Summary
Quantitativa delle cellule di assassino immunoglobulina-come recettore (KIR) semi-automatica digitando (qKAT) sono un metodo semplice, ad alta velocità e costi contenuto per copiare il numeri geni KIR di tipo per la loro applicazione negli studi di associazione di popolazione e la malattia.
Abstract
Recettori di immunoglobulina-come delle cellule killer (KIRs) sono un insieme di ricevitori immuni inibitori e d'attivazione, il natural killer (NK) e le cellule di T, codificate da un cluster polimorfico di geni sul cromosoma 19. Loro ligandi meglio caratterizzate sono le molecole (HLA) l'antigene umano del leucocita che sono codificate all'interno il locus di istocompatibilità complex (MHC) sul cromosoma 6. Vi sono prove concrete che giocano un ruolo significativo nell'immunità, riproduzione e trapianto, rendendo fondamentale avere tecniche che possono misurare con precisione il genotipo li. Tuttavia, alta omologia, anche come allelica e variazione numero di copia, rendono difficile al genotipo ed efficientemente i metodi di progettazione che possono misurare con precisione tutti i geni KIR . Metodi tradizionali sono solitamente limitati nella risoluzione dei dati ottenuti, velocità effettiva, rapporto costo-efficacia e il tempo impiegato per l'impostazione e l'esecuzione degli esperimenti. Descriviamo un metodo chiamato quantitativa KIR semi-automatico digitando (qKAT), che è un metodo di reazione a catena multipla della polimerasi in tempo reale di alto-rendimento che può determinare i numeri di copia del gene per tutti i geni del locus di KIR . qKAT è un semplice metodo di alto-rendimento che può fornire dati ad alta risoluzione KIR copia numeri, che possono essere ulteriormente utilizzati per dedurre le variazioni negli aplotipi strutturalmente polimorfici che li comprendono. Questi dati di numero e aplotipo di copia possono essere utili per gli studi su associazioni di malattia su larga scala, genetica delle popolazioni, nonché indagini sull'espressione e interazioni funzionali tra KIR e HLA.
Introduction
In esseri umani, il recettore immunoglobulina-come assassino(KIR) locus è mappato sul braccio lungo del cromosoma 19 all'interno del complesso recettoriale del leucocita (LRC). Questo locus è circa 150 kb di lunghezza e comprende 15 KIR geni disposti testa-coda. I loci KIR che sono attualmente noti sono KIR2DL1, KIR2DL2/ KIR2DL4,KIR2DL3, KIR3DL1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5/KIR3DS1, KIR3DL2-3, e due pseudogeni, KIR2DP1 e KIR3DP1. I geni KIR codificano per bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) immunoglobulina-come dominio recettori con breve (S; attivazione) o lungo (L; inibitorio) Code citoplasmatiche che sono espresse da cellule natural killer (NK) e sottoinsiemi di T cellule. Copia numero variazione esposte all'interno delle forme di locus KIR diversi aplotipi con gene variabile contenuto1. La ricombinazione omologa non allelica (NAHR), facilitata da una composizione di gene di testa-coda stretta e alta-omologia, è il meccanismo proposto per essere responsabili della variabilità hanno. Oltre 100 diversi aplotipi sono stati segnalati in popolazioni in tutto il mondo1,2,3,4. Tutti questi aplotipi potrebbero essere diviso in due gruppi principali: gli aplotipi di A e B. L'aplotipo A contiene 7 geni KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1e KIR3DL2, che sono inibitori KIR geni e l'attivazione KIR gene KIR2DS4. Tuttavia, fino al 70% degli individui di origine europea che sono omozigotici per KIR aplotipo A esclusivamente trasportare una forma non funzionale "eliminazione" di KIR2DS45,6. Tutte le altre combinazioni di geni KIR formano aplotipi di gruppo B, tra cui almeno uno dei geni KIR specifici KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, e KIR2DL5e in genere includono due o più geni KIR d'attivazione.
Molecole HLA di classe I sono stati identificati come i ligandi per determinati recettori inibitori (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e KIR3DL1), attivando i recettori (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5e KIR3DS1), e per KIR2DL4, che è un unico KIR che contiene un citoplasmico lunghe code come altri recettori inibitori KIR, ma ha anche un residuo di caricato positiva vicino il dominio extracellulare che è un comune caratteristica di altri recettori KIR d'attivazione. La combinazione di varianti all'interno dei geni KIR e i geni HLA influenza interazione ligando del recettore che reattività potenziali forme NK cella al livello individuale7,8. La prova dagli studi di associazione genetica ha indicato che KIR svolge un ruolo nella resistenza virale (ad es.., virus dell'immunodeficienza umana [HIV]9 ed epatite C [HCV] virus10), il successo del trapianto 11, il rischio di gravidanza disturbi e successo riproduttivo12,13, la protezione contro la ricaduta dopo trapianto ematopoietico allogeneic della cellula formativa (HSCT) trapianto14,15, 16e il rischio di cancri17.
