Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

qKAT: kvantitative Semi-automated at skrive Killer-celle immunglobulin-lignende Receptor gener

doi: 10.3791/58646 Published: March 6, 2019

Summary

Kvantitative killer celle immunglobulin-lignende receptor (KIR) semi-automatiske typing (qKAT) er en enkel, høj overførselshastighed og omkostningseffektiv metode til at kopiere nummer type KIR gener for deres anvendelse i befolkningen og sygdom association studier.

Abstract

Killer celle immunglobulin-lignende receptorer (KIRs) er et sæt af hæmmende og aktiverende immun receptorer, natural killer (NK) og T-celler, kodet af en polymorf klynge af gener på kromosom 19. Deres bedst karakteriserede ligander er human leukocyt antigen (HLA) molekyler, der er kodet i store histocompatibility complex (MHC) locus på kromosom 6. Der er betydelige beviser at de spiller en væsentlig rolle i immunitet, reproduktion og transplantation, hvilket gør det afgørende at have teknikker, der kan præcist genotype dem. Men høj-sekvens homologi, såvel som allel og copy number variation, gør det vanskeligt at designmetoder, der kan præcist og effektivt genotype alle KIR gener. Traditionelle metoder er som regel begrænset opløsning af data indhentet, overførselshastighed, omkostningseffektivitet og den tid, det tager for opsætning og drift af eksperimenter. Vi beskriver en metode kaldet kvantitative KIR halvautomatiske typing (qKAT), som er en høj overførselshastighed multiplex real-time polymerase kædereaktion metode, der kan afgøre gen kopi numre for alle gener i KIR locus. qKAT er en simpel høj overførselshastighed metode, der kan give høj opløsning KIR kopi nummer data, hvilket yderligere kan bruges til at udlede variationerne i de strukturelt polymorfe haplotypes, som omfatter dem. Denne kopi nummer og haplotype data kan være gavnligt for undersøgelser på storstilet sygdom foreninger, populationsgenetik, samt undersøgelser på udtryk og funktionel interaktioner mellem KIR og HLA.

Introduction

Hos mennesker er den killer immunglobulin-lignende receptor(KIR) locus er kortlagt på den lange arm af kromosom 19 inden for leukocyt receptor kompleks (LRC). Denne locus er omkring 150 kb i længde og omfatter 15 KIR gener arrangeret hoved-til-hale. KIR loci, der er kendt for i øjeblikket er KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, og to pseudogenes, KIR2DP1 og KIR3DP1. KIR gener koder for todimensionale (2D) og tredimensionale (3D) immunglobulin-lignende domæne receptorer med kort (S, aktivering) eller lang (L; hæmmende) cytoplasmatisk hale, som er fremført af naturlige dræberceller (NK) og delmængder af T celler. Copy number variation udstillet i KIR locus former forskellige haplotypes med variabel gen indhold1. Non-allel homologe rekombination (NAHR), lettes ved en tæt hoved-til-hale gen arrangement og høj-sekvens homologi, er det, som foreslås at være ansvarlig for haplotypic variationen. Over 100 forskellige haplotypes er blevet rapporteret hos populationer på verdensplan1,2,3,4. Alle disse haplotypes kan opdeles i to hovedgrupper: A og B haplotypes. A haplotype indeholder 7 KIR gener: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, og KIR3DL2, som er hæmmende KIR gener, og den aktiverende KIR gen KIR2DS4. Men op til 70% af EU-oprindelse personer, der er homozygot for KIR haplotype A udelukkende medfører en ikke-funktionel "sletningen" form for KIR2DS45,6. Alle andre KIR gen kombinationer danne gruppe B haplotypes, herunder mindst én af de specifikke KIR gener KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, og KIR2DL5, og indeholder typisk to eller flere aktiverende KIR gener.

HLA klasse I molekylerne er blevet identificeret som ligander for visse hæmmende receptorer (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3og KIR3DL1), aktiverende receptorer (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, og KIR3DS1), og for KIR2DL4, som er en unik KIR , der indeholder en lang cytoplasmatisk hale som andre hæmmende KIR-receptorer, men også har et positivt ladede rester nær det ekstracellulære domæne, der er en fælles funktionen af andre aktiverende KIR -receptorer. Kombinationen af varianter inden for KIR gener og HLA-gener påvirker receptor ligand interaktion at figurer potentielle NK celle respons på det individuelle niveau7,8. Beviser fra genetiske association undersøgelser har antydet, at KIR spiller en rolle i viral modstand (e.g., human immundefekt virus [HIV]9 og hepatitis C virus [HCV]10), en vellykket transplantation 11, risikoen for graviditet lidelser og reproduktiv succes12,13, beskyttelse mod tilbagefald efter allogen hæmatopoietisk stamcelle transplantation (HSCT)14,15, 16, og risikoen for kræft17.

