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Genetics

qKAT: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58646
Automatic Translation
1,2,3,4, 1, 1,5, 1,6, 1,7, 1
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Summary

양적 살인자 세포 수용 체 면역 글로불린 같이 (키 르) 반자동 입력 (qKAT) 인구와 질병 협회 연구에 그들의 응용 프로그램에 대 한 숫자 형식 키 르 유전자를 복사 하는 간단한, 높은 처리량 및 비용 효율적인 방법입니다.

Abstract

킬러 세포 면역 글로불린 같이 수용 체 (KIRs) 금지 및 활성화 면역 수용 체의, 자연적인 살인자 (NK) 및 T 세포, 유전자의 다형성 클러스터 염색체 19에 의해 설정 됩니다. 그들의 가장 특징이 ligands는 염색체 6에 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 로커 스 이내 인코딩됩니다 인간 백혈구 항 원 (HLA) 분자. 그들은 면역, 재생산, 및 이식, 유전자 형을 정확 하 게 할 수 있는 기술을가지고 중요 한 만드는 중요 한 역할을 재생 하는 실질적 증거는 그들. 그러나, 높은 순서 상 동, 뿐만 아니라 유전자 및 복사 번호 유사, 어렵게 정확 하 게 할 수 있는 디자인 방법 및 효율적으로 유전자 형을 모든 키 르 유전자. 전통적인 방법 일반적으로 가져온 데이터의 해상도, 처리량, 비용 효과성, 및 시간 설정 및 실험을 실행에 제한 됩니다. 우리 설명 양적 키 르 반 자동 입력 (qKAT) 라는 메서드는 키 르 로커 스에 있는 모든 유전자의 유전자 복사 번호를 확인할 수 있는 높은 처리량 다중 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 방법입니다. qKAT은 고해상도 키 르 숫자 데이터 복사, 그들을 포함 하는 구조적 다형성 haplotypes의 변화를 추정 하는 것 더 사용 될 수 있는 제공할 수 있는 간단한 높은 처리량 방법. 이 복사 번호와 haplotype 데이터에 대규모 질병 협회, 집단 유전학, 표현과 키 르 와 HLA간의 기능 상호 작용에 대 한 조사 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.

Introduction

인간에서는, 살인자 같은 면역 글로불린 수용 체(키 르) 로커 스는 백혈구 수용 체 복합물 (LRC) 내의 염색체 19의 긴 팔에 매핑됩니다. 이 로커 스 길이 약 150 kb 고 15 키 르 유전자 배열 머리-투-꼬리를 포함 한다. 현재 알려진 키 르 loci는 KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR2DL4 KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3 그리고 두 pseudogenes, KIR2DP1 및 KIR3DP1. 키 르 유전자 2 차원 (2D)에 대 한 인코딩 및 짧은 (S; 활성화) 3 차원 (3D) 면역 글로불린과 같은 도메인 수용 체 또는 긴 (L; 억제) 세포질 꼬리, 자연 킬러 (NK) 세포와 T의 하위 집합으로 표현 되는 셀입니다. 복사 번호 유사 키 르 로커 스 양식 내의 변수 진 콘텐츠1다양 한 haplotypes 전시. 비-유전자 동종 재결합 (NAHR), 가까운 머리-투-꼬리 유전자 배열 및 높은 순서 상 동에 의해 촉진 된 haplotypic 변화에 대 한 책임을 질 것을 제안 하는 메커니즘입니다. 100 개 이상의 다른 haplotypes 인구 전세계1,2,,34에 보고 되었습니다. 이러한 모든 haplotypes 두 가지 주요 그룹으로 분할 될 수 있습니다: A와 B haplotypes. A haplotype 포함 7 키 르 유전자: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1및 KIR3DL2, 억제 키 르 유전자, 그리고 활성화 키 르 유전자 KIR2DS4. 그러나, 최대 70% 유럽 근원 개인의 키 르 haplotype를 위해 homozygous 독점적으로 수행 KIR2DS45,6의 비 기능 "삭제" 형태. 다른 모든 키 르 유전자 조합을 형성 그룹 B haplotypes, 특정 키 르 유전자 KIR2DS1, 중 적어도 하나를 포함 하 여 KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, 그리고 KIR2DL5, 일반적으로 두 개 이상의 활성화 키 르 유전자를 포함 하 고.

