Summary
Kvantitative killer celle immunglobulin-lignende receptor (KIR) semi-automatiske typing (qKAT) er en enkel, høj overførselshastighed og omkostningseffektiv metode til at kopiere nummer type KIR gener for deres anvendelse i befolkningen og sygdom association studier.
Abstract
Killer celle immunglobulin-lignende receptorer (KIRs) er et sæt af hæmmende og aktiverende immun receptorer, natural killer (NK) og T-celler, kodet af en polymorf klynge af gener på kromosom 19. Deres bedst karakteriserede ligander er human leukocyt antigen (HLA) molekyler, der er kodet i store histocompatibility complex (MHC) locus på kromosom 6. Der er betydelige beviser at de spiller en væsentlig rolle i immunitet, reproduktion og transplantation, hvilket gør det afgørende at have teknikker, der kan præcist genotype dem. Men høj-sekvens homologi, såvel som allel og copy number variation, gør det vanskeligt at designmetoder, der kan præcist og effektivt genotype alle KIR gener. Traditionelle metoder er som regel begrænset opløsning af data indhentet, overførselshastighed, omkostningseffektivitet og den tid, det tager for opsætning og drift af eksperimenter. Vi beskriver en metode kaldet kvantitative KIR halvautomatiske typing (qKAT), som er en høj overførselshastighed multiplex real-time polymerase kædereaktion metode, der kan afgøre gen kopi numre for alle gener i KIR locus. qKAT er en simpel høj overførselshastighed metode, der kan give høj opløsning KIR kopi nummer data, hvilket yderligere kan bruges til at udlede variationerne i de strukturelt polymorfe haplotypes, som omfatter dem. Denne kopi nummer og haplotype data kan være gavnligt for undersøgelser på storstilet sygdom foreninger, populationsgenetik, samt undersøgelser på udtryk og funktionel interaktioner mellem KIR og HLA.
Introduction
Hos mennesker er den killer immunglobulin-lignende receptor(KIR) locus er kortlagt på den lange arm af kromosom 19 inden for leukocyt receptor kompleks (LRC). Denne locus er omkring 150 kb i længde og omfatter 15 KIR gener arrangeret hoved-til-hale. KIR loci, der er kendt for i øjeblikket er KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, og to pseudogenes, KIR2DP1 og KIR3DP1. KIR gener koder for todimensionale (2D) og tredimensionale (3D) immunglobulin-lignende domæne receptorer med kort (S, aktivering) eller lang (L; hæmmende) cytoplasmatisk hale, som er fremført af naturlige dræberceller (NK) og delmængder af T celler. Copy number variation udstillet i KIR locus former forskellige haplotypes med variabel gen indhold1. Non-allel homologe rekombination (NAHR), lettes ved en tæt hoved-til-hale gen arrangement og høj-sekvens homologi, er det, som foreslås at være ansvarlig for haplotypic variationen. Over 100 forskellige haplotypes er blevet rapporteret hos populationer på verdensplan1,2,3,4. Alle disse haplotypes kan opdeles i to hovedgrupper: A og B haplotypes. A haplotype indeholder 7 KIR gener: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, og KIR3DL2, som er hæmmende KIR gener, og den aktiverende KIR gen KIR2DS4. Men op til 70% af EU-oprindelse personer, der er homozygot for KIR haplotype A udelukkende medfører en ikke-funktionel "sletningen" form for KIR2DS45,6. Alle andre KIR gen kombinationer danne gruppe B haplotypes, herunder mindst én af de specifikke KIR gener KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, og KIR2DL5, og indeholder typisk to eller flere aktiverende KIR gener.
HLA klasse I molekylerne er blevet identificeret som ligander for visse hæmmende receptorer (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3og KIR3DL1), aktiverende receptorer (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, og KIR3DS1), og for KIR2DL4, som er en unik KIR , der indeholder en lang cytoplasmatisk hale som andre hæmmende KIR-receptorer, men også har et positivt ladede rester nær det ekstracellulære domæne, der er en fælles funktionen af andre aktiverende KIR -receptorer. Kombinationen af varianter inden for KIR gener og HLA-gener påvirker receptor ligand interaktion at figurer potentielle NK celle respons på det individuelle niveau7,8. Beviser fra genetiske association undersøgelser har antydet, at KIR spiller en rolle i viral modstand (e.g., human immundefekt virus [HIV]9 og hepatitis C virus [HCV]10), en vellykket transplantation 11, risikoen for graviditet lidelser og reproduktiv succes12,13, beskyttelse mod tilbagefald efter allogen hæmatopoietisk stamcelle transplantation (HSCT)14,15, 16, og risikoen for kræft17.