Kombinationen af høj-sekvens homologi og allel og haplotypic mangfoldighed præsenterer udfordringer i opgaven med præcist genotypebestemmelse KIR gener. Konventionelle metoder til at skrive KIR gener omfatter sekvens-specifikke primer (SSP) polymerase kædereaktion (PCR)18,19,20, sekvens-specifikke oligonukleotid sonde (SSOP) PCR21, og matrix assisted laser desorption ionisering-tid for flyvning massespektrometri (MALDI-TOF MS)22. Ulemperne ved disse teknikker er, at de kun giver delvis indblik genotypen hos en enkeltperson, samtidig også være besværlig at udføre. Seneste er næste generation sequencing (NGS) blevet anvendt for at skrive KIR locus specifikt. Mens denne metode er meget kraftfuld, det kan være dyrt at køre, og det er tidskrævende at udføre dybdegående analyser og data kontrol.

qKAT er en høj overførselshastighed kvantitativ PCR metode. Mens konventionelle metoder er besværlig og tidskrævende, denne metode gør det muligt at køre næsten 1.000 genomisk DNA (gDNA) prøver i fem dage og giver KIR genotype, såvel som gen kopi nummer. qKAT består af ti multiplex reaktioner, som hver er rettet mod to KIR loci og en reference gen af en fast eksemplarnummer i genomet (STAT6) anvendes til den relative kvantificering af KIR -genet kopiere nummer23. Denne analyse har held været anvendt i studier med stor befolkning paneler og sygdom kohorter på infektionssygdomme som HCV, autoimmune sygdomme som type 1 diabetes, og graviditet lidelser såsom preeclampsia, samt give en genetisk understøttelse til undersøgelser med henblik på forståelse af NK celle funktion1,4,24,25,26.

Protocol

1. forberedelse og Plating ud af DNA

  1. Nøjagtigt kvantificere gDNA koncentrationen ved hjælp af en spektrofotometrisk eller fluorometriske instrument.
  2. Fortyndes DNA til 4 ng/µL på en 96-brønd deep-godt plade. Omfatte mindst én kontrolprøve gDNA med nogle kendte kopi og én ikke-skabelon kontrol.
  3. Der centrifugeres 96-brønd plader på 450 x g i 2 min.
  4. Ved hjælp af en flydende håndtering instrument, dispensere hver prøve i fire eksemplarer på 384-godt qPCR plader, således at hver godt 10 ng af DNA (2,5 µL/brønd). Forbered mindst ti 384-godt plader, én for hver enkelt qKAT reaktion.
  5. Hvis gDNA er der udleveres fra mere end én 96-brønd plade, udføre en fuld volumen vask med 2% blegemiddel og ultrarent vand til at rense af væsken håndtering system mellem hver 96-brønd plade af gDNA prøver nåle.
  6. Lufttørre DNA ved at inkubere 384-godt pladerne i et rent område ved rumtemperatur i mindst 24 timer.

2. forberedelse af primere og sonder

Bemærk: qKAT består af ti multiplex reaktioner. Hver reaktion omfatter tre primer par og tre fluorescens-mærket sonder, der specifikt forstærker to KIR gener og én reference genet. De sonder, som blev udgivet i Jiang et al.27 blev ændret, så oligonukleotider betegnes nu med ATTO farvestoffer, da de tilbyder forbedrede fotostabilitet og lange signal levetid. Pre-aliquoted primer kombinationer er kommercielt tilgængelige (Se Tabel af materialer).

  1. Forberede primer kombinationer for hver reaktion som de fortyndinger, der er angivet i tabel 1.
  2. Forbered sondens kombinationer for hver reaktion ifølge tabel 1. Test hver enkelt sonde inden du foretager kombinationen.

3. forberedelse af Master Mix

Bemærk De mængder, der er nævnt nedenfor er til at udføre en qKAT reaktion på et sæt af 10 x 384-godt plader.

