定量杀伤细胞免疫球蛋白样受体 (kir) 半自动分型 (qkat) 是一种简单、高通量、经济高效的方法, 用于复制数字型kir基因, 用于人群和疾病关联研究。
杀手细胞免疫球蛋白样受体 (kir) 是一组抑制和激活免疫受体, 对自然杀伤细胞 (nk) 和 t 细胞, 编码的多态性基因群在染色体19。他们最典型的配体是人类白细胞抗原 (hla) 分子, 这些分子被编码在6号染色体上的主要组织相容性复合体 (mhc) 位点内。有大量证据表明, 它们在免疫、生殖和移植中发挥着重要作用, 因此拥有能够准确对它们进行基因型的技术至关重要。然而, 高序列同源性, 以及等位基因和拷贝数的变化, 使得很难设计出能够准确和有效地基因型所有kir基因的方法。传统方法在获得的数据的分辨率、吞吐量、成本效益以及设置和运行实验所需的时间方面通常受到限制。我们描述了一种称为定量kir半自动分型 (qkat) 的方法, 这是一种高通量多重实时聚合酶链反应方法, 可以确定kir位点中所有基因的基因复制数。qkat 是一种简单的高吞吐量方法, 可以提供高分辨率的 kir拷贝数数据, 可进一步用于推断包含这些数据的结构多态型单倍型中的变化。这个拷贝数和单倍型数据可以有利于研究大规模疾病关联、群体遗传学, 以及调查 kir和hla之间的表达和功能相互作用。
在人类中, 杀手免疫球蛋白样受体 (kir) 位点被映射在白细胞受体复合体 (lrc) 内19号染色体的长臂上。这个位点的长度约为 150 kb, 包括从尾部排列的 15个kb基因。目前已知的kir位点是kr2dl1, kir2dl2/kir2dl3, KIR2DL1,kir2dl5a, KIR2DL1, kir3dl1/kir3ds1 , KIR3DL1, 和两个伪基因, kir2dp1和kir3dp1。kir基因编码二维 (2d) 和三维 (3d) 免疫球蛋白样域受体, 具有短 (s; 激活) 或长 (l; 抑制) 细胞质尾, 由自然杀伤细胞和 t 亚群表达细胞。在 kir位点中表现出的拷贝数变异形成了基因含量可变的不同单倍型。非等位基因同源重组 (nahr), 由紧密的头尾基因排列和高序列同源性促成, 是提出的负责单倍型变异的机制。据报道, 全世界1、2、3、4的人群中有100多个不同的单倍型。所有这些单倍型可分为两大组: a 和 b 单倍型。a 单倍型包含 7个kir基因: kir3dl3、 kir2dl1、 KIR2DL1、 kr2dl4、KIR3DL3和KIR3DL3, 它们是抑制kir 基因和激活 kir 的基因基因 kir2ds4。然而, 多达70% 的欧洲起源的个体谁是纯合为 kir 单倍型 a 完全携带一个非功能的 “删除” 形式的kir2ds45,6。所有其他kir基因组合形成 b 组单倍型, 包括至少一个特定的kir基因kir2ds1, kir2ds2, kir2ds3, kr2ds5, kir3ds1, kir2dl2, 和kir2dl5, 通常包括两个或多个激活kir基因。
hla i 类分子已被确定为某些抑制受体 (kir2dl1、 KIR2DL1、 kr2dl3和kir3dl1) 的配体, 激活受体 (kr2ds1、 KIR2DL1、KIR2DL1、 kir2ds5和kl3ds1), 以及kir2dl4,这是一个独特的kir , 包含一个长的细胞质尾巴, 像其他抑制 kir 受体, 但也有一个带正电的残留附近的细胞外域, 这是一个常见的其他激活kir受体的特征。kir 基因和 hla 基因中的变异组合影响受体配体相互作用, 在个体7,8水平上塑造潜在的 nk 细胞反应能力。基因关联研究的证据表明, kir在病毒抗性 (例如人体免疫缺陷病毒 [hiv] 9 和丙型肝炎病毒 [hcv]10 ) 中发挥着重要作用, 移植的成功11、妊娠期疾病的风险和生殖成功12,13, 防止异基因造血干细胞移植 (hsct)后复发14, 15, 1 6日, 癌症风险17日。
