1 일 보다는 더 오래 되어서는 안됩니다. 분리된 HSPC의 순도는 세포를 냉동 보존하기 전에 검사해야 합니다. CD3+ T 세포의 교차 오염은, 불일치하는 세포로 이식하는 동안 전신 마우스이식-대-숙주질환 및 급성 allorejectioned로 이어질 수 있기 때문에 피한다.
시판되는 간세포는 간 재구성을 위한 공급원으로 사용되었고8,13. 성인 간세포는 장기간 의 장생 및 지속 가능성의 증가된 효율성으로 인해 간 재구성을 확립하는 데 바람직하다29.
마우스 모델에서 인간 면역 계통의 존재는 이전에30,31에도시된 바와 같이 ALB 수준을 증가시켰습니다. 그러나, 간세포 및 면역 계통 재구성의 효율성은 기증자 세포의 다른 근원으로 변화할 수 있고 수신자 마우스에 달려 있습니다. 따라서 각 마우스는 생착에 대해 평가되어야 하며, 가장 중요한 부분은 인간특이적이며 마우스 세포와 상호 반응하지 않는 항체 또는 시약을 활용하는 것입니다. 여기에 제시된 연구에서 사용된 인간 특이적 시약 및 항체는 재료 표에상세히 설명되어 있다. 재료 표에 제공된 항체 이외의 항체가 연구에 사용되는 경우, 인체 특이성을 확인하십시오.
최적의 상태는 합성 세포의 이식이 될 것이다; 그러나, 그것은 기술적으로 달성하기 어렵다. 가능한 경우, HSPC및 간세포는 부분적으로 일치하는 인간 백혈구 클래스 1 항원 (HLA-A2 등)을 가진 기증자로부터 풀링되어야합니다.
HIV 연구를 위한 마우스를 가리기 위하여는, 혈액은 최적 면역 및 간 재구성을 결정하기 위하여 다중 시간 점에서 그려집니다; 유세포 측정및 ELISA는 소량의 혈액만으로 수행될 수 있기 때문에 바람직합니다. 동일한 샘플에서 혈액 세포 와 혈청은 각각 유세포 측정 및 ELISA에 사용될 수 있었다. 알 수 없는 농도가 표준 농도 범위(키트 범위: 6.25 - 400 ng/mL) 내에서 가져올 수 있도록 ALB 수준을 평가하기 위해 각 시점(1,000- 40,000 범위)에서 혈청의 적절한 희석을 하는 것이 중요합니다.
인간 면역 계통의 존재에 있는 HIV-1 감염에 응하여 전염증성 사이토카인은 또한 간세포 및 면역 세포의 상호 작용을 해결에 유용할 수 있습니다. 이 모델은 HIV-1 유도 간 질환의 면역 병기 발생을 보여주는 데 유용하며, 인간과 동일한 방식으로 간 손상을 재현한다는 점을 감안할 때 CD4:CD8의 낮은 비율, ALB 수치의 감소, 인간 간세포 사망 및 간 면역 성 면역 활성화. 모델은 또한 세포 독성 T 세포 활성의 낮은 수준 및 손상된 면역 글로불린 클래스 스위칭과 같은 몇 가지 제한사항이 있다. 인간 면역 계통 및 간 둘 다의 존재 때문에, 여기에서 제시된 모형은 HIV-1와 간염 바이러스, 만성 간염 감염 (항 간염 면역 반응의 기계장치를 명확히 하기 위하여) 및 간경변으로 의 한 증정을 위해 유망합니다 모델.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건 원 보조금 R24OD018546에 의해 지원되었다 (L.Y.P. 및 S.G.에). 저자는 외과 적 절차에 도움을 Weizhe 리, 박사, 박사, 아만다 지점 우즈, B.S., 면역 신체 에 대한 얀 청, UNMC 흐름 세포 분석 연구 시설 회원 이사 필립 헥슬리, 박사, 빅토리아 B. 스미스, B.S., 및 사만다에 도움을 감사드립니다 월, B.S., UNMC 고급 현미경 핵심 시설 회원 제니스 A. 테일러, B.S., 제임스 R. Talaska, B.S., 기술 지원을 위해. 저자는 TK-NOG 마우스와 테오술판을 제공하는 요아킴 바움가르트 박사를 제공한 CIEA의 이토 마모루 박사와 스에미즈 히로시 박사를 인정합니다. 저자는 원고에 그녀의 편집 기여에 대한 박사 아드리안 Koesters, UNMC, 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
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