  1. Sikre at gDNA prøver belagt på 384-godt plader er helt tørre. Gennemføre alle trin på is og holde de reagenser, der er omfattet af udsættelse for lys så meget som muligt, da de fluorescens-mærket sonder er foto - og thermo-følsomme.
  2. Afrimning qPCR buffer, primer og sonde alikvoter ved 4 ° C.
  3. På is, forberede en master mix 10 x 384-godt plader ved at tilføje 18.86 mL i ultrarent vand, 20 mL af qPCR buffer, 1.000 µL af preprepared primer kombination og 180 µL af preprepared sonde kombination (tabel 2).
  4. Distribuere den master mix jævnt på tværs af en 96-dybe godt plade ved hjælp af en multi-kanal pipette, når der afpipetteres 415 µL i hver brønd. Holde denne plade i en ice box dækket fra lys.
  5. Ved hjælp af en flydende håndtering instrument, dispensere 9,5 µL af den master mix i hver brønd af 384-godt plade med tørrede gDNA. Forsegle pladen med en folie og straks placerer det ved 4 ° C. Gentag denne proces for de resterende plader, at sikre, at nålene af væsken håndtering system er vasket med vand mellem hver plade.
  6. Centrifugeres 384-godt plader på 450 x g i 3 min og inkuberes dem ved 4 ° C natten over eller mellem 6-12 h resuspend DNA og sprede eventuelle luftbobler.

4. qPCR Assay

  1. Efter natten inkubation, centrifugeres ved 450 x g i 3 min. til at bortlede enhver resterende luftbobler.
  2. Henblik på automatisering, forbinde qPCR maskine (f.eks. LightCycler 480) til en mikrotiterplade handler (Se Tabel af materialer). Programmet mikrotiterplade handleren til at placere pladerne i qPCR maskine fra en nedkølet lagring dock, som er beskyttet mod lys.
    Bemærk assays bør, i teorien, arbejde på andre qPCR maskiner med kompatible optisk indstillinger.
  3. Brug følgende cykling betingelser: 95 ° C i 5 min. efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ° C til 15 s og 66 ° C 50 s, med dataindsamling på 66 ° C.
  4. Når kørslen er afsluttet, har robotten samle pladen fra qPCR maskine og placere den i udsmid dock.

5. efter Kør analyse

  1. Efter forstærkning, beregne kvantificering cyklus (Cq) værdier ved hjælp af enten den anden afledte maksimale metode eller metoden Fit punkter med software af qPCR maskine (Se Tabel af materialer), følge nedenstående trin.
  2. Åbn qPCR softwaren, og Åbn filen gemt reaktion eksperiment for én plade i fanen Navigator .
  3. Analyse ved hjælp af den anden afledte maksimale metode, Vælg fanen analyse, og oprette en ny analyse ved hjælp af Abs Quant/Second afledte Max metode.
    1. Vælg analysetypen i vinduet Opret ny analyse : Abs Quant/Second afledte Max metode, delmængde: alle prøver, program: forstærkning, navn: Rx-DFO (hvor x er tal, reaktion).
    2. Vælg Filter kam og vælg VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Dette sikrer, at data indsamlet for STAT6 er markeret.
    3. Vælg farve kompensation for VIC/HEX/Yellow555(533-580). Klik på Beregn. Gentag dette for Fam (465-510) og Cy5/Cy5.5(618-660). Klik på Gem fil.
  4. Analyse ved hjælp af metoden Fit punkter, skal du vælge Abs Quant/Fit punkter i fanen analyse.
    1. Vælg analysetypen i vinduet Opret ny analyse : Abs Quant/Fit point metode, delmængde: alle prøver, program: forstærkning, navn: RxF-DFO (hvor x er tal, reaktion).
    2. Vælg den korrekte filtre og farve kompensationer for STAT6 og hver af KIR gener (Fam/Cy5). Under fanen Noiseband Angiv støj bandet at udelukke baggrundsstøj.
    3. I fanen analyse angivet de punkter, der passer til 3 og vælge Vis passer point. Klik på Beregn. Klik på Gem fil.

6. eksport af resultaterne

  1. Åbn Navigator i qPCR software, tab. Vælg Resultater Batch eksport.
  2. Åbn den mappe, hvor eksperimentet filerne gemmes og overføre filer ind i højre del af vinduet. Klik på næste. Vælg navnet på og placeringen af eksportfilen.
  3. Vælg analysetypen Abs Quant/Second afledte Max metode eller Abs Quant/Fit point. Klik på næste. Kontrollere, at navnet på filen, mappen eksport og analysetypen er korrekte, og klik på næste for at starte eksportprocessen.
  4. Vent indtil Eksportere Status er Ok. Skærmen vil automatisk flytte til næste trin. Kontroller, at alle valgte filer er eksporteret korrekt således at antallet af filer mislykkedes = 0. Klik på udført.
  5. Bruge scripts split_file.pl og roche2sds.pl til at opdele de eksporterede plader i individuelle reaktioner for hver plade.
    Bemærk scripts leveres på anmodning/GitHub.

7. kopi nummer beregninger

  1. Åbn kopi nummer analyse software (f.eks. CopyCaller). Vælg Importer real-time PCR resultatfil og indlæse tekstfiler skabt af roche2sds.pl.
  2. Vælg analyser og foretage analysen, ved enten at vælge kalibrator prøve med kendte kopi nummer eller vælge hyppigste kopi nummer. Se tabel 5 for det mest hyppige kopi antal KIR gener typisk observeret i EU-oprindelse populationer.

8. data-kvalitet kontrollerer

  1. Brug R script KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R at kombinere kopi nummer data fra alle pladerne i et regneark.
    Bemærk scripts leveres på anmodning/GitHub.
  2. Recheck rådata på kopi nummer analyse software for prøver, der ikke er i overensstemmelse med den kendte kobling ubalance (LD) for KIR gener (tabel 6).

Representative Results

Kopi nummer analyse kan foretages ved at eksportere filer til kopi nummer analyse software, som giver den forudsagte og anslåede kopi nummer baseret på metoden ΔΔCq.

Kopi nummer kan forudsiges enten baseret på det kendte eksemplar antal kontrol DNA prøver på pladen eller ved at indtaste den mest hyppige gen kopi nummer (tabel 5). Figur 1 viser resultaterne af en plade for en reaktion, der er rettet mod KIR2DL4 og KIR3DS1samt reference-gen STAT6. Den hyppigste kopi nummer til KIR2DL4, et framework gen i KIR locus, er to eksemplarer, der henviser til, at den mest hyppige eksemplarnummer for KIR3DS1, en aktiverende genet, er en kopi. Resultaterne i figur viser PCR forstærkning parceller observeret på qPCR software og kopiere nummer data genereret fra qPCR data. Som vist, er analysen stand til at skelne mellem 0, 1, 2, 3 og 4 KIR gen kopi numre. Kopi nummer analyse software giver også mulighed for en visning af fordelingen af kopi antallet på tværs af pladen som et cirkeldiagram eller et søjlediagram. Effekten af kopi nummer forudsigelse er lavere for prøver med en højere kopi nummer.

Kvaliteten af alle materialer i reaktioner, gDNA, buffer, primere og sonder, kan påvirke nøjagtigheden af resultaterne. Uoverensstemmelse i resultater er imidlertid mest sandsynligt at være forårsaget på grund af variation i koncentrationen af DNA på tværs af en plade. Renheden af det udtrukne gDNA, der kan måles ved hjælp af 260/280 og 260/230-forhold, kan også have en effekt på kvaliteten. En 260/280-forholdet mellem 1,8-2 og en 260/230 forholdet mellem 2-2.2 er ønskeligt. En ujævn vifte af DNA fusioner på tværs af en plade kan føre til en høj variabilitet i tærskel cyklussen (Ct) mellem prøver og uoverensstemmelse i rækken af de anslåede eksemplarnummer. Resultaterne i figur 2 viser effekten af forskellen mellem Ct -værdier på tværs af en plade kan have på nøjagtighed i forudsigelse af kopi nummer. Den røde linje angiver vifte af anslåede kopi antallet for en prøve, og ideelt set bør være så tæt på et heltal som muligt.

Kopi nummer data, når analyseret, kan eksporteres som en regnearksfil i 96-brønds format. Vi anvendte en R skrift (fås på anmodning) til at kombinere kopi taldata af alle 10 plader, der køres som et sæt ind i et regneark. Offentliggjorte data om KIRs fra hovedsagelig EU-oprindelse populationer giver forudsigelse af LD regler, der findes mellem forskellige gener i KIR komplekse1. Disse forudsigelser er brugt til at foretage efterfølgende kontrol af kopi nummer resultaterne (tabel 6). Prøver, der ikke er i overensstemmelse med den forventede LD mellem gener kan indeholde usædvanlige polymorfi eller haplotypic strukturelle variationer. Et rutediagram, der beskriver protokollen er vist i figur 3.