La combinazione di alta-omologia e allelica e hanno diversità presenta sfide nel compito di accuratamente geni KIR di genotipizzazione. I metodi convenzionali di geni KIR tipo comprendono primer sequenza-specifici (SSP) polimerasi reazione a catena (PCR)18,19,20, oligonucleotide sequenza-specific sonda (SSOP) PCR21, e aghi laser assistita desorbimento ionizzazione-tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS)22. Gli svantaggi di queste tecniche sono che essi forniscono solo parziale spaccato il genotipo di un individuo pur essendo anche laborioso da eseguire. Recentemente il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è stata applicata per digitare il locus KIR specificamente. Mentre questo metodo è molto potente, può essere costoso per l'esecuzione, ed è tempo di effettuazione di verifiche approfondite analisi e dati.
qKAT è un metodo PCR quantitativo ad alta produttività. Mentre i metodi convenzionali sono laboriosa e che richiede tempo, questo metodo rende possibile eseguire quasi 1.000 campioni di DNA (gDNA) genomici in cinque giorni e dà il genotipo KIR , così come il numero di copie del gene. qKAT è costituito da dieci reazioni multiplex, ciascuno dei quali destinato a due KIR loci e copia di un gene di riferimento di un numero fisso copia nel genoma (STAT6) utilizzato per la relativa quantificazione del gene di KIR numero23. Questo test è stato utilizzato con successo negli studi che coinvolgono la popolazione grandi pannelli e coorti di malattia malattie infettive come HCV, patologie autoimmuni come il diabete di tipo 1, e disturbi della gravidanza come la preeclampsia, così come fornire una genetica alla base di studi volti a comprendere le NK cell funzione1,4,24,25,26.
Protocol
1. preparazione e placcatura fuori dal DNA
- Quantificare con precisione la concentrazione gDNA utilizzando uno strumento spettrofotometrico o fluorometrica.
- Diluire il DNA a 4 ng / µ l su una piastra a 96 pozzetti profondi pozzetti. Includere almeno un controllo gDNA campione con un numero di copia nota e un modello di non controllo.
- Centrifugare le piastre da 96 pozzetti a 450 x g per 2 min.
- Utilizzando uno strumento di gestione dei liquidi, dispensare ogni campione in quadruplice copia sulle piastre 384 pozzetti qPCR affinché ogni pozzo ha 10 ng di DNA (2,5 µ l/pozzetto). Preparare almeno dieci piastre da 384 pozzetti, uno per ciascuna reazione di qKAT.
- Se gDNA è erogato da più di una piastra a 96 pozzetti, eseguire un lavaggio di intero volume con 2% candeggina e acqua ultrapura per pulire gli aghi del liquido sistema tra ogni piastra a 96 pozzetti dei campioni gDNA manipolazione.
- Asciugare il DNA incubando le piastre da 384 pozzetti in un'area pulita a temperatura ambiente per almeno 24 h.
2. preparazione del primer e sonde
Nota: qKAT è costituito da dieci reazioni multiplex. Ogni reazione comprende tre coppie di primer e tre sonde fluorescenza-etichetta che amplificano in particolare due geni KIR e gene di un riferimento. Le sonde che sono state pubblicate in Jiang et al.27 sono state modificate affinché i oligonucleotides ora sono contrassegnati con le tinture ATTO poiché offrono una migliorata fotostabilità e segnale deve percorrere lunghe durate. Primer pre-aliquotato combinazioni sono disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali).
- Preparare le combinazioni di primer per ogni reazione secondo le diluizioni riportati nella tabella 1.
- Preparare la sonda combinazioni per ogni reazione secondo la tabella 1. Ogni sonda individuo prima di effettuare la combinazione di prova.
3. preparazione della Master Mix
Nota I volumi di seguito indicati sono per l'esecuzione di uno qKAT reazione su un set di piastre da 10 x 384 pozzetti.
- Assicurarsi che i campioni di gDNA placcati sulle piastre da 384 pozzetti siano completamente asciutti. Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio e mantenere i reagenti coperti dall'esposizione alla luce per quanto possibile, dal momento che le sonde fluorescenza-labeled sono foto - e termo-sensibili.
- Sbrinare il buffer di qPCR, primer e aliquote di sonda a 4 ° C.
- Su ghiaccio, preparare un mix master per 10 x 384 pozzetti aggiungendo 18,86 mL di acqua ultrapura, 20 mL di buffer di qPCR, 1.000 µ l di combinazione preprepared primer e 180 µ l di combinazione preprepared sonda (tabella 2).