Kombinationen af høj-sekvens homologi og allel og haplotypic mangfoldighed præsenterer udfordringer i opgaven med præcist genotypebestemmelse KIR gener. Konventionelle metoder til at skrive KIR gener omfatter sekvens-specifikke primer (SSP) polymerase kædereaktion (PCR)18,19,20, sekvens-specifikke oligonukleotid sonde (SSOP) PCR21, og matrix assisted laser desorption ionisering-tid for flyvning massespektrometri (MALDI-TOF MS)22. Ulemperne ved disse teknikker er, at de kun giver delvis indblik genotypen hos en enkeltperson, samtidig også være besværlig at udføre. Seneste er næste generation sequencing (NGS) blevet anvendt for at skrive KIR locus specifikt. Mens denne metode er meget kraftfuld, det kan være dyrt at køre, og det er tidskrævende at udføre dybdegående analyser og data kontrol.
qKAT er en høj overførselshastighed kvantitativ PCR metode. Mens konventionelle metoder er besværlig og tidskrævende, denne metode gør det muligt at køre næsten 1.000 genomisk DNA (gDNA) prøver i fem dage og giver KIR genotype, såvel som gen kopi nummer. qKAT består af ti multiplex reaktioner, som hver er rettet mod to KIR loci og en reference gen af en fast eksemplarnummer i genomet (STAT6) anvendes til den relative kvantificering af KIR -genet kopiere nummer23. Denne analyse har held været anvendt i studier med stor befolkning paneler og sygdom kohorter på infektionssygdomme som HCV, autoimmune sygdomme som type 1 diabetes, og graviditet lidelser såsom preeclampsia, samt give en genetisk understøttelse til undersøgelser med henblik på forståelse af NK celle funktion1,4,24,25,26.
Protocol
1. forberedelse og Plating ud af DNA
- Nøjagtigt kvantificere gDNA koncentrationen ved hjælp af en spektrofotometrisk eller fluorometriske instrument.
- Fortyndes DNA til 4 ng/µL på en 96-brønd deep-godt plade. Omfatte mindst én kontrolprøve gDNA med nogle kendte kopi og én ikke-skabelon kontrol.
- Der centrifugeres 96-brønd plader på 450 x g i 2 min.
- Ved hjælp af en flydende håndtering instrument, dispensere hver prøve i fire eksemplarer på 384-godt qPCR plader, således at hver godt 10 ng af DNA (2,5 µL/brønd). Forbered mindst ti 384-godt plader, én for hver enkelt qKAT reaktion.
- Hvis gDNA er der udleveres fra mere end én 96-brønd plade, udføre en fuld volumen vask med 2% blegemiddel og ultrarent vand til at rense af væsken håndtering system mellem hver 96-brønd plade af gDNA prøver nåle.
- Lufttørre DNA ved at inkubere 384-godt pladerne i et rent område ved rumtemperatur i mindst 24 timer.
2. forberedelse af primere og sonder
Bemærk: qKAT består af ti multiplex reaktioner. Hver reaktion omfatter tre primer par og tre fluorescens-mærket sonder, der specifikt forstærker to KIR gener og én reference genet. De sonder, som blev udgivet i Jiang et al.27 blev ændret, så oligonukleotider betegnes nu med ATTO farvestoffer, da de tilbyder forbedrede fotostabilitet og lange signal levetid. Pre-aliquoted primer kombinationer er kommercielt tilgængelige (Se Tabel af materialer).
- Forberede primer kombinationer for hver reaktion som de fortyndinger, der er angivet i tabel 1.
- Forbered sondens kombinationer for hver reaktion ifølge tabel 1. Test hver enkelt sonde inden du foretager kombinationen.
3. forberedelse af Master Mix
Bemærk De mængder, der er nævnt nedenfor er til at udføre en qKAT reaktion på et sæt af 10 x 384-godt plader.
- Sikre at gDNA prøver belagt på 384-godt plader er helt tørre. Gennemføre alle trin på is og holde de reagenser, der er omfattet af udsættelse for lys så meget som muligt, da de fluorescens-mærket sonder er foto - og thermo-følsomme.
- Afrimning qPCR buffer, primer og sonde alikvoter ved 4 ° C.
- På is, forberede en master mix 10 x 384-godt plader ved at tilføje 18.86 mL i ultrarent vand, 20 mL af qPCR buffer, 1.000 µL af preprepared primer kombination og 180 µL af preprepared sonde kombination (tabel 2).
- Distribuere den master mix jævnt på tværs af en 96-dybe godt plade ved hjælp af en multi-kanal pipette, når der afpipetteres 415 µL i hver brønd. Holde denne plade i en ice box dækket fra lys.