Et værktøj kaldet KIR Haplotype id (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) blev udviklet for at lette imputering af haplotypes fra datasættet. Imputering virker på grundlag af en liste over reference haplotypes observeret i en EU-oprindelse befolkningen1. Men værktøjet også mulighed for en brugerdefineret sæt reference haplotypes skal bruges i stedet. Tre separate filer genereres; den første fil lister alle haplotype kombinationer for en prøve, den anden fil indeholder en trimmet liste over de kombinationer af haplotypes, som har de højeste kombinerede frekvenser, og den tredje fil lister de prøver, der ikke kan tildeles haplotypes. Ikke-tildeling af haplotypes kunne bruges som en indikator for romanen haplotypes.

Figure 1
Figur 1: repræsentative resultater af en plade for reaktion nummer 5. (A) dette panel viser forstærkning parceller. (B) dette panel viser kopiere nummer parceller. (C) dette panel viser kopi nummer distribution. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative resultater af en plade med en variabel DNA til reaktion nummer 5. (A) dette panel viser forstærkning parceller. (B) dette panel viser kopiere nummer parceller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: rutediagram i qKAT protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Analysen Gener Fremad primere Koncentration (nM) Omvendt primere Koncentration (nM) Sonder Koncentration (nM)
No 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150
2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200
2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150
2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 4 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 P4b 150
3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 P4b 150
2DL 4 C1F 200 C1R 200 P5b - 2DL 4 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 6 2DL 1 B3F 500 B3R 125 P4b 150
2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4b 150
2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 P4b 150
3DL2e9 D4F 250 D5R 125 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150
2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4b 150
2DS4 C5F 250 C5R 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150

Tabel 1: kombination og koncentration af primere og sonder anvendes i hver enkelt qKAT reaktion 27 .

Reaktion Primer delprøver (µL) Sonden delprøver (µL)
R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 VAND STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60
R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R VAND STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6
2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60
Bemærk: Brug 20 µL mindre vand i MasterMix
R3 3DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 VAND STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60
R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 VAND STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60
R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R VAND STAT6F STAT6R P4B P5B - 2L 4 PSTAT6
2DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60
R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R VAND STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60
R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R VAND STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60
R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R VAND STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60
R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 VAND STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60
R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R VAND STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6
2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60

Tabel 2: Bind (µL) af 100 µM primer/sonden stamopløsninger primer og sonde kombination delprøver.

Navn Retning 5´ ændring 3´ ændring Rækkefølge (5' →3') Længde TM GC % Exon Position
P4a Forstand FAM BHQ-1 TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA
27 60 44,4 4 425-451
P4b Antisensstoffer FAM BHQ-1 AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T
28 62 50 4 576-603
P5b Forstand ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG
25 60 52 5 828-852
P5b - 2DL 4 Forstand ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG
25 61 56 5 828-852
P9 Forstand ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC
24 60 62,5 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT
26 62 50

Tabel 3: oversigt over sonder anvendes i qKAT 1, 27. de fluorescerende farvestoffer brugt i 5' slutningen af oligo-prober P5b, P5b - 2 DL 4, P9 og PSTAT6 blev ændret til ATTO farvestoffer.

Gen Primere Retning Sekvens (5´-3´) Længde TM GC % Exon Position Amplikon (bp) Måske er gået glip af alleler
3DL2e4 A1F Fremad GCCCCTGCTGAA
ATCAGG
18 52 61.1 4 399-416 179 3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
A1R Omvendt CTGCAAGGACAG
GCATCAA
19 53 52.6 559-577 3DL 2 * 048
3DP1 A4F Fremad GTCCCCTGGTGA
AATCAGA
19 49 52.6 4 398-416 112 Ingen
A5R Omvendt GTGAGGCGCAAA
GTGTCA
18 52 55,6 492-509 Ingen
2DS2 A2F Fremad GTCGCCTGGTGA
AATCAGA
19 49 52.6 4 398-416 111 Ingen
A6R Omvendt TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT
21 51 42,9 488-508 Ingen
3DL 3 A8Fa Fremad GTGAAATCGGGA
GAGACG
18 50 55,6 4 406-423 139 Ingen
A8Fb Fremad GGTGAAATCAGG
AGAGACG
19 50 52.6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8R Omvendt AGTTGACCTGGG
AACCCG
18 51 61.1 526-543 Ingen
3DL1e4 B1F Fremad CATCGGTCCCAT
GATGCT
18 51 55,6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505., 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1R Omvendt GGGAGCTGACAA
CTGATAGG
20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502
3DS1 B2F Fremad CATCGGTTCCAT
GATGCG
18 51 55,6 4 549-566 85 3DS1 * 047; kan afhente 3DL 1 * 054.
B1R Omvendt GGGAGCTGACAA
CTGATAGG
20 52 55 614-633 Ingen
2DL 1 B3F Fremad TTCTCCATCAGT
CGCATGAC
20 52 50 4 544-563 96 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3R Omvendt GTCACTGGGAGC
TGACAC
18 50 61.1 622-639 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1 B4F Fremad TCTCCATCAGTC
GCATGAA
19 51 47.4 4 545-563 96 2DS1 * 001
B4R Omvendt GGTCACTGGGAG
CTGAC
17 49 64.7 624-640 Ingen
2DS3 B5F Fremad CTCCATCGGTCG
CATGAG
18 53 61.1 4 546-563 96 Ingen
B5R Omvendt GGGTCACTGGGA
GCTGAA
18 51 61.1 624-641 Ingen
2DS5 B6F2 Fremad AGAGAGGGGACG
TTTAACC
19 50 52.6 4 475-493 173 Ingen
B6R3 Omvendt TCCAGAGGGTCA
CTGGGC
18 53 66,7 630-647 2DS5 * 003
2DL 4 C1F Fremad GCAGTGCCCAGC
ATCAAT
18 52 55,6 5 808-825 83 Ingen
C1R Omvendt CCGAAGCATCTG
TAGGTCT
19 52 52.6 872-890 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2 2DL2F4 Fremad GAGGTGGAGGCC
CATGAAT
19 52 57,9 5 778-796 151 2DL 2 * 009; 782G ændret til A.
C3R2 Omvendt TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT
20 51 45 909-928 Ingen
2DS4 C5F Fremad TCCCTGCAGTGC
GCAGC
17 57 70.6 5 803-819 120 Ingen
C5R Omvendt TTGACCACTCGT
AGGGAGC
19 52 57,9 904-922 2DS4 * 013
2DS4Del 2DS4Del Fremad CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT
19 54 57,9 5 750-768 203 Ingen
2DS4R2 Omvendt TGACGGAAACAA
GCAGTGGA
20 53 50 933-952 Ingen
2DS4FL 2DS4FL Fremad CCGGAGCTCCTA
TGACATG
19 53 57,9 5 744-762 209 Ingen
2DS4R2 Omvendt TGACGGAAACAA
GCAGTGGA
20 53 50 933-952 Ingen
2DL 3 D1F Fremad AGACCCTCAGGA
GGTGA
17 48 58,8 9 1180-1196 156 Ingen
D1R Omvendt CAGGAGACAACT
TTGGATCA
20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 og 2DL 3 * 01802
2DL 5 D2F Fremad CACTGCGTTTTC
ACACAGAC
20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 og 2DL5B * 020
D2R Omvendt GGCAGGAGACAA
TGATCTT
19 49 47.4 1315-1333 Ingen
2DP1 D3F Fremad CCTCAGGAGGTG
ACATACGT
20 53 55 9 1184-1203 121 Ingen
D3R Omvendt TTGGAAGTTCCG
TGTACACT
20 50 45 1285-1304 Ingen
3DL1e9 D4F Fremad CACAGTTGGATC
ACTGCGT
19 52 52.6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2 Omvendt CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA
23 53 43.5 1273-1295 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9 D4F Fremad CACAGTTGGATC
ACTGCGT
19 52 52.6 9 1203-1221 156 Ingen
D5R Omvendt GACCTGACTGTG
GTGCTCG
19 54 63,2 1340-1358 Ingen
STAT6 STAT6F Fremad CCAGATGCCTAC
CATGGTGC
20 54 60 129
STAT6R Omvendt CCATCTGCACAG
ACCACTCC
20 54 60

Tabel 4: sekvenser af primere bruges i qKAT 1, 27.