- Distribuire uniformemente il mix master su un piatto ben 96-profondo utilizzando una pipetta multicanale, pipettaggio 415 µ l in ogni pozzetto. Mantenere questo piatto in una scatola di ghiaccio coperta dalla luce.
- Utilizzando uno strumento di gestione dei liquidi, dispensare 9,5 µ l di mix master in ciascun pozzetto della piastra 384 pozzetti con gDNA secco. Sigillare la piastra con un foglio e mettere immediatamente a 4 ° C. Ripetere questo processo per le piastre rimanenti, assicurando che gli aghi del liquido sistema di movimentazione vengono lavati con acqua tra ogni piatto.
- Centrifugare le piastre da 384 pozzetti a 450 x g per 3 min e li Incubare a 4 ° C durante la notte o tra 6-12 h per risospendere il DNA e dissipare eventuali bolle d'aria.
4. qPCR Assay
- Dopo l'incubazione overnight, centrifugare a 450 x g per 3 min dissipare eventuali bolle d'aria rimanente.
- Ai fini dell'automazione, connettere la macchina qPCR (ad es., LightCycler 480) a un gestore di micropiastre (Vedi Tabella materiali). Programma per il gestore di micropiastre per inserire le piastre della macchina di qPCR da un bacino di stoccaggio refrigerato che è protetto dalla luce.
Nota i saggi dovrebbero, in teoria, funzionare su altre macchine di qPCR con impostazioni ottiche compatibili. - Utilizzare le seguenti condizioni in bicicletta: 95 ° C per 5 min, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 15 s e 66 ° C per 50 s, con raccolta di dati a 66 ° C.
- Una volta che viene completata l'esecuzione, è necessario avere il robot raccogliere la piastra dalla macchina qPCR e inserirlo nel dock scartare.
5. post-esecuzione analisi
- Dopo l'amplificazione, calcolare i valori di ciclo (Cq) quantificazione utilizzando il secondo metodo di massimo derivato o il metodo di punti di adattamento con il software della macchina qPCR (Vedi Tabella materiali), procedi nel seguente modo.
- Aprire il software di qPCR e, nella scheda Navigator , aprire il file di esperimento di reazione salvato per una piastra.
-
Per l'analisi utilizzando il secondo metodo di massimo derivato, selezionare la scheda di analisi e create una nuova analisi utilizzando il metodo Abs Quant/Second derivato Max.
- Nella finestra Crea nuova analisi , selezionare il tipo di analisi: metodo Abs Quant/Second derivato Max, sottoinsieme: tutti i campioni, programma: amplificazione, nome: Rx-DFO (dove x è il numero di reazione).
- Selezionare Filtro pettine e scegliere VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Ciò assicura che i dati raccolti per STAT6 sono selezionati.
- Selezionare compensazione del colore per VIC/HEX/Yellow555(533-580). Fare clic su Calcola. Ripetere questa operazione per Fam (465-510) e Cy5/Cy5.5(618-660). Fare clic su Salva file.
-
Per l'analisi mediante il metodo di punti di adattamento, selezionare Abs Quant/Fit punti nella scheda analisi.
- Nella finestra Crea nuova analisi , selezionare il tipo di analisi: metodo Abs Quant/Fit punti, sottoinsieme: tutti i campioni, programma: amplificazione, nome: RxF-DFO (dove x è il numero di reazione).
- Selezionare i filtri corretti e compensazioni di colore per STAT6 e ciascuno dei geni KIR (Fam/Cy5). Nella scheda Noiseband , impostare la banda di rumore per escludere il rumore di fondo.
- Nella scheda analisi , impostare i punti di adattamento a 3 e selezionare che Visualizza i punti di adattamento. Fare clic su Calcola. Fare clic su Salva file.
6. esportazione dei risultati
- Nel software qPCR, aprire il navigatore scheda selezionare Risultati Batch Export.
- Aprire la cartella in cui i file di esperimento sono salvati e trasferire i file nella sezione destra della finestra. Fare clic su Avanti. Selezionare il nome e il percorso del file di esportazione.
- Selezionare il tipo di analisi Metodo Max di derivato Quant/Second Abs o Abs Quant/Fit punti. Fare clic su Avanti. Verifica che il nome del file, la cartella di esportazione e il tipo di analisi siano corretto e fare clic su Next per avviare il processo di esportazione.
- Attendere che lo Stato di esportazione è Ok. Lo schermo passa automaticamente alla fase successiva. Verifica che tutti i file selezionati sono stati esportati con successo affinché il numero di file non riusciti = 0. Fare clic su fatto.
- Utilizzare gli script split_file.pl e roche2sds.pl per dividere le piastre esportate in reazioni individuali per ogni piatto.
Nota gli script sono disponibili su richiesta/GitHub.
7. copiare il numero di calcoli
- Aprire il software di analisi numero copie (ad esempio, CopyCaller). Selezionare Importa file di risultati PCR in tempo reale e caricare file di testo creati da roche2sds.pl.
- Seleziona analizza e condurre l'analisi sia selezionando campione calibratore con numero di copia nota oppure selezionando numero di copia più frequente. Vedere tabella 5 per il numero più frequente di copia dei geni KIR in genere osservata in popolazioni di origine europea.
8. qualità dei dati controlla
- Utilizzare script di R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R per combinare dati di numero di copia da tutti i piatti in un foglio di calcolo.
Nota gli script sono disponibili su richiesta/GitHub. - Ricontrollare i dati grezzi sul software di analisi numero di copia per i campioni non conformi per il noto squilibrio (LD) per geni KIR (tabella 6).
Representative Results
Copia numero analisi possono essere effettuata esportando i file per il software di analisi numero copie, che fornisce il numero di copie previsto e stimato sulla base del metodo ΔΔCq.
Il numero di copia può essere previsto in base al numero di copia nota di campioni di DNA di controllo sulla piastra o inserendo il numero di copia del gene più frequente (tabella 5). La figura 1 Mostra i risultati di una piastra per una reazione che gli obiettivi di KIR2DL4 e KIR3DS1, come pure il gene di riferimento STAT6. Il numero di copia più frequente per KIR2DL4, un gene di quadro in luogo del KIR , è due copie, mentre il numero più frequente di copia per KIR3DS1, un gene d'attivazione, è una copia. I risultati in figura mostrano le trame di amplificazione di PCR osservate sul software qPCR e i dati di numero di copia generati dai dati qPCR. Come illustrato, il dosaggio è in grado di distinguere tra 0, 1, 2, 3 e 4 numeri di copia del gene KIR . Il software di analisi numero di copia consente inoltre una visualizzazione della distribuzione del numero di copia tutta la piastra come un grafico a torta o un grafico a barre. L'efficacia della previsione del numero di copia è inferiore per i campioni con un numero superiore di copia.
La qualità di tutti i materiali utilizzati nelle reazioni, gDNA, buffer, primer le sonde, può influenzare la precisione dei risultati ottenuti. Tuttavia, la discordanza nei risultati è più probabile essere causato a causa di variazione della concentrazione di DNA attraverso un piatto. La purezza del gDNA Estratto, che può essere misurata usando il 260/280 e 260/230 rapporti, può anche avere un effetto sulla qualità. Un rapporto di 260/280 di 1.8-2 e un 260/230 rapporto di 2-2.2 sono desiderabili. Una concentrazioni di gamma irregolare di DNA attraverso un piatto possono portare a un'alta variabilità del ciclo di soglia (Ct) tra campioni e discordanza nella gamma del numero stimato di copia. I risultati in Figura 2 mostrano l'effetto che la disparità tra i valori dit C attraverso un piatto può avere sulla precisione nella previsione del numero di copia. La linea rossa indica l'intervallo del numero stimato di copia per un campione e, idealmente, dovrebbe essere più vicino al valore integer come possibile.
I dati di numero di copia, una volta analizzati, possono essere esportati come un file di foglio di calcolo in un formato a 96 pozzetti. Abbiamo utilizzato uno script di R (disponibile su richiesta) per combinare i dati di numero di copia di tutti i 10 piatti che vengono eseguiti come un set in un foglio di calcolo. Dati pubblicati circa KIRs da popolazioni di origine europea principalmente consentono la previsione di regole di LD che esiste tra vari geni nel complesso KIR 1. Queste previsioni sono utilizzate per condurre controlli a valle sui copia numeri risultati ottenuti (tabella 6). Campioni non conformi per il LD previsto fra i geni potrebbero contenere polimorfismo insolito o hanno variazioni strutturali. Un diagramma di flusso che descrive il protocollo è illustrato nella Figura 3.
Uno strumento chiamato KIR aplotipo identificatore (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) è stato sviluppato per facilitare l'imputazione di aplotipi dal set di dati. L'imputazione lavora sulla base di un elenco di riferimento aplotipi osservati in una popolazione di origine europea1. Tuttavia, lo strumento permette anche per un set personalizzato di aplotipi di riferimento deve essere utilizzato invece. Vengono generati tre file distinti; il primo file elenca tutte le combinazioni di aplotipo per un campione, il secondo file viene fornito un elenco rifilato le combinazioni di aplotipi che hanno le più alte frequenze combinate e il terzo file elenca i campioni che non possono essere assegnati gli aplotipi. Non-assegnazione degli aplotipi potrebbe essere utilizzato come un indicatore del romanzo aplotipi.
Figura 1: numero di risultati rappresentativi di una piastra per reazione 5. (A) Questa amplificazione spettacoli pannello trame. (B), questo pannello spettacoli copiare Numero trame. (C), questo pannello mostra la distribuzione del numero di copia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: risultati rappresentativi di una piastra con una concentrazione variabile di DNA per reazione numero 5. (A) Questa amplificazione spettacoli pannello trame. (B), questo pannello spettacoli copiare Numero trame. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: diagramma di flusso del protocollo qKAT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Analisi | Geni | Forward primer | Concentrazione (nM) | Iniettori d'inversione | Concentrazione (nM) | Sonde | Concentrazione (nM) |
N. 1 | 3DP1 | A4F | 250 | A5R | 250 | P4a | 150 |
2DL 2 | 2DL2F4 | 400 | C3R2 | 600 | P5B | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
N. 2 | 2DS2 | A4F | 400 | A6R | 400 | P4a | 200 |
2DL 3 | D1F | 400 | D1R | 400 | P9 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
N. 3 | 3DL 3 | A8F | 500 | A8R | 500 | P4a | 150 |
2DS4Del | 2DS4Del | 250 | 2DS4R2 | 250 | P5B | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
N. 4 | 3DL1e4 | B1F | 250 | B1R | 125 | P4b | 150 |
3DL1e9 | D4F | 250 | D4R2 | 500 | P9 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
N. 5 | 3DS1 | B2F | 250 | B1R | 250 | P4b | 150 |
2DL 4 | C1F | 200 | C1R | 200 | P5B - 2DL 4 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
N. 6 | 2DL 1 | B3F | 500 | B3R | 125 | P4b | 150 |
2DP1 | D3F | 250 | D3R | 500 | P9 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
N. 7 | 2DS1 | B4F | 500 | B4R | 250 | P4b | 150 |
2DL 5 | D2F | 500 | D2R | 500 | P9 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
N. 8 | 2DS3 | B5F | 250 | B5R | 250 | P4b | 150 |
3DL2e9 | D4F | 250 | D5R | 125 | P9 | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
N. 9 | 3DL2e4 | A1F | 200 | A1R | 200 | P4a | 150 |
2DS4FL | 2DS4FL | 250 | 2DS4R2 | 500 | P5B | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 | |
N. 10 | 2DS5 | B6F2 | 200 | B6R3 | 200 | P4b | 150 |
2DS4 | C5F | 250 | C5R | 250 | P5B | 150 | |
STAT6 | STAT6F | 200 | STAT6R | 200 | PSTAT6 | 150 |
Tabella 1: combinazione e concentrazione di primer e sonde utilizzate in ogni reazione di qKAT 27 .
Reazione | Aliquote di primer (µ l) | Sonda di aliquote (µ l) | |||||||||
R1 | 3DP1 | A4F | A5R | 2DL2F4 | C3R2 | ACQUA | STAT6F | STAT6R | P4A | P5B | PSTAT6 |
2DL 2 | 100 | 100 | 160 | 240 | 200 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R2 | 2DS2 | A2F | A6R | D1F | D1R | ACQUA | STAT6F | STAT6R | P4A | P9 | PSTAT6 |
2DL 3 | 160 | 160 | 160 | 160 | 160 | 80 | 80 | 80 | 60 | 60 | |
Nota: è necessario 20 µ l meno acqua nel MasterMix | |||||||||||
R3 | 3DL 3 | A8F A8FB | A8R | 2DS4DELF | 2DS4R2 | ACQUA | STAT6F | STAT6R | P4A | P5B | PSTAT6 |
2DS4DEL | 100 100 | 200 | 100 | 100 | 200 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R4 | 3DL1E4 | B1F | B1R | D4F | D4R2 | ACQUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
3DL1E9 | 100 | 50 | 100 | 200 | 350 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R5 | 3DS1 | B2F | B1R | C1F | C1R | ACQUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P5B - 2L 4 | PSTAT6 |
2DL 4 | 100 | 100 | 80 | 80 | 440 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R6 | 2DL 1 | B3F | B3R | D3F | D3R | ACQUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
2DP1 | 200 | 50 | 100 | 200 | 250 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R7 | 2DS1 | B4F | B4R | D2F | D2R | ACQUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
2DL 5 | 200 | 100 | 200 | 200 | 100 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R8 | 2DS3 | B5F | B5R | D4F | D5R | ACQUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P9 | PSTAT6 |
3DL2E9 | 100 | 100 | 100 | 50 | 450 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R9 | 3DL2E4 | A1F | A1R | 2DS4WTF | 2DS4R2 | ACQUA | STAT6F | STAT6R | P4A | P5B | PSTAT6 |
2DS4WT | 80 | 80 | 100 | 200 | 340 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 | |
R10 | 2DS5 | B6F2 | B6R3 | C5F | C5R | ACQUA | STAT6F | STAT6R | P4B | P5B | PSTAT6 |
2DS4TOTAL | 80 | 80 | 100 | 100 | 440 | 80 | 80 | 60 | 60 | 60 |
Tabella 2: Soluzioni per rendere primer e sonde aliquote di combinazione di riserva di volume (µ l) di 100 µM primer/sonda.
Nome | Direzione | modifica a 5 minuti | 3 ´ modifica | Sequenza (5' →3') | Lunghezza | TM | GC % | Esone | Posizione |
P4a | Senso | FAM | BHQ-1 | TCATCCTGC AATGTTGGT CAGATGTCA |
27 | 60 | 44,4 | 4 | 425-451 |
P4b | Antisenso | FAM | BHQ-1 | AACAGAACC GTAGCATCT GTAGGTCCC T |
28 | 62 | 50 | 4 | 576-603 |
P5B | Senso | ATTO647N | BHQ-2 | AACATTCCA GGCCGACT TTCCTCTG |
25 | 60 | 52 | 5 | 828-852 |
P5B - 2DL 4 | Senso | ATTO647N | BHQ-2 | AACATTCCA GGCCGACT TCCCTCTG |
25 | 61 | 56 | 5 | 828-852 |
P9 | Senso | ATTO647N | BHQ-2 | CCCTTCTCA GAGGCCCA AGACACC |
24 | 60 | 62,5 | 9 | 1246-1269 |
PSTAT6 | ATTO550 | BHQ-2 | CTGATTCCT CCATGAGCA TGCAGCTT |
26 | 62 | 50 |
Tabella 3: elenco delle sonde utilizzate in qKAT 1, 27. i coloranti fluorescenti utilizzati all'estremità 5' delle sonde oligo P5b, P5b - 2 DL 4, P9 e PSTAT6 sono stati modificati per ATTO coloranti.
Gene | Primer | Direzione | Sequenza (a 5 minuti-3 ´) | Lunghezza | TM | GC % | Esone | Posizione | Amplicon (bp) | Alleli potrebbero essere perso | ||
3DL2e4 | A1F | Avanti | GCCCCTGCTGAA ATCAGG |
18 | 52 | 61,1 | 4 | 399-416 | 179 | 3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038. | ||
A1R | Invertire | CTGCAAGGACAG GCATCAA |
19 | 53 | 52,6 | 559-577 | 3DL 2 * 048 | |||||
3DP1 | A4F | Avanti | GTCCCCTGGTGA AATCAGA |
19 | 49 | 52,6 | 4 | 398-416 | 112 | Nessuno | ||
A5R | Invertire | GTGAGGCGCAAA GTGTCA |
18 | 52 | 55,6 | 492-509 | Nessuno | |||||
2DS2 | A2F | Avanti | GTCGCCTGGTGA AATCAGA |
19 | 49 | 52,6 | 4 | 398-416 | 111 | Nessuno | ||
A6R | Invertire | TGAGGTGCAAAG TGTCCTTAT |
21 | 51 | 42,9 | 488-508 | Nessuno | |||||
3DL 3 | A8Fa | Avanti | GTGAAATCGGGA GAGACG |
18 | 50 | 55,6 | 4 | 406-423 | 139 | Nessuno | ||
A8Fb | Avanti | GGTGAAATCAGG AGAGACG |
19 | 50 | 52,6 | 405-423 | 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905. | |||||
A8R | Invertire | AGTTGACCTGGG AACCCG |
18 | 51 | 61,1 | 526-543 | Nessuno | |||||
3DL1e4 | B1F | Avanti | CATCGGTCCCAT GATGCT |
18 | 51 | 55,6 | 4 | 549-566 | 85 | 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089 | ||
B1R | Invertire | GGGAGCTGACAA CTGATAGG |
20 | 52 | 55 | 614-633 | 3DL 1 * 00502 | |||||
3DS1 | B2F | Avanti | CATCGGTTCCAT GATGCG |
18 | 51 | 55,6 | 4 | 549-566 | 85 | 3DS1 * 047; può prendere 3DL 1 * 054. | ||
B1R | Invertire | GGGAGCTGACAA CTGATAGG |
20 | 52 | 55 | 614-633 | Nessuno | |||||
2DL 1 | B3F | Avanti | TTCTCCATCAGT CGCATGAC |
20 | 52 | 50 | 4 | 544-563 | 96 | 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028 | ||
B3R | Invertire | GTCACTGGGAGC TGACAC |
18 | 50 | 61,1 | 622-639 | 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030 | |||||
2DS1 | B4F | Avanti | TCTCCATCAGTC GCATGAA |
19 | 51 | 47,4 | 4 | 545-563 | 96 | 2DS1 * 001 | ||
B4R | Invertire | GGTCACTGGGAG CTGAC |
17 | 49 | 64,7 | 624-640 | Nessuno | |||||
2DS3 | B5F | Avanti | CTCCATCGGTCG CATGAG |
18 | 53 | 61,1 | 4 | 546-563 | 96 | Nessuno | ||
B5R | Invertire | GGGTCACTGGGA GCTGAA |
18 | 51 | 61,1 | 624-641 | Nessuno | |||||
2DS5 | B6F2 | Avanti | AGAGAGGGGACG TTTAACC |
19 | 50 | 52,6 | 4 | 475-493 | 173 | Nessuno | ||
B6R3 | Invertire | TCCAGAGGGTCA CTGGGC |
18 | 53 | 66,7 | 630-647 | 2DS5 * 003 | |||||
2DL 4 | C1F | Avanti | GCAGTGCCCAGC ATCAAT |
18 | 52 | 55,6 | 5 | 808-825 | 83 | Nessuno | ||
C1R | Invertire | CCGAAGCATCTG TAGGTCT |
19 | 52 | 52,6 | 872-890 | 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019 | |||||
2DL 2 | 2DL2F4 | Avanti | GAGGTGGAGGCC CATGAAT |
19 | 52 | 57,9 | 5 | 778-796 | 151 | 2DL 2 * 009; 782G cambiato A. | ||
C3R2 | Invertire | TCGAGTTTGACC ACTCGTAT |
20 | 51 | 45 | 909-928 | Nessuno | |||||
2DS4 | C5F | Avanti | TCCCTGCAGTGC GCAGC |
17 | 57 | 70,6 | 5 | 803-819 | 120 | Nessuno | ||
C5R | Invertire | TTGACCACTCGT AGGGAGC |
19 | 52 | 57,9 | 904-922 | 2DS4 * 013 | |||||
2DS4Del | 2DS4Del | Avanti | CCTTGTCCTGCA GCTCCAT |
19 | 54 | 57,9 | 5 | 750-768 | 203 | Nessuno | ||
2DS4R2 | Invertire | TGACGGAAACAA GCAGTGGA |
20 | 53 | 50 | 933-952 | Nessuno | |||||
2DS4FL | 2DS4FL | Avanti | CCGGAGCTCCTA TGACATG |
19 | 53 | 57,9 | 5 | 744-762 | 209 | Nessuno | ||
2DS4R2 | Invertire | TGACGGAAACAA GCAGTGGA |
20 | 53 | 50 | 933-952 | Nessuno | |||||
2DL 3 | D1F | Avanti | AGACCCTCAGGA GGTGA |
17 | 48 | 58,8 | 9 | 1180-1196 | 156 | Nessuno | ||
D1R | Invertire | CAGGAGACAACT TTGGATCA |
20 | 50 | 45 | 1316-1335 | 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 e 2DL 3 * 01802 | |||||
2DL 5 | D2F | Avanti | CACTGCGTTTTC ACACAGAC |
20 | 52 | 50 | 9 | 1214-1233 | 120 | 2DL5B * 011 e 2DL5B * 020 | ||
D2R | Invertire | GGCAGGAGACAA TGATCTT |
19 | 49 | 47,4 | 1315-1333 | Nessuno | |||||
2DP1 | D3F | Avanti | CCTCAGGAGGTG ACATACGT |
20 | 53 | 55 | 9 | 1184-1203 | 121 | Nessuno | ||
D3R | Invertire | TTGGAAGTTCCG TGTACACT |
20 | 50 | 45 | 1285-1304 | Nessuno | |||||
3DL1e9 | D4F | Avanti | CACAGTTGGATC ACTGCGT |
19 | 52 | 52,6 | 9 | 1203-1221 | 93 | 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068 | ||
D4R2 | Invertire | CCGTGTACAAGA TGGTATCTGTA |
23 | 53 | 43,5 | 1273-1295 | 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098 | |||||
3DL2e9 | D4F | Avanti | CACAGTTGGATC ACTGCGT |
19 | 52 | 52,6 | 9 | 1203-1221 | 156 | Nessuno | ||
D5R | Invertire | GACCTGACTGTG GTGCTCG |
19 | 54 | 63,2 | 1340-1358 | Nessuno | |||||
STAT6 | STAT6F | Avanti | CCAGATGCCTAC CATGGTGC |
20 | 54 | 60 | 129 | |||||
STAT6R | Invertire | CCATCTGCACAG ACCACTCC |
20 | 54 | 60 |
Tabella 4: sequenze dei primer utilizzati in qKAT 1, 27.
KIR gene | 3DL 3 | 2DS2 | 2DL 2 | 2DL 3 | 2DP1 | 2DL 1 | 3DP1 | 2DL 4 | 3DL 1 EX9 |
3DL 1 EX9 |
3DS1 | 2DL 5 | 2DS3 | 2DS5 | 2DS1 | 2DS4 Totale |
2DS4 FL |
2DS4 DEL |
3DL 2 EX4 |
3DL 2 EX9 |
|
Più frequente numero di copia | 2 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 2 | 2 |
Tabella 5: Più frequente numero di copie per KIR geni comunemente osservati in campioni di origine europea.
Linkage disequilibrium regole per qKAT basato su popolazioni europee | Controllo del numero di copia | |||||||
1 | KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 sono quadro geni presenti su entrambi gli aplotipi. | KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 = 2 | ||||||
2 | KIR2DS2 e KIR2DL2 sono in LD con a vicenda | 2DS2=2 DL 2 | ||||||
3 | KIR2DL2 e KIR2DL3 sono alleli dello stesso gene | 2 DL 2+2 DL 3= 2 | ||||||
4 | KIR2DP1 e KIR2DL1 sono in LD con a vicenda | 2DP1=2 DL 1 | ||||||
5 | Esone 4 di KIR3DL1 e KIR3DL2 è uguale a essone 9 di KIR3DL1 e KIR3DL2 rispettivamente. | 3DL1ex4=3DL1ex9 e 3DL2ex4=3DL2ex9 | ||||||
6 | KIR3DL1 e KIR3DS1 sono alleli | 3 DL 1+3DS1= 2 | ||||||
7 | KIR2DS3 e KIR2DS5 sono in LD con KIR2DL5 | 2DS3+2DS5=2 DL 5 | ||||||
8 | KIR3DS1 e KIR2DS1 sono in LD | 3DS1=2DS1 | ||||||
9 | Presenza di KIR2DS1 e KIR2DS4Total è mutualmente esclusivo su un aplotipo | 2DS1+2DS4TOTAL= 2 | ||||||
10 | KIR2DS4FL e KIR2DS4del sono varianti del KIR2DS4TOTAL | 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL |
Tabella 6: Linkage disequilibrium tra KIR geni comunemente osservati nelle popolazioni di origine europea possono essere utilizzati per controllare i dati di numero di copia 1,27.
Discussion
Abbiamo descritto un nuovo metodo semi-automatico ad alta velocità, chiamato qKAT, che facilita la copia numero digitando dei geni KIR . Il metodo rappresenta un miglioramento rispetto ai metodi convenzionali come SSP-PCR, che sono basso-throughput e possono solo indicare la presenza o l'assenza di questi geni altamente polimorfici.
La precisione dei dati numeri copia ottenuti dipende da molteplici fattori, tra cui la qualità e la concentrazione-uniformità dei campioni gDNA e la qualità dei reagenti. La qualità e la precisione dei campioni gDNA attraverso un piatto sono estremamente importanti poiché variazioni nella concentrazione su tutta la piastra possono causare errori nel calcolo del numero della copia. Poiché i dosaggi sono stati convalidati utilizzando set di campioni di origine europea, dati dalle coorti da altre parti del mondo richiedono controlli più approfonditi. Questo è per garantire che le istanze di allele dropout o associazione non specifici primer/sonda non sono interpretati erroneamente come variazione numero di copia.
Mentre i dosaggi sono stati progettati e ottimizzati per l'esecuzione come ad alta velocità, possono essere modificati per eseguire meno campioni. La metrica di fiducia nel software di analisi numero di copia è interessata quando si analizzano campioni di meno, ma questo può essere migliorato se campioni di DNA genomici di controllo con un numero di copia del gene KIR noto sono inclusi sulla piastra e repliche di esempio aggiuntivi sono incluso.
Per i laboratori senza liquido/piastra-manipolazione robot, mix master può essere distribuito utilizzando pipette multicanale e piastre possono essere caricati manualmente nello strumento qPCR.
Lo scopo principale dietro lo sviluppo di qKAT era di creare un semplice, ad alta velocità, alta risoluzione e conveniente metodo per genotipo KIRs per malattia gli studi di associazione. Questo è stato raggiunto con successo poiché qKAT è stato impiegato nell'investigare il ruolo di KIR in parecchi studi di associazione di grande malattia, compreso una gamma di malattie infettive, malattie autoimmuni e gravidanza disturbi4, 24 , 25 , 26.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio di ricerca medica (MRC), del Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea (grant contratto n. 695551) e il Cambridge National Institute of Health (NIH) Biomedical Research Centre e NIH ricerca sangue e trapianto di unità di ricerca (NIHR BTRU) in donazione e trapianto presso l'Università di Cambridge e in collaborazione con NHS Blood and Transplant (NHSBT). Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non necessariamente quelle di NHS, la NIHR, il Ministero della sanità o il NHSBT.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |
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