- Ved hjælp af en flydende håndtering instrument, dispensere 9,5 µL af den master mix i hver brønd af 384-godt plade med tørrede gDNA. Forsegle pladen med en folie og straks placerer det ved 4 ° C. Gentag denne proces for de resterende plader, at sikre, at nålene af væsken håndtering system er vasket med vand mellem hver plade.
- Centrifugeres 384-godt plader på 450 x g i 3 min og inkuberes dem ved 4 ° C natten over eller mellem 6-12 h resuspend DNA og sprede eventuelle luftbobler.
4. qPCR Assay
- Efter natten inkubation, centrifugeres ved 450 x g i 3 min. til at bortlede enhver resterende luftbobler.
- Henblik på automatisering, forbinde qPCR maskine (f.eks. LightCycler 480) til en mikrotiterplade handler (Se Tabel af materialer). Programmet mikrotiterplade handleren til at placere pladerne i qPCR maskine fra en nedkølet lagring dock, som er beskyttet mod lys.
Bemærk assays bør, i teorien, arbejde på andre qPCR maskiner med kompatible optisk indstillinger. - Brug følgende cykling betingelser: 95 ° C i 5 min. efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ° C til 15 s og 66 ° C 50 s, med dataindsamling på 66 ° C.
- Når kørslen er afsluttet, har robotten samle pladen fra qPCR maskine og placere den i udsmid dock.
5. efter Kør analyse
- Efter forstærkning, beregne kvantificering cyklus (Cq) værdier ved hjælp af enten den anden afledte maksimale metode eller metoden Fit punkter med software af qPCR maskine (Se Tabel af materialer), følge nedenstående trin.
- Åbn qPCR softwaren, og Åbn filen gemt reaktion eksperiment for én plade i fanen Navigator .
-
Analyse ved hjælp af den anden afledte maksimale metode, Vælg fanen analyse, og oprette en ny analyse ved hjælp af Abs Quant/Second afledte Max metode.
- Vælg analysetypen i vinduet Opret ny analyse : Abs Quant/Second afledte Max metode, delmængde: alle prøver, program: forstærkning, navn: Rx-DFO (hvor x er tal, reaktion).
- Vælg Filter kam og vælg VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Dette sikrer, at data indsamlet for STAT6 er markeret.
- Vælg farve kompensation for VIC/HEX/Yellow555(533-580). Klik på Beregn. Gentag dette for Fam (465-510) og Cy5/Cy5.5(618-660). Klik på Gem fil.
-
Analyse ved hjælp af metoden Fit punkter, skal du vælge Abs Quant/Fit punkter i fanen analyse.
- Vælg analysetypen i vinduet Opret ny analyse : Abs Quant/Fit point metode, delmængde: alle prøver, program: forstærkning, navn: RxF-DFO (hvor x er tal, reaktion).
- Vælg den korrekte filtre og farve kompensationer for STAT6 og hver af KIR gener (Fam/Cy5). Under fanen Noiseband Angiv støj bandet at udelukke baggrundsstøj.
- I fanen analyse angivet de punkter, der passer til 3 og vælge Vis passer point. Klik på Beregn. Klik på Gem fil.
6. eksport af resultaterne
- Åbn Navigator i qPCR software, tab. Vælg Resultater Batch eksport.
- Åbn den mappe, hvor eksperimentet filerne gemmes og overføre filer ind i højre del af vinduet. Klik på næste. Vælg navnet på og placeringen af eksportfilen.
- Vælg analysetypen Abs Quant/Second afledte Max metode eller Abs Quant/Fit point. Klik på næste. Kontrollere, at navnet på filen, mappen eksport og analysetypen er korrekte, og klik på næste for at starte eksportprocessen.
- Vent indtil Eksportere Status er Ok. Skærmen vil automatisk flytte til næste trin. Kontroller, at alle valgte filer er eksporteret korrekt således at antallet af filer mislykkedes = 0. Klik på udført.
- Bruge scripts split_file.pl og roche2sds.pl til at opdele de eksporterede plader i individuelle reaktioner for hver plade.
Bemærk scripts leveres på anmodning/GitHub.
7. kopi nummer beregninger
- Åbn kopi nummer analyse software (f.eks. CopyCaller). Vælg Importer real-time PCR resultatfil og indlæse tekstfiler skabt af roche2sds.pl.
- Vælg analyser og foretage analysen, ved enten at vælge kalibrator prøve med kendte kopi nummer eller vælge hyppigste kopi nummer. Se tabel 5 for det mest hyppige kopi antal KIR gener typisk observeret i EU-oprindelse populationer.