高序列同源性以及等位基因和单倍型多样性的结合对准确基因分型kir基因的任务提出了挑战。kir 基因类型的传统方法包括序列特异性引物 (ssp) 聚合酶链反应 (pcr)18、19、20、序列特异性寡核苷酸探针 (ssop) pcr21, 以及矩阵辅助激光解吸电离-飞行质谱法 (aldi-tof ms)的时间22。这些技术的缺点是, 他们只提供部分洞察个人的基因型, 同时也是费力的执行。最近, 下一代测序 (ngs) 被特别应用于kir位点的类型。虽然此方法非常强大, 但运行成本可能很高, 并且进行深入分析和数据检查非常耗时。
qkat 是一种高通量定量 pcr 方法。虽然传统的方法是费力和耗时的, 这种方法可以运行近 1, 000个基因组 dna (gdna) 样本在五天内, 并给出kir基因型, 以及基因复制的数字。qkat 由10个多重反应组成, 每个反应的目标是两个kir位点和一个用于kir基因副本编号23的基因组 (stat6) 中固定拷贝数的参考基因.该检测方法已成功地应用于涉及大量人口面板和疾病队列的研究, 涉及传染性疾病, 如 hcv、1型糖尿病等自身免疫性疾病和先兆子宫炎等妊娠疾病, 并提供了遗传研究的基础, 旨在了解 nk 细胞功能1,4,24,25,26。
我们描述了一种新的半自动高通量方法, 称为 qkat, 它有利于kir基因的拷贝数分型.与 ssp-pcr 等传统方法相比, 该方法是一种改进, 后者是低吞吐量的, 只能表明这些高度多态性基因的存在或不存在。
所获得的拷贝数数据的准确性取决于多种因素, 包括 gdna 样品的质量和浓度均匀性以及试剂的质量。板上 gdna 样本的质量和准确性极其重要, 因为板上浓度的变化会导致复制编号的计算错误。由于检测是使用欧洲来源的样本集进行验证的, 来自世界其他地区的队列数据需要进行更彻底的检查。这是为了确保等位基因丢失或非特异性引物探针绑定的情况不会被误解为拷贝数的变化。
虽然检测的设计和优化是为了以高通量的方式运行, 但可以对其进行修改, 以运行较少的示例。在分析较少的样本时, 复制数量分析软件中的置信度指标会受到影响, 但如果在平板上包含具有已知kir基因复制号的控制基因组 dna 样本, 并且在平板上包含额外的样本复制, 则可以改进这种情况。包括。
对于没有液体/板处理机器人的实验室, 可以使用多通道移液器进行主混料, 也可以手动将板材加载到 qpcr 仪器中。
开发 qkat 的主要目的是创建一种简单、高吞吐量、高分辨率和具有成本效益的方法, 用于疾病关联研究的基因型 kir 。这是成功地实现的, 因为 qkat 已被用于调查kir的作用, 在几个大型疾病协会研究, 包括一系列传染病, 自身免疫性条件, 和妊娠疾病4,24,25,26岁
The authors have nothing to disclose.
该项目得到了医学研究理事会、欧洲联盟 “地平线 2020” 研究和创新方案 (第669 5551 号赠款协议) 下的欧洲研究理事会和剑桥国家卫生研究所的资助。与国家医疗服务体系血液和移植系统 (nhsbt) 合作, 在剑桥大学器官捐献和移植方面设立生物医学研究中心和 nih 血液和移植研究小组 (nihr btru)。所表达的观点是作者的观点, 不一定是国家医疗服务体系、国家人权研究所、卫生部或 nhsbt 的观点。
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |