Summary
Cuantitativa la célula de asesino inmunoglobulina-como receptor (KIR) semiautomático escribir (qKAT) es un método simple, de alto rendimiento y rentable para copiar número genes KIR de tipo para su aplicación en estudios de Asociación de población y enfermedades.
Abstract
Receptores de inmunoglobulina-como las células Killer (IIC) son un conjunto de receptores inmunes inhibidoras y activadoras, natural killer (NK) y células T, codificadas por un clúster polimórfico de los genes en el cromosoma 19. Sus ligandos mejor caracterizadas son las moléculas de leucocito humano antígeno (HLA) que se codifican en el locus de (MHC) complejo principal de histocompatibilidad en el cromosoma 6. Hay pruebas sustanciales de que juegan un papel importante en inmunidad, reproducción y trasplante, lo que es fundamental contar con técnicas que pueden con exactitud el genotipo de ellos. Sin embargo, secuencia de alta homología, así como alélica y variación en número de copias, dificulta a genotipo y eficiente los métodos de diseño que pueden exactamente todos los genes KIR . Los métodos tradicionales se limitan generalmente en la resolución de los datos obtenidos, rendimiento, rentabilidad y el tiempo necesario para establecer y ejecutar los experimentos. Describimos un método llamado cuantitativa KIR semiautomático escribir (qKAT), que es un método de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real multiplex de alto rendimiento que puede determinar el número de copia del gene de todos los genes en el locus KIR . qKAT es un método simple de alto rendimiento que puede ofrecer alta resolución KIR copia datos del número, que además permite inferir las variaciones en los haplotipos estructuralmente polimórficos que abarcan los. Estos datos copia número y haplotipo pueden ser beneficiosos para los estudios sobre asociaciones a gran escala enfermedad, genética de la población, así como las investigaciones sobre la expresión y las interacciones funcionales entre KIR y HLA.
Introduction
En los seres humanos, el asesino inmunoglobulina-como receptor(KIR) lugar geométrico se mapea en el brazo largo del cromosoma 19 en el complejo receptor del leucocito (LRC). Este lugar geométrico es alrededor de 150 kb de longitud e incluye 15 KIR genes dispuestos cabeza a cola. Los loci KIR que actualmente se conocen son KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3 KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, 5 KIR2DS1, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, y dos pseudogenes, KIR2DP1 y KIR3DP1. Los genes KIR codifican para dos dimensiones (2D) y tridimensional (3D) dominio de inmunoglobulina-como los receptores con poco (S; activar) o largo (L; inhibitorio) colas citoplasmáticas, que son expresadas por las células asesinas naturales (NK) y los subconjuntos de T células. Variación en número de copias expuestas dentro de las formas de locus KIR diversos haplotipos con gen variable contenido1. Recombinación homóloga no alélica (NAHR), facilitado por un arreglo cerca gene de cabeza a la cola y la secuencia de alta homología, es el mecanismo propuesto para ser responsable de la variabilidad haplotypic. Han reportado más de 100 diferentes haplotipos en las poblaciones en todo el mundo1,2,3,4. Estos haplotipos se pueden dividir en dos grandes grupos: los haplotipos A y B. El haplotipo A contiene 7 genes KIR : KIR3DL3 KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1y KIR3DL2, que son genes KIR inhibitorios y la activación KIR gen KIR2DS4. Sin embargo, hasta 70% de individuos de origen europeo que son homocigotos para el haplotipo KIR A exclusivamente llevar una forma no funcional "eliminación" de KIR2DS45,6. Todas otras combinaciones de genes KIR forman haplotipos del grupo B, incluyendo al menos uno de los genes KIR específicos KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, y KIR2DL5y por lo general incluyen dos o más genes KIR activadoras.
Las moléculas HLA de clase I han sido identificados como ligandos para ciertos receptores inhibitorios (KIR2DL1 KIR2DL2, KIR2DL3y KIR3DL1), activando Receptores (KIR2DS1 KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5y KIR3DS1), y para KIR2DL4, que es un único KIR que contiene una cola citoplásmico largo como otros receptores KIR inhibitorios, pero también tiene un residuo cargado positivamente cerca del dominio extracelular que es común característica de otros receptores KIR activadoras. La combinación de variantes dentro de los genes KIR y los genes HLA influye en la interacción del ligando del receptor formas potenciales NK célula capacidad de respuesta en el nivel individual7,8. Evidencia de los estudios de asociación genética ha indicado que KIR desempeña un papel en la resistencia viral (por ejemplo., virus de la inmunodeficiencia humana [VIH]9 y hepatitis C [VHC] de virus10), el éxito del trasplante 11, el riesgo de trastornos del embarazo y de éxito reproductivo12,13, la protección contra la recaída después de alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) del trasplante14,15, 16y el riesgo de cáncer17.
La combinación de secuencia de alta homología y alélicas y haplotypic diversidad presenta desafíos en la tarea de con precisión los genes KIR genotyping. Métodos convencionales para escribir genes KIR incluyen cartilla de secuencia específica (SSP) polimerasa reacción en cadena (PCR)18,19,20, sonda de oligonucleótidos específicos de secuencia (SSOP) PCR21, y láser asistida por matriz desorción de ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS)22. Los inconvenientes de estas técnicas son que sólo proporcionan información parcial sobre el genotipo de un individuo mientras que también siendo laborioso realizar. Recientemente se ha aplicado secuenciación de próxima generación (NGS) para escribir el locus KIR específicamente. Mientras que este método es muy potente, puede ser costoso de ejecutar y es desperdiciador de tiempo para llevar a cabo controles de datos y análisis profundo.
qKAT es un método cuantitativo de PCR de alto rendimiento. Mientras que los métodos convencionales son laborioso y desperdiciador de tiempo, este método hace posible ejecutar casi 1.000 muestras genomic de la DNA (gDNA) en cinco días y le da el genotipo KIR , así como el número de copias del gen. qKAT consiste en diez reacciones múltiplexes, cada una de ellas apunta a dos loci KIR y un gen de referencia de un número fijo de copia en el genoma (STAT6) utilizado para la cuantificación relativa de los genes KIR Copiar número23. Este análisis se ha utilizado con éxito en estudios que involucran población paneles y cohortes de enfermedad en enfermedades infecciosas como el VHC, condiciones autoinmunes como la diabetes tipo 1 y trastornos del embarazo como preeclampsia, así como proporcionar una genética apoyo a estudios dirigidos a entender el NK célula función1,4,24,25,26.
Protocol
1. preparación y galjanoplastia de ADN
- Cuantificar con precisión la concentración del gDNA utilizando un instrumento de lectura espectrofotométrico o fluorométrico.
- Diluir el DNA a 4 ng/μL en una placa de 96 pozos pozos profundos. Incluyen al menos un control gDNA muestra con un número de copia conocido y un control no es de plantilla.
- Centrifugue las placas de 96 pocillos en 450 x g durante 2 minutos.
- Utilizando un instrumento de manejo de líquidos, dispensar cada muestra por cuadruplicado en placas de 384 pozos qPCR para que cada bien tiene 10 ng de ADN (2,5 μL/pocillo). Preparar por lo menos diez placas de 384 pozos, uno para cada reacción de qKAT.
- Si gDNA es ser despachado desde más de una placa de 96 pocillos, realice un lavado completo volumen con 2% de blanqueador y agua ultrapura para limpiar las agujas del sistema entre cada placa de 96 pocillos de gDNA muestras para manejo de líquidos.
- Secar el ADN por las placas de 384 pozos en un área limpia a temperatura ambiente durante al menos 24 h de incubación.
2. preparación de los cebadores y sondas
Nota: qKAT consta de diez reacciones multiplexores. Cada reacción incluye tres pares de cartilla y tres sondas marcadas con fluorescencia que amplifican específicamente dos genes KIR y una referencia gene. Los sondeos publicados en Jiang et al.27 fueron modificados para que los oligonucleótidos están marcados ahora con tintes ATTO ya que ofrecen mayor fotoestabilidad y vida larga de la señal. Combinaciones de cartilla pre-alícuotas están disponible comercialmente (véase Tabla de materiales).
- Preparar combinaciones de cartilla para cada reacción según las diluciones dado en la tabla 1.
- Preparar la sonda combinaciones para cada reacción según la tabla 1. Prueba de cada prueba individual antes de hacer la combinación.
3. preparación del Master Mix
Nota Los volúmenes que se mencionan a continuación son para realizar una reacción de la qKAT en un conjunto de placas 10 x 384 pocillos.
- Asegurar que las muestras del gDNA plateadas en las placas de 384 pozos estén completamente secas. Realizar todos los pasos en el hielo y mantenga los reactivos de exposición a la luz tanto como sea posible ya que las sondas marcadas con fluorescencia son foto y termo-sensibles.
- Descongelar el búfer de qPCR, cartilla y sonda alícuotas a 4 º C.
- En el hielo, preparar una mezcla maestra para placas de 10 x 384 pocillos añadiendo 18,86 mL de agua ultrapura, 20 mL de tampón de qPCR, 1000 μl de combinación de confeccionar la cartilla y 180 μl de combinación de confeccionar sonda (tabla 2).
- Distribuir uniformemente la mezcla principal a través de una placa de 96 de profundidad bien usando una pipeta multicanal, pipeteo 415 μL en cada pocillo. Mantenga esta placa en una caja de hielo cubierta de la luz.
- Utilizando un instrumento de manejo de líquidos, dispensar 9,5 μl de la mezcla principal en cada pocillo de la placa de 384 pozos con gDNA seco. Sellar la placa con una hoja y colóquelo inmediatamente a 4 ° C. Repita este proceso para las placas restantes, asegurando que las agujas del sistema de manejo de líquido se lavan con agua entre cada placa.
- Centrifugue las placas de 384 pozos a 450 x g durante 3 min e incúbelos a 4 ° C durante la noche o entre 6-12 h para Resuspender el ADN y para disipar cualquier burbuja de aire.
4. Análisis de qPCR
- Después de la incubación durante la noche, centrifugar a 450 x g durante 3 min disipar las burbujas de aire restante.
- Para efectos de la automatización, conectar la máquina de qPCR (p. ej., el LightCycler 480) a un controlador de microplacas (véase Tabla de materiales). Programa el controlador de microplacas para colocar las placas en la máquina de qPCR de un muelle de almacenamiento refrigerado protegido de la luz.
Nota los ensayos deberían, en teoría, trabajar en otras máquinas de qPCR con configuración óptica compatible. - Utilice las siguientes condiciones de ciclismo: 95 ° C por 5 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s y 66 ° C para 50 s, con recogida de datos a 66 ° C.
- Una vez finalizado el plazo, tiene el robot recoge la placa de la máquina de qPCR y colocarlo en el dock de descarte.
5. la ejecución de análisis
- Después de la amplificación, calcular los valores de ciclo (Cq) de cuantificación usando el segundo método máximo derivado o el método de puntos de ajuste con el software de la máquina de qPCR (véase Tabla de materiales), siguiendo los pasos siguientes.
- Abra el software de qPCR y, en la pestaña del navegador , abra el archivo de experimento de reacción guardados para una placa.
-
Para el análisis el método segundo derivado máximo, seleccione la ficha de análisis y crear un nuevo análisis mediante método Abs Quant/Second derivado máximo.
- En la ventana de crear un nuevo análisis , seleccionar tipo de análisis: método de Abs Quant/Second derivado de Max, subconjunto: todas las muestras, programa: amplificación, nombre: Rx-DFO (donde x es el número de reacción).
- Seleccione Filtro peine y elija VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Esto asegura que los datos recogidos para STAT6 está seleccionados.
- Seleccione Compensación cromática para VIC/HEX/Yellow555(533-580). Haga clic en calcular. Repetir este proceso para Fam (465-510) y Cy5/Cy5.5(618-660). Haga clic en Guardar archivo.
-
Para el análisis mediante el método de puntos de ajuste, seleccione Abs Quant/ajuste puntos en la ficha de análisis.
- En la ventana de crear un nuevo análisis , seleccionar tipo de análisis: método de puntos de ajuste de Quant Abs, subconjunto: todas las muestras, programa: amplificación, nombre: RxF DFO (donde x es el número de reacción).
- Seleccione los filtros correctos y compensaciones color de STAT6 y cada uno de los genes KIR (Fam/Cy5). En la ficha de Noiseband , ajuste la banda de ruido para excluir el ruido de fondo.
- En la ficha de análisis , establecer los puntos de ajuste a 3 y seleccione que mostrar puntos de ajuste. Haga clic en calcular. Haga clic en Guardar archivo.
6. exportación de los resultados
- En el software de la qPCR, abrir el navegador ficha seleccionar Resultados por lotes de exportación.
- Abra la carpeta en la que los archivos del experimento se guardan y transferir los archivos en la sección derecha de la ventana. Haga clic en siguiente. Seleccione el nombre y la ubicación del archivo de exportación.
- Seleccione el tipo de análisis método Abs Quant/Second derivado de Max o Abs Quant/ajuste puntos. Haga clic en siguiente. Compruebe que el nombre del archivo, la carpeta de exportación y el tipo de análisis son correcto y haga clic en siguiente para iniciar el proceso de exportación.
- Espere hasta que el Estado de exportación es aceptable. La pantalla se moverá automáticamente al paso siguiente. Compruebe que todos los archivos seleccionados se han exportado con éxito para que el número de archivos de error = 0. Haga clic en hecho.
- Utilizar secuencias de comandos split_file.pl y roche2sds.pl para dividir las placas exportadas en reacciones individuales para cada plato.
Nota las secuencias de comandos se incluyen en la solicitud/GitHub.
7. copiar el número de cálculos
- Abra el software de análisis número de copia (por ejemplo, CopyCaller). Seleccione Importar archivo de resultados PCR en tiempo real y carga archivos de texto creados por roche2sds.pl.
- Seleccione analizar y realizar el análisis por cualquier selección muestra calibrador con número de copia conocido o seleccionando el número de copia más frecuente. Vea la tabla 5 para el número más frecuente de la copia de genes KIR típicamente observados en las poblaciones de origen europeo.