8. data-kvalitet kontrollerer
- Brug R script KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R at kombinere kopi nummer data fra alle pladerne i et regneark.
Bemærk scripts leveres på anmodning/GitHub. - Recheck rådata på kopi nummer analyse software for prøver, der ikke er i overensstemmelse med den kendte kobling ubalance (LD) for KIR gener (tabel 6).
Representative Results
Kopi nummer analyse kan foretages ved at eksportere filer til kopi nummer analyse software, som giver den forudsagte og anslåede kopi nummer baseret på metoden ΔΔCq.
Kopi nummer kan forudsiges enten baseret på det kendte eksemplar antal kontrol DNA prøver på pladen eller ved at indtaste den mest hyppige gen kopi nummer (tabel 5). Figur 1 viser resultaterne af en plade for en reaktion, der er rettet mod KIR2DL4 og KIR3DS1samt reference-gen STAT6. Den hyppigste kopi nummer til KIR2DL4, et framework gen i KIR locus, er to eksemplarer, der henviser til, at den mest hyppige eksemplarnummer for KIR3DS1, en aktiverende genet, er en kopi. Resultaterne i figur viser PCR forstærkning parceller observeret på qPCR software og kopiere nummer data genereret fra qPCR data. Som vist, er analysen stand til at skelne mellem 0, 1, 2, 3 og 4 KIR gen kopi numre. Kopi nummer analyse software giver også mulighed for en visning af fordelingen af kopi antallet på tværs af pladen som et cirkeldiagram eller et søjlediagram. Effekten af kopi nummer forudsigelse er lavere for prøver med en højere kopi nummer.
Kvaliteten af alle materialer i reaktioner, gDNA, buffer, primere og sonder, kan påvirke nøjagtigheden af resultaterne. Uoverensstemmelse i resultater er imidlertid mest sandsynligt at være forårsaget på grund af variation i koncentrationen af DNA på tværs af en plade. Renheden af det udtrukne gDNA, der kan måles ved hjælp af 260/280 og 260/230-forhold, kan også have en effekt på kvaliteten. En 260/280-forholdet mellem 1,8-2 og en 260/230 forholdet mellem 2-2.2 er ønskeligt. En ujævn vifte af DNA fusioner på tværs af en plade kan føre til en høj variabilitet i tærskel cyklussen (Ct) mellem prøver og uoverensstemmelse i rækken af de anslåede eksemplarnummer. Resultaterne i figur 2 viser effekten af forskellen mellem Ct -værdier på tværs af en plade kan have på nøjagtighed i forudsigelse af kopi nummer. Den røde linje angiver vifte af anslåede kopi antallet for en prøve, og ideelt set bør være så tæt på et heltal som muligt.
Kopi nummer data, når analyseret, kan eksporteres som en regnearksfil i 96-brønds format. Vi anvendte en R skrift (fås på anmodning) til at kombinere kopi taldata af alle 10 plader, der køres som et sæt ind i et regneark. Offentliggjorte data om KIRs fra hovedsagelig EU-oprindelse populationer giver forudsigelse af LD regler, der findes mellem forskellige gener i KIR komplekse1. Disse forudsigelser er brugt til at foretage efterfølgende kontrol af kopi nummer resultaterne (tabel 6). Prøver, der ikke er i overensstemmelse med den forventede LD mellem gener kan indeholde usædvanlige polymorfi eller haplotypic strukturelle variationer. Et rutediagram, der beskriver protokollen er vist i figur 3.
Et værktøj kaldet KIR Haplotype id (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) blev udviklet for at lette imputering af haplotypes fra datasættet. Imputering virker på grundlag af en liste over reference haplotypes observeret i en EU-oprindelse befolkningen1. Men værktøjet også mulighed for en brugerdefineret sæt reference haplotypes skal bruges i stedet. Tre separate filer genereres; den første fil lister alle haplotype kombinationer for en prøve, den anden fil indeholder en trimmet liste over de kombinationer af haplotypes, som har de højeste kombinerede frekvenser, og den tredje fil lister de prøver, der ikke kan tildeles haplotypes. Ikke-tildeling af haplotypes kunne bruges som en indikator for romanen haplotypes.
Figur 1: repræsentative resultater af en plade for reaktion nummer 5. (A) dette panel viser forstærkning parceller. (B) dette panel viser kopiere nummer parceller. (C) dette panel viser kopi nummer distribution. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative resultater af en plade med en variabel DNA til reaktion nummer 5. (A) dette panel viser forstærkning parceller. (B) dette panel viser kopiere nummer parceller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: rutediagram i qKAT protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Analysen | Gener | Fremad primere | Koncentration (nM) | Omvendt primere | Koncentration (nM) | Sonder | Koncentration (nM) |
No 1 | 3DP1 | A4F | 250 | A5R | 250 | P4a | 150 |
2DL 2 | 2DL2F4 | 400 | C3R2 | 600 | P5b | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
Nr. 2 | 2DS2 | A4F | 400 | A6R | 400 | P4a | 200 |
2DL 3 | D1F | 400 | D1R | 400 | P9 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
Nr 3 | 3DL 3 | A8F | 500 | A8R | 500 | P4a | 150 |
2DS4Del | 2DS4Del | 250 | 2DS4R2 | 250 | P5b | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
No 4 | 3DL1e4 | B1F | 250 | B1R | 125 | P4b | 150 |
3DL1e9 | D4F | 250 | D4R2 | 500 | P9 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
No 5 | 3DS1 | B2F | 250 | B1R | 250 | P4b | 150 |
2DL 4 | C1F | 200 | C1R | 200 | P5b - 2DL 4 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
No 6 | 2DL 1 | B3F | 500 | B3R | 125 | P4b | 150 |
2DP1 | D3F | 250 | D3R | 500 | P9 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
No 7 | 2DS1 | B4F | 500 | B4R | 250 | P4b | 150 |
2DL 5 | D2F | 500 | D2R | 500 | P9 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
No 8 | 2DS3 | B5F | 250 | B5R | 250 | P4b | 150 |
3DL2e9 | D4F | 250 | D5R | 125 | P9 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
No 9 | 3DL2e4 | A1F | 200 | A1R | 200 | P4a | 150 |
2DS4FL | 2DS4FL | 250 | 2DS4R2 | 500 | P5b | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
No 10 | 2DS5 | B6F2 | 200 | B6R3 | 200 | P4b | 150 |
2DS4 | C5F | 250 | C5R | 250 | P5b | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 |
Tabel 1: kombination og koncentration af primere og sonder anvendes i hver enkelt qKAT reaktion 27 .
Reaktion | Primer delprøver (µL) | Sonden delprøver (µL) | |||||||||
R1 | 3DP1 | A4F | A5R | 2DL2F4 | C3R2 | VAND | STAT6F | STAT6R | P4A | P5B | PSTAT6 |
2DL 2 | 100 | 100 | 160 | 240 | 200 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R2 | 2DS2 | A2F | A6R | D1F | D1R | VAND | STAT6F | STAT6R | P4A | P9 | PSTAT6 |
2DL 3 | 160 | 160 | 160 | 160 | 160 | 80 | 80 | 80 | 60 | 60 | |
Bemærk: Brug 20 µL mindre vand i MasterMix | |||||||||||
R3 | 3DL 3 | A8F A8FB | A8R | 2DS4DELF | 2DS4R2 | VAND | STAT6F | STAT6R | P4A | P5B | PSTAT6 |
2DS4DEL | 100 100 | 200 | 100 | 100 | 200 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R4 | 3DL1E4 | B1F | B1R | D4F | D4R2 | VAND | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
3DL1E9 | 100 | 50 | 100 | 200 | 350 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R5 | 3DS1 | B2F | B1R | C1F | C1R | VAND | STAT6F | STAT6R | P4B | P5B - 2L 4 | PSTAT6 |
2DL 4 | 100 | 100 | 80 | 80 | 440 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R6 | 2DL 1 | B3F | B3R | D3F | D3R | VAND | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
2DP1 | 200 | 50 | 100 | 200 | 250 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R7 | 2DS1 | B4F | B4R | D2F | D2R | VAND | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
2DL 5 | 200 | 100 | 200 | 200 | 100 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R8 | 2DS3 | B5F | B5R | D4F | D5R | VAND | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
3DL2E9 | 100 | 100 | 100 | 50 | 450 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R9 | 3DL2E4 | A1F | A1R | 2DS4WTF | 2DS4R2 | VAND | STAT6F | STAT6R | P4A | P5B | PSTAT6 |
2DS4WT | 80 | 80 | 100 | 200 | 340 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R10 | 2DS5 | B6F2 | B6R3 | C5F | C5R | VAND | STAT6F | STAT6R | P4B | P5B | PSTAT6 |
2DS4TOTAL | 80 | 80 | 100 | 100 | 440 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 |
Tabel 2: Bind (µL) af 100 µM primer/sonden stamopløsninger primer og sonde kombination delprøver.
Navn | Retning | 5´ ændring | 3´ ændring | Rækkefølge (5' →3') | Længde | TM | GC % | Exon | Position |
P4a | Forstand | FAM | BHQ-1 | TCATCCTGC AATGTTGGT CAGATGTCA |
27 | 60 | 44,4 | 4 | 425-451 |
P4b | Antisensstoffer | FAM | BHQ-1 | AACAGAACC GTAGCATCT GTAGGTCCC T |
28 | 62 | 50 | 4 | 576-603 |
P5b | Forstand | ATTO647N | BHQ-2 | AACATTCCA GGCCGACT TTCCTCTG |
25 | 60 | 52 | 5 | 828-852 |
P5b - 2DL 4 | Forstand | ATTO647N | BHQ-2 | AACATTCCA GGCCGACT TCCCTCTG |
25 | 61 | 56 | 5 | 828-852 |
P9 | Forstand | ATTO647N | BHQ-2 | CCCTTCTCA GAGGCCCA AGACACC |
24 | 60 | 62,5 | 9 | 1246-1269 |
PSTAT6 | ATTO550 | BHQ-2 | CTGATTCCT CCATGAGCA TGCAGCTT |
26 | 62 | 50 |
Tabel 3: oversigt over sonder anvendes i qKAT 1, 27. de fluorescerende farvestoffer brugt i 5' slutningen af oligo-prober P5b, P5b - 2 DL 4, P9 og PSTAT6 blev ændret til ATTO farvestoffer.
Gen | Primere | Retning | Sekvens (5´-3´) | Længde | TM | GC % | Exon | Position | Amplikon (bp) | Måske er gået glip af alleler | ||
3DL2e4 | A1F | Fremad | GCCCCTGCTGAA ATCAGG |
18 | 52 | 61.1 | 4 | 399-416 | 179 | 3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038. | ||
A1R | Omvendt | CTGCAAGGACAG GCATCAA |
19 | 53 | 52.6 | 559-577 | 3DL 2 * 048 | |||||
3DP1 | A4F | Fremad | GTCCCCTGGTGA AATCAGA |
19 | 49 | 52.6 | 4 | 398-416 | 112 | Ingen | ||
A5R | Omvendt | GTGAGGCGCAAA GTGTCA |
18 | 52 | 55,6 | 492-509 | Ingen | |||||
2DS2 | A2F | Fremad | GTCGCCTGGTGA AATCAGA |
19 | 49 | 52.6 | 4 | 398-416 | 111 | Ingen | ||
A6R | Omvendt | TGAGGTGCAAAG TGTCCTTAT |
21 | 51 | 42,9 | 488-508 | Ingen | |||||
3DL 3 | A8Fa | Fremad | GTGAAATCGGGA GAGACG |
18 | 50 | 55,6 | 4 | 406-423 | 139 | Ingen | ||
A8Fb | Fremad | GGTGAAATCAGG AGAGACG |
19 | 50 | 52.6 | 405-423 | 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905. | |||||
A8R | Omvendt | AGTTGACCTGGG AACCCG |
18 | 51 | 61.1 | 526-543 | Ingen | |||||
3DL1e4 | B1F | Fremad | CATCGGTCCCAT GATGCT |
18 | 51 | 55,6 | 4 | 549-566 | 85 | 3DL 1 * 00505., 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089 | ||
B1R | Omvendt | GGGAGCTGACAA CTGATAGG |
20 | 52 | 55 | 614-633 | 3DL 1 * 00502 | |||||
3DS1 | B2F | Fremad | CATCGGTTCCAT GATGCG |
18 | 51 | 55,6 | 4 | 549-566 | 85 | 3DS1 * 047; kan afhente 3DL 1 * 054. | ||
B1R | Omvendt | GGGAGCTGACAA CTGATAGG |
20 | 52 | 55 | 614-633 | Ingen | |||||
2DL 1 | B3F | Fremad | TTCTCCATCAGT CGCATGAC |
20 | 52 | 50 | 4 | 544-563 | 96 | 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028 | ||
B3R | Omvendt | GTCACTGGGAGC TGACAC |
18 | 50 | 61.1 | 622-639 | 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030 | |||||
2DS1 | B4F | Fremad | TCTCCATCAGTC GCATGAA |
19 | 51 | 47.4 | 4 | 545-563 | 96 | 2DS1 * 001 | ||
B4R | Omvendt | GGTCACTGGGAG CTGAC |
17 | 49 | 64.7 | 624-640 | Ingen | |||||
2DS3 | B5F | Fremad | CTCCATCGGTCG CATGAG |
18 | 53 | 61.1 | 4 | 546-563 | 96 | Ingen | ||
B5R | Omvendt | GGGTCACTGGGA GCTGAA |
18 | 51 | 61.1 | 624-641 | Ingen | |||||
2DS5 | B6F2 | Fremad | AGAGAGGGGACG TTTAACC |
19 | 50 | 52.6 | 4 | 475-493 | 173 | Ingen | ||
B6R3 | Omvendt | TCCAGAGGGTCA CTGGGC |
18 | 53 | 66,7 | 630-647 | 2DS5 * 003 | |||||
2DL 4 | C1F | Fremad | GCAGTGCCCAGC ATCAAT |
18 | 52 | 55,6 | 5 | 808-825 | 83 | Ingen | ||
C1R | Omvendt | CCGAAGCATCTG TAGGTCT |
19 | 52 | 52.6 | 872-890 | 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019 | |||||
2DL 2 | 2DL2F4 | Fremad | GAGGTGGAGGCC CATGAAT |
19 | 52 | 57,9 | 5 | 778-796 | 151 | 2DL 2 * 009; 782G ændret til A. | ||
C3R2 | Omvendt | TCGAGTTTGACC ACTCGTAT |
20 | 51 | 45 | 909-928 | Ingen | |||||
2DS4 | C5F | Fremad | TCCCTGCAGTGC GCAGC |
17 | 57 | 70.6 | 5 | 803-819 | 120 | Ingen | ||
C5R | Omvendt | TTGACCACTCGT AGGGAGC |
19 | 52 | 57,9 | 904-922 | 2DS4 * 013 | |||||
2DS4Del | 2DS4Del | Fremad | CCTTGTCCTGCA GCTCCAT |
19 | 54 | 57,9 | 5 | 750-768 | 203 | Ingen | ||
2DS4R2 | Omvendt | TGACGGAAACAA GCAGTGGA |
20 | 53 | 50 | 933-952 | Ingen | |||||
2DS4FL | 2DS4FL | Fremad | CCGGAGCTCCTA TGACATG |
19 | 53 | 57,9 | 5 | 744-762 | 209 | Ingen | ||
2DS4R2 | Omvendt | TGACGGAAACAA GCAGTGGA |
20 | 53 | 50 | 933-952 | Ingen | |||||
2DL 3 | D1F | Fremad | AGACCCTCAGGA GGTGA |
17 | 48 | 58,8 | 9 | 1180-1196 | 156 | Ingen | ||
D1R | Omvendt | CAGGAGACAACT TTGGATCA |
20 | 50 | 45 | 1316-1335 | 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 og 2DL 3 * 01802 | |||||
2DL 5 | D2F | Fremad | CACTGCGTTTTC ACACAGAC |
20 | 52 | 50 | 9 | 1214-1233 | 120 | 2DL5B * 011 og 2DL5B * 020 | ||
D2R | Omvendt | GGCAGGAGACAA TGATCTT |
19 | 49 | 47.4 | 1315-1333 | Ingen | |||||
2DP1 | D3F | Fremad | CCTCAGGAGGTG ACATACGT |
20 | 53 | 55 | 9 | 1184-1203 | 121 | Ingen | ||
D3R | Omvendt | TTGGAAGTTCCG TGTACACT |
20 | 50 | 45 | 1285-1304 | Ingen | |||||
3DL1e9 | D4F | Fremad | CACAGTTGGATC ACTGCGT |
19 | 52 | 52.6 | 9 | 1203-1221 | 93 | 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068 | ||
D4R2 | Omvendt | CCGTGTACAAGA TGGTATCTGTA |
23 | 53 | 43.5 | 1273-1295 | 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098 | |||||
3DL2e9 | D4F | Fremad | CACAGTTGGATC ACTGCGT |
19 | 52 | 52.6 | 9 | 1203-1221 | 156 | Ingen | ||
D5R | Omvendt | GACCTGACTGTG GTGCTCG |
19 | 54 | 63,2 | 1340-1358 | Ingen | |||||
STAT6 | STAT6F | Fremad | CCAGATGCCTAC CATGGTGC |
20 | 54 | 60 | 129 | |||||
STAT6R | Omvendt | CCATCTGCACAG ACCACTCC |
20 | 54 | 60 |
Tabel 4: sekvenser af primere bruges i qKAT 1, 27.
KIR gen | 3DL 3 | 2DS2 | 2DL 2 | 2DL 3 | 2DP1 | 2DL 1 | 3DP1 | 2DL 4 | 3DL 1 EX9 |
3DL 1 EX9 |
3DS1 | 2DL 5 | 2DS3 | 2DS5 | 2DS1 | 2DS4 I alt |
2DS4 FL |
2DS4 DEL |
3DL 2 EX4 |
3DL 2 EX9 |
|
Hyppigste eksemplarnummer | 2 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 2 | 2 |
Tabel 5: Hyppigste kopi nummer for KIR gener almindeligt observeret i EU-oprindelse prøver.