HLA 종류 I 분자 특정 금지 수용 체 (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3및 KIR3DL1) 활성화 수용 체 (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, 에 대 한 ligands로 확인 되었습니다 KIR2DS5, 및 KIR3DS1), 그리고 KIR2DL4에 대 한 고유 키 르 다른 억제 키 르 수용 체 처럼 긴 세포질 꼬리를 포함 하지만 또한 긍정적으로 위탁된 한 잔류물은 일반적인 세포 외 도메인 근처에 있다 다른 활성화 키 르 수용 체의 기능입니다. 키 르 유전자와 HLA 유전자 이체의 조합 그 모양 잠재적인 NK 세포 응답 개별 레벨7,8수용 체 ligand 상호 작용을 좌우 한다. 유전 협회 학문에서 증거는 키 르 에 역할 (예:., 인간 면역 결핍 바이러스 [HIV]9 , C 형 간염 바이러스 [HCV]10), 바이러스 성 저항 표시는 이식 의 성공 11, 임신 장애, 생식 성공12,13, 수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (HSCT)14,15, 후 재발에 대 한 보호의 위험 16, 그리고 암17의 위험.

높은 순서 상 동의 조합 유전자 그리고 정확 하 게 유전형 키 르 유전자의 작업에서 haplotypic 다양성 선물 도전. 키 르 유전자 입력을 기존의 방법 순서 특정 뇌관 (SSP) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)18,,1920, 시퀀스 특정 oligonucleotide 조사 (SSOP) PCR21, 그리고 매트릭스 보조 레이저 이온화 시간의 비행 질량 분석 (MS MALDI TOF)22desorption. 이러한 기술의 단점은 그들은 단지 부분에 통찰력을 제공 개인의 유전자 형 또한 수행 하는 힘이 드는 되 고 하는 동안 있습니다. 최근 차세대 시퀀싱 (NGS) 키 르 로커 스를 구체적으로 입력에 적용 되었습니다. 이 메서드는 매우 강력 하 고, 하는 동안 실행, 비쌀 수 있다 그리고 그것은 심층 분석 및 데이터 검사를 수행 하면 시간이 많이 소요.

qKAT는 높은 처리량 정량 PCR 방법입니다. 기존의 방법 힘들고 시간이 걸리는 반면, 두 일에 거의 1000 게놈 DNA (gDNA) 샘플을 실행할 수 있게 메서드와 키 르 유전자 유전자 복사 번호 제공. 10 다중 반응, 두 키 르 loci를 대상으로 각각의 이루어져 있다 qKAT 그리고 고정된 복사본 번호 게놈 (STAT6) 키 르 유전자의 상대적 정량화에 대 한 사용에 한 참조 유전자 복사 번호23. 이 분석 결과 유전자 제공 뿐만 아니라 큰 인구 패널 및 HCV, 타입-1 당뇨병 같은 면역 조건 등 전염 성 질환 및 자간 전 증, 같은 임신 장애 질병 동료 연구 성공적으로 사용 되었습니다. NK 세포 기능1,4,,2425,26를 이해 하기 위한 연구에 underpinning.

Protocol

1. 준비 및 DNA 중 도금

  1. 정확 하 게 계량 gDNA 농도 spectrophotometric 또는 fluorometric 악기를 사용 하 여.
  2. 96-잘 깊은 잘 격판덮개에 4 ng / µ L에 DNA를 희석. 알려진된 복사 번호와 하나 이상의 컨트롤 gDNA 샘플 및 비-템플릿 컨트롤을 포함 합니다.
  3. 2 분 동안 g 450 x 96 잘 접시 원심
  4. 모든 음에 10 384-잘 정량 접시에 quadruplicate에서 각 샘플을 분배 액체 처리 장비를 사용 하 여 DNA의 ng (2.5 µ L/잘). 각 qKAT 반응 한 적어도 10 384-잘 접시를 준비 합니다.
  5. GDNA 이상의 96 잘 접시에서 적절 하 게 되는, 전체 볼륨 세척 표 백제 2%와 초순 수 처리 시스템 gDNA 샘플의 96 잘 접시 각 사이 액체의 바늘을 청소를 수행 합니다.
  6. 24 시간 이상 실 온에서 깨끗 한 지역에서 384-잘 접시를 배양 하 여 DNA를 건조.

2입니다. 프라이 머 및 프로브의 준비

참고: qKAT 10 다중 반응 이루어져 있다. 각 반응에는 3 개의 뇌관 쌍 구체적으로 두 가지 키 르 유전자와 하나의 참조 유전자 증폭 3 형광 표시 된 프로브 포함 되어 있습니다. 장 외.27 에 프로브는 oligonucleotides 이제 표시 됩니다 거 염료 때문에 그들이 제공 하는 향상 된 photostability 및 긴 신호 수명을 수정 했다. 전 aliquoted 뇌관 조합은 상용 ( 재료의 표참조).

  1. 표 1에 주어진 희석에 의하여 각 반응 위한 뇌관 조합 준비.
  2. 표 1에 의하여 각 반응에 대 한 프로브 조합을 준비 합니다. 결합 하기 전에 각 개별 프로브를 테스트 합니다.

3입니다. 마스터 믹스의 준비

참고 아래에 언급 된 볼륨 10 x 384-잘 접시 세트에서 1 개 qKAT 반응 수행입니다.

  1. 384-잘 접시에 도금 gDNA 샘플 완전히 건조 있는지 확인 하십시오. 얼음에 모든 단계를 수행 하 고 시 약 때문에 형광 표시 된 프로브는 사진 및 온도 구분 가능한 빛에 노출에서 덮여 유지.
  2. 서 리 없애다 정량 버퍼, 뇌관, 및 4 ° c.에 프로브 aliquots
  3. 얼음, 초순, 정량 버퍼, preprepared 뇌관 조합, 1000 µ L 및 preprepared 프로브 조합 (표 2)의 180 µ L의 20 mL의 18.86 mL을 추가 하 여 마스터 믹스 10 x 384-잘 접시에 대 한 준비.
  4. 분산 마스터 믹스 균등 하 게 각 우물에 415 µ L를 pipetting 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 96-깊은 잘 격판덮개. 빛에서 덮은 얼음 상자에이 접시를 유지.
  5. 액체 취급 악기를 사용 하 여, 말린된 gDNA 384-잘 접시의 각 음에 마스터 믹스의 9.5 µ L 분배. 호 일 접시를 봉인 하 고 즉시 4 ° c.에 그것을 배치합니다 나머지 접시, 바늘 액체 처리 시스템의 각 판 사이 물으로 세척은 보장에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.
  6. 384-잘 접시 3 분 450 x g에서 원심 고 하룻밤에 4 ° C에서 또는 사이 6-12 h DNA를 resuspend 하 고 있는 어떤 공기 거품을 없앨 수 있습니다 그들을 품 어.

4입니다. 정량 분석 결과

  1. 야간 보육에 따라 어떤 나머지 공기 거품이 사라지고 3 분 450 x g 에서 원심.
  2. 정량 Pcr 기계 (예: LightCycler 480) microplate 처리기 연결 자동화의 목적 ( 재료의 표참조). 빛에서 보호 되는 냉각된 저장 독에서 정량 Pcr 기계에 접시를 microplate 처리기 프로그램.
    참고 는 분석 실험, 이론, 컴퓨터에서 작동 다른 정량 호환 광섬유 설정.
  3. 다음 자전거 조건을 사용 하 여: 95 ° C의 40 주기 뒤에 5 분 동안 95 ° C 15 s와 66 ° C 50에 대 한 s, 66 ° c.에 데이터 수집
  4. 실행 완료 되 면, 로봇 정량 Pcr 기계에서 접시를 수집 하 고 폐기 독에 있다.

5. 실행된 후 분석

  1. 증폭 후 정량 컴퓨터의 소프트웨어와 함께 두 번째 파생 최대 메서드 또는 맞는 포인트 메서드를 사용 하 여 정량화 주기 (Cq) 값을 계산 ( 재료의 표참조), 다음 단계.
  2. 정량 소프트웨어를 열고 탐색기 탭에서 한 접시에 대 한 저장 된 반응 실험 파일 엽니다.
  3. 두 번째 파생 최대 메서드를 사용 하 여 분석을 위해 분석 탭을 선택 하 고 Abs Quant/Second 파생 Max 메서드를 사용 하 여 새 분석을 만들.
    1. 만들기 새로운 분석 창에서 선택 분석 종류: Abs Quant/Second 파생 Max 메서드, 하위 집합: 모든 샘플, 프로그램: 증폭, 이름: Rx-돌연 사 했을까 (여기서 x 는 반응 수).
    2. 필터 빗 고 빅/16 진수/Yellow555 (533-580)를선택 하십시오. 그러면 STAT6 수집 데이터 선택.
    3. VIC/HEX/Yellow555(533-580)에 대 한 컬러 보정 을 선택 합니다. 계산을 클릭 합니다. 팸 (465-510) 및 Cy5/Cy5.5(618-660)에 대 한 반복이. 파일 저장을 클릭 합니다.
  4. 맞는 포인트 메서드를 사용 하 여 분석을 위해 분석 탭에서 Abs 양의/맞는 포인트를 선택 합니다.
    1. 만들기 새로운 분석 창에서 선택 분석 종류: Abs 양의/맞춤 포인트 방법, 하위 집합: 모든 샘플, 프로그램: 증폭, 이름: RxF-돌연 사 했을까 (여기서 x 는 반응 수).
    2. 올바른 필터 및 STAT6 및 키 르 유전자 (팸/Cy5) 각각의 색상 보정을 선택 합니다. Noiseband 탭에서 배경 잡음을 제외 하려면 소음 밴드를 설정 합니다.
    3. 분석 탭에서 3 에 맞는 포인트를 설정 하 고 쇼 포인트에 맞게선택 합니다. 계산을 클릭 합니다. 파일 저장을 클릭 합니다.

6입니다. 결과의 수출

  1. 정량 소프트웨어에서 탐색기 를 열고 탭 선택 결과 일괄 내보내기.
  2. 실험 파일 저장 되 고 윈도우의 오른쪽 부분에는 파일을 전송할 폴더를 엽니다. 다음을 클릭 합니다. 이름 및 내보내기 파일의 위치를 선택 합니다.
  3. Abs Quant/Second 파생 Max 메서드 또는 Abs 양의/맞춤 포인트분석 유형을 선택 합니다. 다음을 클릭 합니다. 내보내기 폴더 파일과 분석 종류의 이름이 올바른지 확인 하 다음 내보내기 프로세스를 시작 하려면 클릭 합니다.
  4. 내보내기 상태 확인될 때까지 기다립니다. 화면 자동으로 다음 단계로 이동 합니다. 선택한 모든 파일 성공적으로 내보낸 확인을 실패 한 파일 수 = 0. 완료를 클릭 합니다.
  5. 각 접시에 대 한 개인적인 반응이 내보낸된 접시를 분할할 스크립트 split_file.pl 및 roche2sds.pl를 사용 합니다.
    참고 스크립트 요청/GitHub에 제공 됩니다.

7. 숫자 계산

  1. 복사 번호 분석 소프트웨어 (예: CopyCaller)를 엽니다. 실시간 PCR 결과 파일 가져오기를 선택 하 고 roche2sds.pl에서 만든 텍스트 파일을 로드.
  2. 분석 을 선택 하 고 어느 선택 알려진된 복사 번호 보정 샘플 또는 가장 빈번한 복사본 수를 선택 하 여 분석을 실시. 일반적으로 유럽 근원 인구에서 관찰 하는 키 르 유전자의 가장 빈번한 복사 번호 표 5 를 참조 하십시오.

8. 데이터 품질 검사

  1. KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 R 스크립트를 사용 합니다. R 스프레드시트에 모든 접시에서 숫자 데이터를 복사를 결합 하 여.
    참고 스크립트 요청/GitHub에 제공 됩니다.
  2. 키 르 유전자 (표 6)에 대 한 알려진된 결합 불균형 (LD)을 따르지 않는 샘플에 대 한 복사 번호 분석 소프트웨어에 원시 데이터 확인

Representative Results

복사 번호 분석 복사 번호 분석 소프트웨어, ΔΔCq 방법에 따라 예측 하 고 예상 복사본 수를 제공 하는 파일을 내보내기 하 여 수행할 수 있습니다.

복사본 수 중 제어 DNA 샘플 접시에 또는 가장 빈번한 유전자 복사 번호 (표 5)를 입력 하 여 알려진된 복사본 수에 따라 예언 될 수 있다. 그림 1 보여줍니다 KIR2DL4 KIR3DS1, 뿐만 아니라 참조 유전자를 대상으로 하는 반응에 대 한 판의 결과 STAT6. KIR2DL4, 키 르 로커 스에서 프레임 워크 유전자에 대 한 가장 빈번한 복사 번호 KIR3DS1, 활성화 유전자에 대 한 가장 빈번한 복사 번호는 하나의 복사본 2 부, 이다. 그림에서 결과 정량 소프트웨어 및 정량 데이터에서 생성 된 숫자 데이터 복사에 관찰 하는 PCR 증폭 플롯을 보여준다. 같이, 분석 결과 0, 1, 2, 3, 및 4 키 르 유전자 복사 번호를 구분할 수 있다. 복사 번호 분석 소프트웨어는 원형 차트 또는 막대 그래프 접시에 걸쳐 복사 번호의 배급의 보기를 해줍니다. 복사 번호 예측의 효능은 복사 번호가 높은 샘플에 대 한 낮은.

반응, gDNA, 버퍼, 뇌관, 및 프로브에 사용 된 모든 재료의 품질 얻은 결과의 정확도 영향을 수 있습니다. 그러나, 결과에서 부조화 접시에 걸쳐 DNA의 농도 있는 변화 때문에 발생할 수 가능성이 가장 높습니다. 260/280 260을 사용 하 여 측정 될 수 있는 추출된 gDNA의 순도/230 비율, 또한 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 260/280 비율이 1.8-2와 260/230 비율 2-2.2의 바람직한 있습니다. 접시에 걸쳐 고르지 DNA 농도 높은 가변성 임계값 주기 (Ct)에서 샘플 사이의 부조화 예상된 복사본 수의 범위에서 발생할 수 있습니다. 그림 2 에 결과 접시 값은 Ct 사이의 격차 복사 번호의 예측의 정확도에 미칠 수 있는 효과 보여 줍니다. 레드 라인 샘플에 대 한 예상된 복사 숫자의 범위를 나타냅니다 하 고, 이상적으로, 가능한 정수에 가까운 이어야 한다.

한번 분석, 복사 숫자 데이터를 스프레드시트 파일에 96-잘 형식으로 내보낼 수 있습니다. 우리는 결합 한 스프레드시트에 집합으로 실행 되는 모든 10 접시의 숫자 데이터를 복사 하는 R 스크립트 (요청에 사용 가능)을 사용. 주로 유럽 근원 인구에서 KIRs 에 대 한 게시 된 데이터에는 키 르 복잡 한1에 다양 한 유전자 사이 존재 하는 LD 규칙의 예측 수 있습니다. 이러한 예측은 (표 6) 복사 번호 결과 대 한 다운스트림 검사를 실시 하는 데 사용 됩니다. 비정상적인 다형성 또는 haplotypic 구조 변이 유전자 사이 예측된 LD에 따르지 않는 샘플 포함할 수 있습니다. 프로토콜을 설명 하는 순서도 그림 3에 표시 됩니다.

키 르 Haplotype 식별자 (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) 라는 도구는 데이터 집합에서 haplotypes의 돌리기를 촉진 하기 위하여 개발 되었다. 돌리기 유럽 근원 인구1관찰 참조 haplotypes의 목록에 근거 하 여 작동 합니다. 그러나, 도구 수도 있습니다 참조 haplotypes의 사용자 지정 설정 대신 사용할 수 있습니다. 3 별도 파일이 생성 됩니다. 첫 번째 파일 샘플에 대 한 모든 haplotype 조합을 나열, 두 번째 파일 높은 결합 된 주파수가 haplotypes 조합의 트림된 목록 하며 세 번째 파일 목록 샘플 haplotypes를 할당할 수 없습니다. 비-할당 haplotypes의 소설 haplotypes의 지시자로 사용 될 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 반응에 대 한 접시의 대표적인 결과 번호 5. (A)이 패널 쇼 증폭 구획. (B)이이 패널 쇼 번호 플롯을 복사합니다. (C)이이 패널 복사 번호 배포를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 반응 변수 DNA 농도와 접시의 대표적인 결과 번호 5. (A)이 패널 쇼 증폭 구획. (B)이이 패널 쇼 번호 플롯을 복사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: qKAT 프로토콜의 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

분석 결과 유전자 앞으로 뇌관 농도 (nM) 반전 뇌관 농도 (nM) 프로브 농도 (nM)
아니 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150
2 DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
아니오 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200
2 DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
아니 3 3 DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150
2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
아니 4 3DL1e4 지 하 1 층 250 B1R 125 P4b 150
3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 5 3DS1 지 하 2 층 250 B1R 250 P4b 150
2 DL 4 C1F 200 C1R 200 P5b-2 DL 4 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 6 2 DL 1 B3F 500 B3R 125 P4b 150
2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
아니 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4b 150
2 DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 P4b 150
3DL2e9 D4F 250 D5R 125 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150
2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4b 150
2DS4 C5F 250 C5R 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150

표 1: 조합과 뇌관과 각 qKAT 반응에 사용 되는 프로브 27 .

반응 뇌관 Aliquots (µ L) 프로브 Aliquots (µ L)
R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 물 STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2 DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60
R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R 물 STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6
2 DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60
참고: 필요 더 적은 물에는 MasterMix 20 µ L
R3 3 DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 물 STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60
R4 3DL1E4 지 하 1 층 B1R D4F D4R2 물 STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60
R5 3DS1 지 하 2 층 B1R C1F C1R 물 STAT6F STAT6R P4B P5B-2 L 4 PSTAT6
2 DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60
R6 2 DL 1 B3F B3R D3F D3R 물 STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60
R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R 물 STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2 DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60
R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R 물 STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60
R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 물 STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60
R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R 물 STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6
2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60

표 2: 볼륨 (µ L) 100 µ M 뇌관/프로브의 주식 뇌관 및 조합은 aliquots 프로브 솔루션.

이름 방향 5´ 수정 3´ 수정 시퀀스 (5' →3') 길이 Tm GC % Exon 위치
P4a 감각 식구 들 BHQ-1 TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		 27 60 44.4 4 425-451
P4b Antisense 식구 들 BHQ-1 AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		 28 62 50 4 576-603
P5b 감각 ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		 25 60 52 5 828-852
P5b-2 DL 4 감각 ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		 25 61 56 5 828-852
P9 감각 ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		 24 60 62.5 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		 26 62 50

표 3: qKAT에서 사용 하는 프로브 목록 1, 27. 올리고 프로브 P5b, P5b-2 DL 4, P9, 및 PSTAT6의 5' 끝에 사용 하는 형광 염료 ATTO 염료를 수정 했다.

유전자 뇌관 방향 시퀀스 (5´-3´) 길이 Tm GC % Exon 위치 Amplicon (bp) 대립 유전자를 놓칠 수 있습니다.
3DL2e4 A1F 앞으로 GCCCCTGCTGAA
ATCAGG		 18 52 61.1 4 399-416 179 3 DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
A1R 역 CTGCAAGGACAG
GCATCAA		 19 53 52.6 559-577 3 DL 2 * 048
3DP1 A4F 앞으로 GTCCCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52.6 4 398-416 112 없음
A5R 역 GTGAGGCGCAAA
GTGTCA		 18 52 55.6 492-509 없음
2DS2 A2F 앞으로 GTCGCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52.6 4 398-416 111 없음
A6R 역 TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		 21 51 42.9 488-508 없음
3 DL 3 A8Fa 앞으로 GTGAAATCGGGA
GAGACG		 18 50 55.6 4 406-423 139 없음
A8Fb 앞으로 GGTGAAATCAGG
AGAGACG		 19 50 52.6 405-423 3 듀얼 레이어 3 * 054, 3 DL 3 * 00905
A8R 역 AGTTGACCTGGG
AACCCG		 18 51 61.1 526-543 없음
3DL1e4 지 하 1 층 앞으로 CATCGGTCCCAT
GATGCT		 18 51 55.6 4 549-566 85 3 DL 1 * 00505, 3 DL 1 * 006, 3 DL 1 * 054 3 DL 1 * 086, 3 DL 1 * 089
B1R 역 GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 3 DL 1 * 00502
3DS1 지 하 2 층 앞으로 CATCGGTTCCAT
GATGCG		 18 51 55.6 4 549-566 85 3DS1 * 047; 3 DL 1 * 054를 선택할 수 있습니다.
B1R 역 GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 없음
2 DL 1 B3F 앞으로 TTCTCCATCAGT
CGCATGAC		 20 52 50 4 544-563 96 2 DL 1 * 020, 2 DL 1 * 028
B3R 역 GTCACTGGGAGC
TGACAC		 18 50 61.1 622-639 2 DL 1 * 023, 2 DL 1 * 029, 2 DL 1 * 030
2DS1 B4F 앞으로 TCTCCATCAGTC
GCATGAA		 19 51 47.4 4 545-563 96 2DS1 * 001
B4R 역 GGTCACTGGGAG
CTGAC		 17 49 64.7 624-640 없음
2DS3 B5F 앞으로 CTCCATCGGTCG
CATGAG		 18 53 61.1 4 546-563 96 없음
B5R 역 GGGTCACTGGGA
GCTGAA		 18 51 61.1 624-641 없음
2DS5 B6F2 앞으로 AGAGAGGGGACG
TTTAACC		 19 50 52.6 4 475-493 173 없음
B6R3 역 TCCAGAGGGTCA
CTGGGC		 18 53 66.7 630-647 2DS5 * 003
2 DL 4 C1F 앞으로 GCAGTGCCCAGC
ATCAAT		 18 52 55.6 5 808-825 83 없음
C1R 역 CCGAAGCATCTG
TAGGTCT		 19 52 52.6 872-890 2 DL 4 * 018, 2 DL 4 * 019
2 DL 2 2DL2F4 앞으로 GAGGTGGAGGCC
CATGAAT		 19 52 57.9 5 778-796 151 2 DL 2 * 009; 782 G a 변경
C3R2 역 TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		 20 51 45 909-928 없음
2DS4 C5F 앞으로 TCCCTGCAGTGC
GCAGC		 17 57 70.6 5 803-819 120 없음
C5R 역 TTGACCACTCGT
AGGGAGC		 19 52 57.9 904-922 2DS4 * 013
2DS4Del 2DS4Del 앞으로 CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		 19 54 57.9 5 750-768 203 없음
2DS4R2 역 TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 없음
2DS4FL 2DS4FL 앞으로 CCGGAGCTCCTA
TGACATG		 19 53 57.9 5 744-762 209 없음
2DS4R2 역 TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 없음
2 DL 3 D1F 앞으로 AGACCCTCAGGA
GGTGA		 17 48 58.8 9 1180-1196 156 없음
D1R 역 CAGGAGACAACT
TTGGATCA		 20 50 45 1316-1335 2 DL 3 * 010, 2 DL 3 * 017, 2 DL 3 * 01801 및 2 DL 3 * 01802
2 DL 5 D2F 앞으로 CACTGCGTTTTC
ACACAGAC		 20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 및 2DL5B * 020
D2R 역 GGCAGGAGACAA
TGATCTT		 19 49 47.4 1315-1333 없음
2DP1 D3F 앞으로 CCTCAGGAGGTG
ACATACGT		 20 53 55 9 1184-1203 121 없음
D3R 역 TTGGAAGTTCCG
TGTACACT		 20 50 45 1285-1304 없음
3DL1e9 D4F 앞으로 CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52.6 9 1203-1221 93 3 DL 1 * 061, 3 DL 1 * 068
D4R2 역 CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		 23 53 43.5 1273-1295 3 DL 1 * 05901, 3 DL 1 * 05902, 3 DL 1 * 060, 3 DL 1 * 061, 3 DL 1 * 064, 3 DL 1 * 065, 3 DL 1 * 094N, 3 DL 1 * 098
3DL2e9 D4F 앞으로 CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52.6 9 1203-1221 156 없음
D5R 역 GACCTGACTGTG
GTGCTCG		 19 54 63.2 1340-1358 없음
STAT6 STAT6F 앞으로 CCAGATGCCTAC
CATGGTGC		 20 54 60 129
STAT6R 역 CCATCTGCACAG
ACCACTCC		 20 54 60

표 4: qKAT에서 사용 된 뇌관의 시퀀스 1, 27.

키 르 유전자 3 DL 3 2DS2 2 DL 2 2 DL 3 2DP1 2 DL 1 3DP1 2 DL 4 3 DL 1
EX9		 3 DL 1
EX9		 3DS1 2 DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4
총		 2DS4
플로리다		 2DS4
델		 3 DL 2
ex4		 3 DL 2
EX9
가장 빈번한 복사 수 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

표 5: 가장 빈번한 복사 번호 키 르 유전자 일반적으로 유럽 원본 샘플에서 관찰.

QKAT 유럽 인구에 기반에 대 한 결합 불균형 규칙 복사 번호 확인
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 및 KIR3DL2 framework 유전자 두 haplotypes에 있습니다. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 , KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 와 KIR2DL2 는 LD에 서로 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 와 KIR2DL3 는 동일한 유전자의 대립 유전자 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 와 KIR2DL1 는 LD에 서로 2DP1=2 DL 1
5 Exon KIR3DL1 및 KIR3DL2 의 4 엑손 9 KIR3DL1 및 KIR3DL2 의 각각은. 3DL1ex4=3DL1ex9 및 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 와 KIR3DS1 는 대립 유전자 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 및 KIR2DS5 KIR2DL5 와 LD 있는 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 와 KIR2DS1 는 LD에 3DS1=2DS1
9 KIR2DS1 및 KIR2DS4Total의 존재는 haplotype에 상호 배타적 이다 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL 와 KIR2DS4del 는 KIR2DS4TOTAL 의 변종 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

표 6: 결합 불균형 사이 키 르 일반적으로 유럽 근원 인구에서 관찰 하는 유전자 숫자 데이터 복사 확인을 사용할 수 있습니다 1,27.

Discussion

우리는 소설 반자동된 높은 처리량 메서드를 복사 키 르 유전자. 의 숫자 입력을 용이 하 게 qKAT 설명 방법은 낮은 처리량이 높은 다형성 유전자의 유무만 나타낼 수는 SSP-PCR, 같은 기존의 방법에 비해 개선 이다.

가져온 숫자 데이터 복사의 정확도 품질 및 농도-gDNA 샘플 및는 시 약의 품질의 균일성을 포함 한 여러 요인에 따라 달라 집니다. 이후 유사 농도 격판덮개의 맞은편에 복사 숫자의 계산에서 오류가 발생할 수 있습니다 품질 및 접시에 걸쳐 gDNA 샘플의 정확도 매우 중요 하다. 분석 실험 유럽 원본 샘플 세트를 사용 하 여 확인 했다, 이후 동료는 세계의 다른 부분에서에서 데이터 보다 철저 한 검사를 필요로 합니다. 이것은 대립 유전자 강하 또는 일반적인 뇌관/프로브 바인딩 인스턴스 복사 번호 유사로 오해 하지는 보장 하기 위해.

분석 실험 설계 하 고 높은 처리량으로 실행 하도록 최적화, 하는 동안 그들은 적은 샘플을 실행 하려면 수정할 수 있습니다. 적은 샘플을 분석할 때 자신감 통계 복사 번호 분석 소프트웨어에 영향을 하지만이 알려진된 키 르 유전자 복사 번호와 제어 genomic DNA 샘플에 포함 되어 있고 추가 샘플 복제는 향상 시킬 수 있습니다. 포함 되어 있습니다.

액체/플레이트-처리 로봇 없이 실험실, 멀티 채널 펫을 사용 하 여 마스터 믹스를 적절 수 있습니다 및 판 정량에 수동으로 로드할 수 있습니다.

QKAT의 발달의 뒤에 주요 목표를 만드는 간단 하 고, 높은 처리량, 고해상도, 고 비용 효율적인 방법을 유전자 KIRs 질병에 대 한 협회 연구 했다. 이것은 성공적으로 달성 이후 qKAT 감염 증, 자기 면역 조건, 그리고 임신 장애4, 의 범위를 포함 하 여 몇몇 큰 질병 협회 연구에 키 르 의 역할 조사에서 고용 되어 24 , 25 , 26.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

의료 연구 위원회 (MRC), 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (부여 계약 번호 695551)에서 유럽 연구 회의 (ERC)와 국립 보건원 (NIH) 케임브리지에서 자금 지원을 받은 프로젝트 생물 의학 연구 센터와 NIH 연구 혈액 및 이식 연구 단위 (NIHR BTRU) 장기 기증 및 이식 캠브리지 대학에서 보 건국 혈액과 이식 (NHSBT)와 협력 표현 되며 그 저자 반드시 보 건국에서 NIHR, 보건, 또는 NHSBT의.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020 −
MilliQ water − − −
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

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유전학 문제 145 Immunogenetics 킬러 세포 면역 글로불린 같이 수용 체 (KIRs) 복사 번호 유사 haplotype 인간 백혈구 항 원 (HLA) 자연 킬러 세포 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)
qKAT: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력
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Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di,… More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

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