8. calidad de los datos verifica
- Utilizar el script de R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R para combinar datos del número de copia de todas las placas en una hoja de cálculo.
Nota las secuencias de comandos se incluyen en la solicitud/GitHub. - Vuelva a verificar los datos sin procesar en el software de análisis número de copia para las muestras que no cumplen con el conocido ligamiento (LD) de los genes KIR (tabla 6).
Representative Results
Análisis de número de copia pueden realizarse mediante la exportación de los archivos para el software de análisis número de copia, que proporciona el número de copia previstos y estimados basado en el método ΔΔCq.
El número de copia se puede predecir que ya sea basado en el número de copia conocido control de muestras de ADN en la placa o introduciendo el número de copia gene más frecuente (tabla 5). La figura 1 muestra los resultados de una placa para una reacción que se dirige a KIR2DL4 y KIR3DS1, así como el gen de referencia STAT6. El número más frecuente de copia para KIR2DL4, un gen de marco en el locus KIR , es dos copias, mientras que el número de copia más frecuente de KIR3DS1, un gen activador, es una copia. Los resultados en la figura muestran las parcelas de amplificación de PCR observadas en el software de qPCR y el copia número de datos generado a partir de los datos de la qPCR. Como se observa, el ensayo es capaz de distinguir entre 0, 1, 2, 3 y 4 números de copia de genes KIR . El software de análisis número de copia permite también una visión de la distribución del número de copia a través de la placa como un gráfico circular o un gráfico de barras. La eficacia de la predicción del número de copia es menor para las muestras con un número más alto de la copia.
La calidad de todos los materiales utilizados en las reacciones, gDNA, buffer, cebadores y sondas, puede afectar la precisión de los resultados obtenidos. Sin embargo, es más probable ser causado debido a la variación en la concentración de DNA a través de una placa de discordancia en los resultados. La pureza de la gDNA extraída, que puede ser medida usando el 260/280 y 260/230 relaciones, también puede tener un efecto sobre la calidad. Una 260/280 relación 1,8-2 y 260/230 de 2-2.2 son deseables. Una desigual rango de ADN a través de una placa pueden conducir a una alta variabilidad en el ciclo umbral (Ct) entre las muestras y la discordancia entre el número estimado de la copia. Los resultados en la figura 2 muestran el efecto de que la disparidad entre los valores det de C a través de una placa puede tener en la precisión en la predicción del número de copia. La línea roja indica el rango del número de copia estimado para una muestra y, idealmente, debe estar tan cerca de un entero como sea posible.
Los datos de número de copia, una vez analizados, se pueden exportar como un archivo de hoja de cálculo en un formato de 96 pozos. Usamos un script de R (disponible a petición) para combinar los datos del número de copia de todas las 10 placas que funcionan como un conjunto en una hoja de cálculo. Datos publicados sobre IIC principalmente las poblaciones de origen europeo permite la predicción de las normas de LD que existen entre los diferentes genes en el complejo KIR 1. Estas predicciones se utilizan para llevar a cabo controles aguas abajo de los copia número resultados (tabla 6). Las muestras que no se ajustan a la LD previsto entre los genes podrían contener polimorfismo inusual o haplotypic variaciones estructurales. Un diagrama de flujo que describe el protocolo se muestra en la figura 3.
Una herramienta llamada identificador de haplotipo KIR (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) fue desarrollada para facilitar la imputación de haplotipos del conjunto de datos. La imputación funciona sobre la base de una lista de referencia de haplotipos en una población de origen Europea1. Sin embargo, la herramienta también permite un conjunto personalizado de haplotipos de referencia a utilizar en su lugar. Se generan tres archivos separados; el primer archivo muestra todas las combinaciones de haplotipo para una muestra, el segundo archivo proporciona una lista recortada de las combinaciones de haplotipos que tienen las frecuencias combinadas más altas, y el tercer archivo contiene las muestras que no se puede asignar haplotipos. No asignación de haplotipos podría utilizarse como un indicador de haplotipos novela.
Figura 1: resultados representativos de una placa de reacción número 5. (A) este panel muestra amplificación parcelas. (B) este panel muestra copia número parcelas. (C) este panel muestra la distribución del número de copia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: resultados representativos de una placa con una concentración variable de ADN por reacción número 5. (A) este panel muestra amplificación parcelas. (B) este panel muestra copia número parcelas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diagrama de flujo del Protocolo de qKAT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ensayo | Genes | Cartillas de avance | Concentración (nM) | Reversas bases | Concentración (nM) | Puntas de prueba | Concentración (nM) |
| No 1 | 3DP1 | A4F | 250 | A5R | 250 | P4a | 150 |
| 2DL 2 | 2DL2F4 | 400 | C3R2 | 600 | P5B | 150 | |
| STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
| No 2 | 2DS2 | A4F | 400 | A6R | 400 | P4a | 200 |
| 2DL 3 | D1F | 400 | D1R | 400 | P9 | 150 | |
| STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
| No 3 | 3DL 3 | A8F | 500 | A8R | 500 | P4a | 150 |
| 2DS4Del | 2DS4Del | 250 | 2DS4R2 | 250 | P5B | 150 | |
| STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
| No 4 | 3DL1e4 | B1F | 250 | B1R | 125 | P4B | 150 |
| 3DL1e9 | D4F | 250 | D4R2 | 500 | P9 | 150 | |
| STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
| Nº 5 | 3DS1 | B2F | 250 | B1R | 250 | P4B | 150 |
| 2DL 4 | C1F | 200 | C1R | 200 | P5B - 2DL 4 | 150 | |
| STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
| No 6 | 2DL 1 | B3F | 500 | B3R | 125 | P4B | 150 |
| 2DP1 | D3F | 250 | D3R | 500 | P9 | 150 | |
| STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
| N º 7 | 2DS1 | B4F | 500 | B4R | 250 | P4B | 150 |
| 2DL 5 | D2F | 500 | D2R | 500 | P9 | 150 | |
| STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
| No 8 | 2DS3 | B5F | 250 | B5R | 250 | P4B | 150 |
| 3DL2e9 | D4F | 250 | D5R | 125 | P9 | 150 | |
| STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
| Nº 9 | 3DL2e4 | A1F | 200 | A1R | 200 | P4a | 150 |
| 2DS4FL | 2DS4FL | 250 | 2DS4R2 | 500 | P5B | 150 | |
| STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
| No 10 | 2DS5 | B6F2 | 200 | B6R3 | 200 | P4B | 150 |
| 2DS4 | C5F | 250 | C5R | 250 | P5B | 150 | |
| STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 |
Tabla 1: combinación y concentración de cebadores y sondas en cada reacción de qKAT 27 .
| Reacción | Alícuotas de cartilla (μL) | Alícuotas (μL) de sonda | |||||||||
| R1 | 3DP1 | A4F | A5R | 2DL2F4 | C3R2 | AGUA | STAT6F | STAT6R | P4A | P5B | PSTAT6 |
| 2DL 2 | 100 | 100 | 160 | 240 | 200 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
| R2 | 2DS2 | A2F | A6R | D1F | D1R | AGUA | STAT6F | STAT6R | P4A | P9 | PSTAT6 |
| 2DL 3 | 160 | 160 | 160 | 160 | 160 | 80 | 80 | 80 | 60 | 60 | |
| Nota: necesita 20 μl menos agua en el MasterMix | |||||||||||
| R3 | 3DL 3 | A8FB A8F | A8R | 2DS4DELF | 2DS4R2 | AGUA | STAT6F | STAT6R | P4A | P5B | PSTAT6 |
| 2DS4DEL | 100 100 | 200 | 100 | 100 | 200 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
| R4 | 3DL1E4 | B1F | B1R | D4F | D4R2 | AGUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
| 3DL1E9 | 100 | 50 | 100 | 200 | 350 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
| R5 | 3DS1 | B2F | B1R | C1F | C1R | AGUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P5B - 2L 4 | PSTAT6 |
| 2DL 4 | 100 | 100 | 80 | 80 | 440 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
| R6 | 2DL 1 | B3F | B3R | D3F | D3R | AGUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
| 2DP1 | 200 | 50 | 100 | 200 | 250 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
| R7 | 2DS1 | B4F | B4R | D2F | D2R | AGUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
| 2DL 5 | 200 | 100 | 200 | 200 | 100 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
| R8 | 2DS3 | B5F | B5R | D4F | D5R | AGUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
| 3DL2E9 | 100 | 100 | 100 | 50 | 450 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
| R9 | 3DL2E4 | A1F | A1R | 2DS4WTF | 2DS4R2 | AGUA | STAT6F | STAT6R | P4A | P5B | PSTAT6 |
| 2DS4WT | 80 | 80 | 100 | 200 | 340 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
| R10 | 2DS5 | B6F2 | B6R3 | C5F | C5R | AGUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P5B | PSTAT6 |
| 2DS4TOTAL | 80 | 80 | 100 | 100 | 440 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
Tabla 2: Volumen (μL) de sonda/cartilla de 100 μm stock soluciones cartilla y sonda alícuotas de combinación.
| Nombre | Dirección | modificación de 5´ | modificación de 3´ | Secuencia (5' →3') | Longitud | TM | % GC | Exón | Posición |
| P4a | Sentido | FAM | BHQ-1 | TCATCCTGC AATGTTGGT CAGATGTCA |
27 | 60 | 44.4 | 4 | 425-451 |
| P4B | Antisentido | FAM | BHQ-1 | AACAGAACC GTAGCATCT GTAGGTCCC T |
28 | 62 | 50 | 4 | 576-603 |
| P5B | Sentido | ATTO647N | BHQ-2 | AACATTCCA GGCCGACT TTCCTCTG |
25 | 60 | 52 | 5 | 828-852 |
| P5B - 2DL 4 | Sentido | ATTO647N | BHQ-2 | AACATTCCA GGCCGACT TCCCTCTG |
25 | 61 | 56 | 5 | 828-852 |
| P9 | Sentido | ATTO647N | BHQ-2 | CCCTTCTCA GAGGCCCA AGACACC |
24 | 60 | 62.5 | 9 | 1246-1269 |
| PSTAT6 | ATTO550 | BHQ-2 | CTGATTCCT CCATGAGCA TGCAGCTT |
26 | 62 | 50 |
Tabla 3: lista de sondas en qKAT 1, 27. los tintes fluorescentes utilizados en el extremo 5' de las sondas de oligo P5b, P5b - 2 DL 4, P9 y PSTAT6 fueron modificados a los tintes ATTO.
| Gene | Cartillas de | Dirección | Secuencia (5´-3´) | Longitud | TM | % GC | Exón | Posición | Amplicón (PB) | Alelos pueden perderse | ||
| 3DL2e4 | A1F | Hacia adelante | GCCCCTGCTGAA ATCAGG |
18 | 52 | 61.1 | 4 | 399-416 | 179 | 3DL 2 * 008 * 021, * 027, * 038. | ||
| A1R | Marcha atrás | CTGCAAGGACAG GCATCAA |
19 | 53 | 52,6 | 559-577 | 3DL 2 * 048 | |||||
| 3DP1 | A4F | Hacia adelante | GTCCCCTGGTGA AATCAGA |
19 | 49 | 52,6 | 4 | 398-416 | 112 | Ninguno | ||
| A5R | Marcha atrás | GTGAGGCGCAAA GTGTCA |
18 | 52 | 55,6 | 492-509 | Ninguno | |||||
| 2DS2 | A2F | Hacia adelante | GTCGCCTGGTGA AATCAGA |
19 | 49 | 52,6 | 4 | 398-416 | 111 | Ninguno | ||
| A6R | Marcha atrás | TGAGGTGCAAAG TGTCCTTAT |
21 | 51 | 42.9 | 488-508 | Ninguno | |||||
| 3DL 3 | A8Fa | Hacia adelante | GTGAAATCGGGA GAGACG |
18 | 50 | 55,6 | 4 | 406-423 | 139 | Ninguno | ||
| A8Fb | Hacia adelante | GGTGAAATCAGG AGAGACG |
19 | 50 | 52,6 | 405-423 | 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905. | |||||
| A8R | Marcha atrás | AGTTGACCTGGG AACCCG |
18 | 51 | 61.1 | 526-543 | Ninguno | |||||
| 3DL1e4 | B1F | Hacia adelante | CATCGGTCCCAT GATGCT |
18 | 51 | 55,6 | 4 | 549-566 | 85 | 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089 | ||
| B1R | Marcha atrás | GGGAGCTGACAA CTGATAGG |
20 | 52 | 55 | 614-633 | 3DL 1 * 00502 | |||||
| 3DS1 | B2F | Hacia adelante | CATCGGTTCCAT GATGCG |
18 | 51 | 55,6 | 4 | 549-566 | 85 | 3DS1 * 047; pueden recoger 3DL 1 * 054. | ||
| B1R | Marcha atrás | GGGAGCTGACAA CTGATAGG |
20 | 52 | 55 | 614-633 | Ninguno | |||||
| 2DL 1 | B3F | Hacia adelante | TTCTCCATCAGT CGCATGAC |
20 | 52 | 50 | 4 | 544-563 | 96 | 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028 | ||
| B3R | Marcha atrás | GTCACTGGGAGC TGACAC |
18 | 50 | 61.1 | 622-639 | 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030 | |||||
| 2DS1 | B4F | Hacia adelante | TCTCCATCAGTC GCATGAA |
19 | 51 | 47.4 | 4 | 545-563 | 96 | 2DS1 * 001 | ||
| B4R | Marcha atrás | GGTCACTGGGAG CTGAC |
17 | 49 | 64.7 | 624-640 | Ninguno | |||||
| 2DS3 | B5F | Hacia adelante | CTCCATCGGTCG CATGAG |
18 | 53 | 61.1 | 4 | 546-563 | 96 | Ninguno | ||
| B5R | Marcha atrás | GGGTCACTGGGA GCTGAA |
18 | 51 | 61.1 | 624-641 | Ninguno | |||||
| 2DS5 | B6F2 | Hacia adelante | AGAGAGGGGACG TTTAACC |
19 | 50 | 52,6 | 4 | 475-493 | 173 | Ninguno | ||
| B6R3 | Marcha atrás | TCCAGAGGGTCA CTGGGC |
18 | 53 | 66.7 | 630-647 | 2DS5 * 003 | |||||
| 2DL 4 | C1F | Hacia adelante | GCAGTGCCCAGC ATCAAT |
18 | 52 | 55,6 | 5 | 808-825 | 83 | Ninguno | ||
| C1R | Marcha atrás | CCGAAGCATCTG TAGGTCT |
19 | 52 | 52,6 | 872-890 | 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019 | |||||
| 2DL 2 | 2DL2F4 | Hacia adelante | GAGGTGGAGGCC CATGAAT |
19 | 52 | 57.9 | 5 | 778-796 | 151 | 2DL 2 * 009; 782G cambiada a. | ||
| C3R2 | Marcha atrás | TCGAGTTTGACC ACTCGTAT |
20 | 51 | 45 | 909-928 | Ninguno | |||||
| 2DS4 | C5F | Hacia adelante | TCCCTGCAGTGC GCAGC |
17 | 57 | 70.6 | 5 | 803-819 | 120 | Ninguno | ||
| C5R | Marcha atrás | TTGACCACTCGT AGGGAGC |
19 | 52 | 57.9 | 904-922 | 2DS4 * 013 | |||||
| 2DS4Del | 2DS4Del | Hacia adelante | CCTTGTCCTGCA GCTCCAT |
19 | 54 | 57.9 | 5 | 750-768 | 203 | Ninguno | ||
| 2DS4R2 | Marcha atrás | TGACGGAAACAA GCAGTGGA |
20 | 53 | 50 | 933-952 | Ninguno | |||||
| 2DS4FL | 2DS4FL | Hacia adelante | CCGGAGCTCCTA TGACATG |
19 | 53 | 57.9 | 5 | 744-762 | 209 | Ninguno | ||
| 2DS4R2 | Marcha atrás | TGACGGAAACAA GCAGTGGA |
20 | 53 | 50 | 933-952 | Ninguno | |||||
| 2DL 3 | D1F | Hacia adelante | AGACCCTCAGGA GGTGA |
17 | 48 | 58.8 | 9 | 1180-1196 | 156 | Ninguno | ||
| D1R | Marcha atrás | CAGGAGACAACT TTGGATCA |
20 | 50 | 45 | 1316-1335 | 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 y 2DL 3 * 01802 | |||||
| 2DL 5 | D2F | Hacia adelante | CACTGCGTTTTC ACACAGAC |
20 | 52 | 50 | 9 | 1214-1233 | 120 | 2DL5B * 011 y 2DL5B * 020 | ||
| D2R | Marcha atrás | GGCAGGAGACAA TGATCTT |
19 | 49 | 47.4 | 1315-1333 | Ninguno | |||||
| 2DP1 | D3F | Hacia adelante | CCTCAGGAGGTG ACATACGT |
20 | 53 | 55 | 9 | 1184-1203 | 121 | Ninguno | ||
| D3R | Marcha atrás | TTGGAAGTTCCG TGTACACT |
20 | 50 | 45 | 1285-1304 | Ninguno | |||||
| 3DL1e9 | D4F | Hacia adelante | CACAGTTGGATC ACTGCGT |
19 | 52 | 52,6 | 9 | 1203-1221 | 93 | 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068 | ||
| D4R2 | Marcha atrás | CCGTGTACAAGA TGGTATCTGTA |
23 | 53 | 43.5 | 1273-1295 | 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098 | |||||
| 3DL2e9 | D4F | Hacia adelante | CACAGTTGGATC ACTGCGT |
19 | 52 | 52,6 | 9 | 1203-1221 | 156 | Ninguno | ||
| D5R | Marcha atrás | GACCTGACTGTG GTGCTCG |
19 | 54 | 63.2 | 1340-1358 | Ninguno | |||||
| STAT6 | STAT6F | Hacia adelante | CCAGATGCCTAC CATGGTGC |
20 | 54 | 60 | 129 | |||||
| STAT6R | Marcha atrás | CCATCTGCACAG ACCACTCC |
20 | 54 | 60 | |||||||
Tabla 4: secuencias de los cebadores utilizados en qKAT 1, 27.
| KIR gene | 3DL 3 | 2DS2 | 2DL 2 | 2DL 3 | 2DP1 | 2DL 1 | 3DP1 | 2DL 4 | 3DL 1 EX9 |
3DL 1 EX9 |
3DS1 | 2DL 5 | 2DS3 | 2DS5 | 2DS1 | 2DS4 Total |
2DS4 FL |
2DS4 DEL |
3DL 2 EX4 |
3DL 2 EX9 |
|
| Número de copia más frecuente | 2 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 2 | 2 | |
Tabla 5: Número de copia más frecuente para KIR genes comúnmente observados en las muestras de origen Europea.
| Reglas de desequilibrio de acoplamiento para qKAT basado en poblaciones europeas | Verificación de número de copia | |||||||
| 1 | KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 y KIR3DL2 son marco genes presentes en ambos haplotipos. | KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 y KIR3DL2 = 2 | ||||||
| 2 | KIR2DS2 y KIR2DL2 son en el LD con otros | 2DS2=2 DL 2 | ||||||
| 3 | KIR2DL2 y KIR2DL3 son alelos del mismo gen | 2 DL 2+2 DL 3= 2 | ||||||
| 4 | KIR2DP1 y KIR2DL1 son en el LD con otros | 2DP1=2 DL 1 | ||||||
| 5 | Exón 4 de KIR3DL1 y KIR3DL2 equivale al exón 9 de KIR3DL1 y KIR3DL2 respectivamente. | 3DL1ex4=3DL1ex9 y 3DL2ex4=3DL2ex9 | ||||||
| 6 | KIR3DL1 y KIR3DS1 son los alelos | 3 DL 1+3DS1= 2 | ||||||
| 7 | KIR2DS3 y KIR2DS5 son en el LD con KIR2DL5 | 2DS3+2DS5=2 DL 5 | ||||||
| 8 | KIR3DS1 y KIR2DS1 están en LD | 3DS1=2DS1 | ||||||
| 9 | Presencia de otal KIR2DS1 y KIR2DS4Tes mutuamente exclusiva en un haplotipo | 2DS1+2DS4TOTAL= 2 | ||||||
| 10 | KIR2DS4FL y KIR2DS4del son variantes de KIR2DS4TOTAL | 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL | ||||||
Tabla 6: ligamiento entre KIR genes observados comúnmente en poblaciones de origen a europeo se pueden usar para comprobar el número de copia de datos 1,27.
Discussion
Describimos un nuevo método semiautomático de alto rendimiento, llamado qKAT, que facilita la copia número tipificación de genes KIR . El método es una mejora sobre los métodos convencionales como SSP-PCR, que son de bajo rendimiento y sólo pueden indicar la presencia o ausencia de estos genes altamente polimórficos.
La exactitud de los datos del número de copia obtenidas depende de múltiples factores, incluyendo la calidad y uniformidad de la concentración de las muestras del gDNA y la calidad de los reactivos. La calidad y precisión de las muestras del gDNA a través de una placa son muy importantes ya que las variaciones en la concentración a través de la placa pueden resultar en errores en el cálculo del número de copia. Puesto que los análisis se validaron utilizando conjuntos de muestra de origen Europea, datos de cohortes de otras partes del mundo requieren controles más a fondo. Esto es para asegurar que casos de deserción del alelo o atascamiento no específico primer punta de prueba no son malinterpretados como variación en número de copias.
Mientras que los ensayos fueron diseñados y optimizados para funcionar como alto rendimiento, puede ser modificados para ejecutar menos ejemplos. La métrica de confianza en el software de análisis número de copia es afectada cuando se analizan menos muestras, pero esto puede mejorarse si se incluyen muestras de ADN genómicas de control con un conocido número de copia de genes KIR en la placa y muestra más repeticiones incluido.
Laboratorios sin líquido y placa-manipulación de robots, mezcla principal puede dispensar utilizando pipetas de varios canales y placas pueden cargarse manualmente en el instrumento de la qPCR.
El objetivo principal detrás del desarrollo de qKAT fue crear un método de alto rendimiento, alta resolución y rentable simple, genotipo IIC para enfermedad estudios de asociación. Esto fue alcanzado con éxito ya que qKAT se ha empleado en la investigación sobre el papel de KIR en varios estudios de Asociación de enfermedad grande, incluyendo una gama de enfermedades infecciosas, condiciones autoinmunes y embarazo trastornos4, 24 , 25 , 26.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El proyecto recibido financiamiento del Consejo de investigación médica (MRC), el Consejo Europeo de investigación (CEI) bajo el programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo no. 695551 de la subvención) y el Instituto Nacional de salud (NIH) de Cambridge Biomédica centro de investigación y NIH investigación sangre y trasplante de unidad de investigación (NIHR BTRU) en donación de órganos y trasplante en la Universidad de Cambridge y en colaboración con sangre de NHS y trasplante (NHSBT). Las opiniones expresadas son las de los autores y no necesariamente las del NHS, el NIHR, el Departamento de salud o la NHSBT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
| Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
| SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
| MilliQ water | − | − | − |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| OR | |||
| QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
| Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
| LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
| Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
| Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
| RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
| StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
| 96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
| LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE | |||
| Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
| Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
| KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |
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