Linkage ubalance regler for qKAT baseret på europæiske populationer | Kopi nummer check | |||||||
1 | KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 og KIR3DL2 er rammerne gener til stede på begge haplotypes. | KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 og KIR3DL2 = 2 | ||||||
2 | KIR2DS2 og KIR2DL2 er i LD med hinanden | 2DS2=2 DL 2 | ||||||
3 | KIR2DL2 og KIR2DL3 er alleler af samme gen | 2 DL 2+2 DL 3= 2 | ||||||
4 | KIR2DP1 og KIR2DL1 er i LD med hinanden | 2DP1=2 DL 1 | ||||||
5 | Exon 4 af KIR3DL1 og KIR3DL2 er lig med exon 9 af KIR3DL1 og KIR3DL2 henholdsvis. | 3DL1ex4=3DL1ex9 og 3DL2ex4=3DL2ex9 | ||||||
6 | KIR3DL1 og KIR3DS1 er alleler | 3 DL 1+3DS1= 2 | ||||||
7 | KIR2DS3 og KIR2DS5 er i LD med KIR2DL5 | 2DS3+2DS5=2 DL 5 | ||||||
8 | KIR3DS1 og KIR2DS1 er i LD | 3DS1=2DS1 | ||||||
9 | Tilstedeværelsen af KIR2DS1 og KIR2DS4Total er gensidigt udelukkende på en haplotype | 2DS1+2DS4TOTAL= 2 | ||||||
10 | KIR2DS4FL og KIR2DS4del er varianter af KIR2DS4TOTAL | 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL |
Tabel 6: kobling uligevægt mellem KIR gener almindeligt observeret i EU-oprindelse populationer kan bruges til at kontrollere kopi taldata 1,27.
Discussion
Vi beskrev en roman halvautomatiske høj overførselshastighed metode, kaldet qKAT, som letter kopi nummer typning af KIR gener. Metoden er en forbedring over konventionelle metoder som SSP-PCR, som er lav-overførselshastighed og kan kun angive tilstedeværelsen eller fraværet af disse meget polymorfe gener.
Rigtigheden af den kopi nummer data indhentet er afhængig af flere faktorer, herunder kvalitet og koncentration-ensartethed af gDNA prøver og kvaliteten af reagenserne. Kvaliteten og nøjagtigheden af gDNA prøver på tværs af en plade er yderst vigtig da variationer i koncentrationen i hele pladen kan resultere i fejl i beregningen af antal kopier. Da assays blev valideret ved hjælp af EU-oprindelse prøve sæt, kræver data fra kohorter fra andre dele af verden mere grundig kontrol. Dette er at sikre, at forekomster af allel frafald eller ikke-specifikke primer/sonden bindende ikke misfortolkes som copy number variation.
Mens assays blev designet og optimeret til at køre som høj overførselshastighed, kan de ændres for at køre færre prøver. Tillid til metrikværdien i kopi nummer analyse software påvirkes når analyserer færre prøver, men dette kan forbedres, hvis kontrol genomisk DNA-prøver med et kendt KIR gen kopi nummer er medtaget på pladen og ekstra prøve replikater er inkluderet.
For laboratorier uden væske/plade-håndtering robotter, master mix kan udleveres ved hjælp af multi-kanal pipetter og plader kan indlæses manuelt i qPCR instrument.
Hovedformålet bag udviklingen af qKAT var at skabe en enkel, hurtig databehandling, høj opløsning og omkostningseffektiv metode til at genotype KIRs for sygdom association studier. Dette blev realiseret siden qKAT har været ansat i undersøge KIR rolle i flere store sygdom association undersøgelser, herunder en række smitsomme sygdomme, autoimmune sygdomme og graviditet lidelser4, 24 , 25 , 26.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Projektet har modtaget støtte fra medicinsk forskning Rådet (MRC), det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forskning og innovation program (grant aftale nr. 695551) og National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre og NIH forskning blod og transplantation Research Unit (NIHR BTRU) i organdonation og Transplantation på University of Cambridge og i partnerskab med NHS Blood og transplantation (NHSBT). De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis NHS, NIHR, Department of Health eller NHSBT.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |
References
- Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
- Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
- Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).
- Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
- Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
- Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
- Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
- Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
- Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
- Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
- van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
- Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
- Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
- van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
- Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
- Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
- Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
- Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
- Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
- Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).
- Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
- Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
- Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
- Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
- Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).