KIR gen 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DP1 2DL 4 3DL 1
EX9
3DL 1
EX9
3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4
I alt
2DS4
FL
2DS4
DEL
3DL 2
EX4
3DL 2
EX9
Hyppigste eksemplarnummer 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

Tabel 5: Hyppigste kopi nummer for KIR gener almindeligt observeret i EU-oprindelse prøver.

Linkage ubalance regler for qKAT baseret på europæiske populationer Kopi nummer check
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 og KIR3DL2 er rammerne gener til stede på begge haplotypes. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 og KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 og KIR2DL2 er i LD med hinanden 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 og KIR2DL3 er alleler af samme gen 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 og KIR2DL1 er i LD med hinanden 2DP1=2 DL 1
5 Exon 4 af KIR3DL1 og KIR3DL2 er lig med exon 9 af KIR3DL1 og KIR3DL2 henholdsvis. 3DL1ex4=3DL1ex9 og 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 og KIR3DS1 er alleler 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 og KIR2DS5 er i LD med KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 og KIR2DS1 er i LD 3DS1=2DS1
9 Tilstedeværelsen af KIR2DS1 og KIR2DS4Total er gensidigt udelukkende på en haplotype 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL og KIR2DS4del er varianter af KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabel 6: kobling uligevægt mellem KIR gener almindeligt observeret i EU-oprindelse populationer kan bruges til at kontrollere kopi taldata 1,27.

Discussion

Vi beskrev en roman halvautomatiske høj overførselshastighed metode, kaldet qKAT, som letter kopi nummer typning af KIR gener. Metoden er en forbedring over konventionelle metoder som SSP-PCR, som er lav-overførselshastighed og kan kun angive tilstedeværelsen eller fraværet af disse meget polymorfe gener.

Rigtigheden af den kopi nummer data indhentet er afhængig af flere faktorer, herunder kvalitet og koncentration-ensartethed af gDNA prøver og kvaliteten af reagenserne. Kvaliteten og nøjagtigheden af gDNA prøver på tværs af en plade er yderst vigtig da variationer i koncentrationen i hele pladen kan resultere i fejl i beregningen af antal kopier. Da assays blev valideret ved hjælp af EU-oprindelse prøve sæt, kræver data fra kohorter fra andre dele af verden mere grundig kontrol. Dette er at sikre, at forekomster af allel frafald eller ikke-specifikke primer/sonden bindende ikke misfortolkes som copy number variation.

Mens assays blev designet og optimeret til at køre som høj overførselshastighed, kan de ændres for at køre færre prøver. Tillid til metrikværdien i kopi nummer analyse software påvirkes når analyserer færre prøver, men dette kan forbedres, hvis kontrol genomisk DNA-prøver med et kendt KIR gen kopi nummer er medtaget på pladen og ekstra prøve replikater er inkluderet.

For laboratorier uden væske/plade-håndtering robotter, master mix kan udleveres ved hjælp af multi-kanal pipetter og plader kan indlæses manuelt i qPCR instrument.

Hovedformålet bag udviklingen af qKAT var at skabe en enkel, hurtig databehandling, høj opløsning og omkostningseffektiv metode til at genotype KIRs for sygdom association studier. Dette blev realiseret siden qKAT har været ansat i undersøge KIR rolle i flere store sygdom association undersøgelser, herunder en række smitsomme sygdomme, autoimmune sygdomme og graviditet lidelser4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Projektet har modtaget støtte fra medicinsk forskning Rådet (MRC), det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forskning og innovation program (grant aftale nr. 695551) og National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre og NIH forskning blod og transplantation Research Unit (NIHR BTRU) i organdonation og Transplantation på University of Cambridge og i partnerskab med NHS Blood og transplantation (NHSBT). De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis NHS, NIHR, Department of Health eller NHSBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020
MilliQ water
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
  2. Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
  3. Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).
  4. Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
  5. Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
  6. Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
  7. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
  8. Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
  9. Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
  10. Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
  11. van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
  12. Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
  13. Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
  14. van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
  15. Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
  16. Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
  17. Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
  18. Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
  19. Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
  20. Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. 49-64 (2008).
  21. Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
  22. Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  24. Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
  25. Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
  26. Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
  27. Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).
qKAT: kvantitative Semi-automated at skrive Killer-celle immunglobulin-lignende Receptor gener
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter