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Genetics

qKAT: semiautomáticos cuantitativa escribiendo de la asesino-célula inmunoglobulina-como Receptor de Genes

doi: 10.3791/58646 Published: March 6, 2019

Summary

Cuantitativa la célula de asesino inmunoglobulina-como receptor (KIR) semiautomático escribir (qKAT) es un método simple, de alto rendimiento y rentable para copiar número genes KIR de tipo para su aplicación en estudios de Asociación de población y enfermedades.

Abstract

Receptores de inmunoglobulina-como las células Killer (IIC) son un conjunto de receptores inmunes inhibidoras y activadoras, natural killer (NK) y células T, codificadas por un clúster polimórfico de los genes en el cromosoma 19. Sus ligandos mejor caracterizadas son las moléculas de leucocito humano antígeno (HLA) que se codifican en el locus de (MHC) complejo principal de histocompatibilidad en el cromosoma 6. Hay pruebas sustanciales de que juegan un papel importante en inmunidad, reproducción y trasplante, lo que es fundamental contar con técnicas que pueden con exactitud el genotipo de ellos. Sin embargo, secuencia de alta homología, así como alélica y variación en número de copias, dificulta a genotipo y eficiente los métodos de diseño que pueden exactamente todos los genes KIR . Los métodos tradicionales se limitan generalmente en la resolución de los datos obtenidos, rendimiento, rentabilidad y el tiempo necesario para establecer y ejecutar los experimentos. Describimos un método llamado cuantitativa KIR semiautomático escribir (qKAT), que es un método de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real multiplex de alto rendimiento que puede determinar el número de copia del gene de todos los genes en el locus KIR . qKAT es un método simple de alto rendimiento que puede ofrecer alta resolución KIR copia datos del número, que además permite inferir las variaciones en los haplotipos estructuralmente polimórficos que abarcan los. Estos datos copia número y haplotipo pueden ser beneficiosos para los estudios sobre asociaciones a gran escala enfermedad, genética de la población, así como las investigaciones sobre la expresión y las interacciones funcionales entre KIR y HLA.

Introduction

En los seres humanos, el asesino inmunoglobulina-como receptor(KIR) lugar geométrico se mapea en el brazo largo del cromosoma 19 en el complejo receptor del leucocito (LRC). Este lugar geométrico es alrededor de 150 kb de longitud e incluye 15 KIR genes dispuestos cabeza a cola. Los loci KIR que actualmente se conocen son KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3 KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, 5 KIR2DS1, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, y dos pseudogenes, KIR2DP1 y KIR3DP1. Los genes KIR codifican para dos dimensiones (2D) y tridimensional (3D) dominio de inmunoglobulina-como los receptores con poco (S; activar) o largo (L; inhibitorio) colas citoplasmáticas, que son expresadas por las células asesinas naturales (NK) y los subconjuntos de T células. Variación en número de copias expuestas dentro de las formas de locus KIR diversos haplotipos con gen variable contenido1. Recombinación homóloga no alélica (NAHR), facilitado por un arreglo cerca gene de cabeza a la cola y la secuencia de alta homología, es el mecanismo propuesto para ser responsable de la variabilidad haplotypic. Han reportado más de 100 diferentes haplotipos en las poblaciones en todo el mundo1,2,3,4. Estos haplotipos se pueden dividir en dos grandes grupos: los haplotipos A y B. El haplotipo A contiene 7 genes KIR : KIR3DL3 KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1y KIR3DL2, que son genes KIR inhibitorios y la activación KIR gen KIR2DS4. Sin embargo, hasta 70% de individuos de origen europeo que son homocigotos para el haplotipo KIR A exclusivamente llevar una forma no funcional "eliminación" de KIR2DS45,6. Todas otras combinaciones de genes KIR forman haplotipos del grupo B, incluyendo al menos uno de los genes KIR específicos KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, y KIR2DL5y por lo general incluyen dos o más genes KIR activadoras.

Las moléculas HLA de clase I han sido identificados como ligandos para ciertos receptores inhibitorios (KIR2DL1 KIR2DL2, KIR2DL3y KIR3DL1), activando Receptores (KIR2DS1 KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5y KIR3DS1), y para KIR2DL4, que es un único KIR que contiene una cola citoplásmico largo como otros receptores KIR inhibitorios, pero también tiene un residuo cargado positivamente cerca del dominio extracelular que es común característica de otros receptores KIR activadoras. La combinación de variantes dentro de los genes KIR y los genes HLA influye en la interacción del ligando del receptor formas potenciales NK célula capacidad de respuesta en el nivel individual7,8. Evidencia de los estudios de asociación genética ha indicado que KIR desempeña un papel en la resistencia viral (por ejemplo., virus de la inmunodeficiencia humana [VIH]9 y hepatitis C [VHC] de virus10), el éxito del trasplante 11, el riesgo de trastornos del embarazo y de éxito reproductivo12,13, la protección contra la recaída después de alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) del trasplante14,15, 16y el riesgo de cáncer17.

La combinación de secuencia de alta homología y alélicas y haplotypic diversidad presenta desafíos en la tarea de con precisión los genes KIR genotyping. Métodos convencionales para escribir genes KIR incluyen cartilla de secuencia específica (SSP) polimerasa reacción en cadena (PCR)18,19,20, sonda de oligonucleótidos específicos de secuencia (SSOP) PCR21, y láser asistida por matriz desorción de ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS)22. Los inconvenientes de estas técnicas son que sólo proporcionan información parcial sobre el genotipo de un individuo mientras que también siendo laborioso realizar. Recientemente se ha aplicado secuenciación de próxima generación (NGS) para escribir el locus KIR específicamente. Mientras que este método es muy potente, puede ser costoso de ejecutar y es desperdiciador de tiempo para llevar a cabo controles de datos y análisis profundo.

qKAT es un método cuantitativo de PCR de alto rendimiento. Mientras que los métodos convencionales son laborioso y desperdiciador de tiempo, este método hace posible ejecutar casi 1.000 muestras genomic de la DNA (gDNA) en cinco días y le da el genotipo KIR , así como el número de copias del gen. qKAT consiste en diez reacciones múltiplexes, cada una de ellas apunta a dos loci KIR y un gen de referencia de un número fijo de copia en el genoma (STAT6) utilizado para la cuantificación relativa de los genes KIR Copiar número23. Este análisis se ha utilizado con éxito en estudios que involucran población paneles y cohortes de enfermedad en enfermedades infecciosas como el VHC, condiciones autoinmunes como la diabetes tipo 1 y trastornos del embarazo como preeclampsia, así como proporcionar una genética apoyo a estudios dirigidos a entender el NK célula función1,4,24,25,26.

Protocol

1. preparación y galjanoplastia de ADN

  1. Cuantificar con precisión la concentración del gDNA utilizando un instrumento de lectura espectrofotométrico o fluorométrico.
  2. Diluir el DNA a 4 ng/μL en una placa de 96 pozos pozos profundos. Incluyen al menos un control gDNA muestra con un número de copia conocido y un control no es de plantilla.
  3. Centrifugue las placas de 96 pocillos en 450 x g durante 2 minutos.
  4. Utilizando un instrumento de manejo de líquidos, dispensar cada muestra por cuadruplicado en placas de 384 pozos qPCR para que cada bien tiene 10 ng de ADN (2,5 μL/pocillo). Preparar por lo menos diez placas de 384 pozos, uno para cada reacción de qKAT.
  5. Si gDNA es ser despachado desde más de una placa de 96 pocillos, realice un lavado completo volumen con 2% de blanqueador y agua ultrapura para limpiar las agujas del sistema entre cada placa de 96 pocillos de gDNA muestras para manejo de líquidos.
  6. Secar el ADN por las placas de 384 pozos en un área limpia a temperatura ambiente durante al menos 24 h de incubación.

2. preparación de los cebadores y sondas

Nota: qKAT consta de diez reacciones multiplexores. Cada reacción incluye tres pares de cartilla y tres sondas marcadas con fluorescencia que amplifican específicamente dos genes KIR y una referencia gene. Los sondeos publicados en Jiang et al.27 fueron modificados para que los oligonucleótidos están marcados ahora con tintes ATTO ya que ofrecen mayor fotoestabilidad y vida larga de la señal. Combinaciones de cartilla pre-alícuotas están disponible comercialmente (véase Tabla de materiales).

  1. Preparar combinaciones de cartilla para cada reacción según las diluciones dado en la tabla 1.
  2. Preparar la sonda combinaciones para cada reacción según la tabla 1. Prueba de cada prueba individual antes de hacer la combinación.

3. preparación del Master Mix

Nota Los volúmenes que se mencionan a continuación son para realizar una reacción de la qKAT en un conjunto de placas 10 x 384 pocillos.

  1. Asegurar que las muestras del gDNA plateadas en las placas de 384 pozos estén completamente secas. Realizar todos los pasos en el hielo y mantenga los reactivos de exposición a la luz tanto como sea posible ya que las sondas marcadas con fluorescencia son foto y termo-sensibles.
  2. Descongelar el búfer de qPCR, cartilla y sonda alícuotas a 4 º C.
  3. En el hielo, preparar una mezcla maestra para placas de 10 x 384 pocillos añadiendo 18,86 mL de agua ultrapura, 20 mL de tampón de qPCR, 1000 μl de combinación de confeccionar la cartilla y 180 μl de combinación de confeccionar sonda (tabla 2).
  4. Distribuir uniformemente la mezcla principal a través de una placa de 96 de profundidad bien usando una pipeta multicanal, pipeteo 415 μL en cada pocillo. Mantenga esta placa en una caja de hielo cubierta de la luz.
  5. Utilizando un instrumento de manejo de líquidos, dispensar 9,5 μl de la mezcla principal en cada pocillo de la placa de 384 pozos con gDNA seco. Sellar la placa con una hoja y colóquelo inmediatamente a 4 ° C. Repita este proceso para las placas restantes, asegurando que las agujas del sistema de manejo de líquido se lavan con agua entre cada placa.
  6. Centrifugue las placas de 384 pozos a 450 x g durante 3 min e incúbelos a 4 ° C durante la noche o entre 6-12 h para Resuspender el ADN y para disipar cualquier burbuja de aire.

4. Análisis de qPCR

  1. Después de la incubación durante la noche, centrifugar a 450 x g durante 3 min disipar las burbujas de aire restante.
  2. Para efectos de la automatización, conectar la máquina de qPCR (p. ej., el LightCycler 480) a un controlador de microplacas (véase Tabla de materiales). Programa el controlador de microplacas para colocar las placas en la máquina de qPCR de un muelle de almacenamiento refrigerado protegido de la luz.
    Nota los ensayos deberían, en teoría, trabajar en otras máquinas de qPCR con configuración óptica compatible.
  3. Utilice las siguientes condiciones de ciclismo: 95 ° C por 5 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s y 66 ° C para 50 s, con recogida de datos a 66 ° C.
  4. Una vez finalizado el plazo, tiene el robot recoge la placa de la máquina de qPCR y colocarlo en el dock de descarte.

5. la ejecución de análisis

  1. Después de la amplificación, calcular los valores de ciclo (Cq) de cuantificación usando el segundo método máximo derivado o el método de puntos de ajuste con el software de la máquina de qPCR (véase Tabla de materiales), siguiendo los pasos siguientes.
  2. Abra el software de qPCR y, en la pestaña del navegador , abra el archivo de experimento de reacción guardados para una placa.
  3. Para el análisis el método segundo derivado máximo, seleccione la ficha de análisis y crear un nuevo análisis mediante método Abs Quant/Second derivado máximo.
    1. En la ventana de crear un nuevo análisis , seleccionar tipo de análisis: método de Abs Quant/Second derivado de Max, subconjunto: todas las muestras, programa: amplificación, nombre: Rx-DFO (donde x es el número de reacción).
    2. Seleccione Filtro peine y elija VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Esto asegura que los datos recogidos para STAT6 está seleccionados.
    3. Seleccione Compensación cromática para VIC/HEX/Yellow555(533-580). Haga clic en calcular. Repetir este proceso para Fam (465-510) y Cy5/Cy5.5(618-660). Haga clic en Guardar archivo.
  4. Para el análisis mediante el método de puntos de ajuste, seleccione Abs Quant/ajuste puntos en la ficha de análisis.
    1. En la ventana de crear un nuevo análisis , seleccionar tipo de análisis: método de puntos de ajuste de Quant Abs, subconjunto: todas las muestras, programa: amplificación, nombre: RxF DFO (donde x es el número de reacción).
    2. Seleccione los filtros correctos y compensaciones color de STAT6 y cada uno de los genes KIR (Fam/Cy5). En la ficha de Noiseband , ajuste la banda de ruido para excluir el ruido de fondo.
    3. En la ficha de análisis , establecer los puntos de ajuste a 3 y seleccione que mostrar puntos de ajuste. Haga clic en calcular. Haga clic en Guardar archivo.

6. exportación de los resultados

  1. En el software de la qPCR, abrir el navegador ficha seleccionar Resultados por lotes de exportación.
  2. Abra la carpeta en la que los archivos del experimento se guardan y transferir los archivos en la sección derecha de la ventana. Haga clic en siguiente. Seleccione el nombre y la ubicación del archivo de exportación.
  3. Seleccione el tipo de análisis método Abs Quant/Second derivado de Max o Abs Quant/ajuste puntos. Haga clic en siguiente. Compruebe que el nombre del archivo, la carpeta de exportación y el tipo de análisis son correcto y haga clic en siguiente para iniciar el proceso de exportación.
  4. Espere hasta que el Estado de exportación es aceptable. La pantalla se moverá automáticamente al paso siguiente. Compruebe que todos los archivos seleccionados se han exportado con éxito para que el número de archivos de error = 0. Haga clic en hecho.
  5. Utilizar secuencias de comandos split_file.pl y roche2sds.pl para dividir las placas exportadas en reacciones individuales para cada plato.
    Nota las secuencias de comandos se incluyen en la solicitud/GitHub.

7. copiar el número de cálculos

  1. Abra el software de análisis número de copia (por ejemplo, CopyCaller). Seleccione Importar archivo de resultados PCR en tiempo real y carga archivos de texto creados por roche2sds.pl.
  2. Seleccione analizar y realizar el análisis por cualquier selección muestra calibrador con número de copia conocido o seleccionando el número de copia más frecuente. Vea la tabla 5 para el número más frecuente de la copia de genes KIR típicamente observados en las poblaciones de origen europeo.

8. calidad de los datos verifica

  1. Utilizar el script de R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R para combinar datos del número de copia de todas las placas en una hoja de cálculo.
    Nota las secuencias de comandos se incluyen en la solicitud/GitHub.
  2. Vuelva a verificar los datos sin procesar en el software de análisis número de copia para las muestras que no cumplen con el conocido ligamiento (LD) de los genes KIR (tabla 6).

Representative Results

Análisis de número de copia pueden realizarse mediante la exportación de los archivos para el software de análisis número de copia, que proporciona el número de copia previstos y estimados basado en el método ΔΔCq.

El número de copia se puede predecir que ya sea basado en el número de copia conocido control de muestras de ADN en la placa o introduciendo el número de copia gene más frecuente (tabla 5). La figura 1 muestra los resultados de una placa para una reacción que se dirige a KIR2DL4 y KIR3DS1, así como el gen de referencia STAT6. El número más frecuente de copia para KIR2DL4, un gen de marco en el locus KIR , es dos copias, mientras que el número de copia más frecuente de KIR3DS1, un gen activador, es una copia. Los resultados en la figura muestran las parcelas de amplificación de PCR observadas en el software de qPCR y el copia número de datos generado a partir de los datos de la qPCR. Como se observa, el ensayo es capaz de distinguir entre 0, 1, 2, 3 y 4 números de copia de genes KIR . El software de análisis número de copia permite también una visión de la distribución del número de copia a través de la placa como un gráfico circular o un gráfico de barras. La eficacia de la predicción del número de copia es menor para las muestras con un número más alto de la copia.

La calidad de todos los materiales utilizados en las reacciones, gDNA, buffer, cebadores y sondas, puede afectar la precisión de los resultados obtenidos. Sin embargo, es más probable ser causado debido a la variación en la concentración de DNA a través de una placa de discordancia en los resultados. La pureza de la gDNA extraída, que puede ser medida usando el 260/280 y 260/230 relaciones, también puede tener un efecto sobre la calidad. Una 260/280 relación 1,8-2 y 260/230 de 2-2.2 son deseables. Una desigual rango de ADN a través de una placa pueden conducir a una alta variabilidad en el ciclo umbral (Ct) entre las muestras y la discordancia entre el número estimado de la copia. Los resultados en la figura 2 muestran el efecto de que la disparidad entre los valores det de C a través de una placa puede tener en la precisión en la predicción del número de copia. La línea roja indica el rango del número de copia estimado para una muestra y, idealmente, debe estar tan cerca de un entero como sea posible.

Los datos de número de copia, una vez analizados, se pueden exportar como un archivo de hoja de cálculo en un formato de 96 pozos. Usamos un script de R (disponible a petición) para combinar los datos del número de copia de todas las 10 placas que funcionan como un conjunto en una hoja de cálculo. Datos publicados sobre IIC principalmente las poblaciones de origen europeo permite la predicción de las normas de LD que existen entre los diferentes genes en el complejo KIR 1. Estas predicciones se utilizan para llevar a cabo controles aguas abajo de los copia número resultados (tabla 6). Las muestras que no se ajustan a la LD previsto entre los genes podrían contener polimorfismo inusual o haplotypic variaciones estructurales. Un diagrama de flujo que describe el protocolo se muestra en la figura 3.

Una herramienta llamada identificador de haplotipo KIR (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) fue desarrollada para facilitar la imputación de haplotipos del conjunto de datos. La imputación funciona sobre la base de una lista de referencia de haplotipos en una población de origen Europea1. Sin embargo, la herramienta también permite un conjunto personalizado de haplotipos de referencia a utilizar en su lugar. Se generan tres archivos separados; el primer archivo muestra todas las combinaciones de haplotipo para una muestra, el segundo archivo proporciona una lista recortada de las combinaciones de haplotipos que tienen las frecuencias combinadas más altas, y el tercer archivo contiene las muestras que no se puede asignar haplotipos. No asignación de haplotipos podría utilizarse como un indicador de haplotipos novela.

Figure 1
Figura 1: resultados representativos de una placa de reacción número 5. (A) este panel muestra amplificación parcelas. (B) este panel muestra copia número parcelas. (C) este panel muestra la distribución del número de copia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: resultados representativos de una placa con una concentración variable de ADN por reacción número 5. (A) este panel muestra amplificación parcelas. (B) este panel muestra copia número parcelas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Diagrama de flujo del Protocolo de qKAT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ensayo Genes Cartillas de avance Concentración (nM) Reversas bases Concentración (nM) Puntas de prueba Concentración (nM)
No 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150
2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5B 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200
2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150
2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5B 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 4 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 P4B 150
3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nº 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 P4B 150
2DL 4 C1F 200 C1R 200 P5B - 2DL 4 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 6 2DL 1 B3F 500 B3R 125 P4B 150
2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
N º 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4B 150
2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 P4B 150
3DL2e9 D4F 250 D5R 125 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nº 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150
2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5B 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4B 150
2DS4 C5F 250 C5R 250 P5B 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150

Tabla 1: combinación y concentración de cebadores y sondas en cada reacción de qKAT 27 .

Reacción Alícuotas de cartilla (μL) Alícuotas (μL) de sonda
R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 AGUA STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60
R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R AGUA STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6
2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60
Nota: necesita 20 μl menos agua en el MasterMix
R3 3DL 3 A8FB A8F A8R 2DS4DELF 2DS4R2 AGUA STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60
R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 AGUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60
R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R AGUA STAT6F STAT6R P4B P5B - 2L 4 PSTAT6
2DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60
R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R AGUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60
R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R AGUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60
R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R AGUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60
R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 AGUA STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60
R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R AGUA STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6
2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60

Tabla 2: Volumen (μL) de sonda/cartilla de 100 μm stock soluciones cartilla y sonda alícuotas de combinación.

Nombre Dirección modificación de 5´ modificación de 3´ Secuencia (5' →3') Longitud TM % GC Exón Posición
P4a Sentido FAM BHQ-1 TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA
27 60 44.4 4 425-451
P4B Antisentido FAM BHQ-1 AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T
28 62 50 4 576-603
P5B Sentido ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG
25 60 52 5 828-852
P5B - 2DL 4 Sentido ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG
25 61 56 5 828-852
P9 Sentido ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC
24 60 62.5 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT
26 62 50

Tabla 3: lista de sondas en qKAT 1, 27. los tintes fluorescentes utilizados en el extremo 5' de las sondas de oligo P5b, P5b - 2 DL 4, P9 y PSTAT6 fueron modificados a los tintes ATTO.

Gene Cartillas de Dirección Secuencia (5´-3´) Longitud TM % GC Exón Posición Amplicón (PB) Alelos pueden perderse
3DL2e4 A1F Hacia adelante GCCCCTGCTGAA
ATCAGG
18 52 61.1 4 399-416 179 3DL 2 * 008 * 021, * 027, * 038.
A1R Marcha atrás CTGCAAGGACAG
GCATCAA
19 53 52,6 559-577 3DL 2 * 048
3DP1 A4F Hacia adelante GTCCCCTGGTGA
AATCAGA
19 49 52,6 4 398-416 112 Ninguno
A5R Marcha atrás GTGAGGCGCAAA
GTGTCA
18 52 55,6 492-509 Ninguno
2DS2 A2F Hacia adelante GTCGCCTGGTGA
AATCAGA
19 49 52,6 4 398-416 111 Ninguno
A6R Marcha atrás TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT
21 51 42.9 488-508 Ninguno
3DL 3 A8Fa Hacia adelante GTGAAATCGGGA
GAGACG
18 50 55,6 4 406-423 139 Ninguno
A8Fb Hacia adelante GGTGAAATCAGG
AGAGACG
19 50 52,6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8R Marcha atrás AGTTGACCTGGG
AACCCG
18 51 61.1 526-543 Ninguno
3DL1e4 B1F Hacia adelante CATCGGTCCCAT
GATGCT
18 51 55,6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1R Marcha atrás GGGAGCTGACAA
CTGATAGG
20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502
3DS1 B2F Hacia adelante CATCGGTTCCAT
GATGCG
18 51 55,6 4 549-566 85 3DS1 * 047; pueden recoger 3DL 1 * 054.
B1R Marcha atrás GGGAGCTGACAA
CTGATAGG
20 52 55 614-633 Ninguno
2DL 1 B3F Hacia adelante TTCTCCATCAGT
CGCATGAC
20 52 50 4 544-563 96 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3R Marcha atrás GTCACTGGGAGC
TGACAC
18 50 61.1 622-639 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1 B4F Hacia adelante TCTCCATCAGTC
GCATGAA
19 51 47.4 4 545-563 96 2DS1 * 001
B4R Marcha atrás GGTCACTGGGAG
CTGAC
17 49 64.7 624-640 Ninguno
2DS3 B5F Hacia adelante CTCCATCGGTCG
CATGAG
18 53 61.1 4 546-563 96 Ninguno
B5R Marcha atrás GGGTCACTGGGA
GCTGAA
18 51 61.1 624-641 Ninguno
2DS5 B6F2 Hacia adelante AGAGAGGGGACG
TTTAACC
19 50 52,6 4 475-493 173 Ninguno
B6R3 Marcha atrás TCCAGAGGGTCA
CTGGGC
18 53 66.7 630-647 2DS5 * 003
2DL 4 C1F Hacia adelante GCAGTGCCCAGC
ATCAAT
18 52 55,6 5 808-825 83 Ninguno
C1R Marcha atrás CCGAAGCATCTG
TAGGTCT
19 52 52,6 872-890 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2 2DL2F4 Hacia adelante GAGGTGGAGGCC
CATGAAT
19 52 57.9 5 778-796 151 2DL 2 * 009; 782G cambiada a.
C3R2 Marcha atrás TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT
20 51 45 909-928 Ninguno
2DS4 C5F Hacia adelante TCCCTGCAGTGC
GCAGC
17 57 70.6 5 803-819 120 Ninguno
C5R Marcha atrás TTGACCACTCGT
AGGGAGC
19 52 57.9 904-922 2DS4 * 013
2DS4Del 2DS4Del Hacia adelante CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT
19 54 57.9 5 750-768 203 Ninguno
2DS4R2 Marcha atrás TGACGGAAACAA
GCAGTGGA
20 53 50 933-952 Ninguno
2DS4FL 2DS4FL Hacia adelante CCGGAGCTCCTA
TGACATG
19 53 57.9 5 744-762 209 Ninguno
2DS4R2 Marcha atrás TGACGGAAACAA
GCAGTGGA
20 53 50 933-952 Ninguno
2DL 3 D1F Hacia adelante AGACCCTCAGGA
GGTGA
17 48 58.8 9 1180-1196 156 Ninguno
D1R Marcha atrás CAGGAGACAACT
TTGGATCA
20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 y 2DL 3 * 01802
2DL 5 D2F Hacia adelante CACTGCGTTTTC
ACACAGAC
20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 y 2DL5B * 020
D2R Marcha atrás GGCAGGAGACAA
TGATCTT
19 49 47.4 1315-1333 Ninguno
2DP1 D3F Hacia adelante CCTCAGGAGGTG
ACATACGT
20 53 55 9 1184-1203 121 Ninguno
D3R Marcha atrás TTGGAAGTTCCG
TGTACACT
20 50 45 1285-1304 Ninguno
3DL1e9 D4F Hacia adelante CACAGTTGGATC
ACTGCGT
19 52 52,6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2 Marcha atrás CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA
23 53 43.5 1273-1295 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9 D4F Hacia adelante CACAGTTGGATC
ACTGCGT
19 52 52,6 9 1203-1221 156 Ninguno
D5R Marcha atrás GACCTGACTGTG
GTGCTCG
19 54 63.2 1340-1358 Ninguno
STAT6 STAT6F Hacia adelante CCAGATGCCTAC
CATGGTGC
20 54 60 129
STAT6R Marcha atrás CCATCTGCACAG
ACCACTCC
20 54 60

Tabla 4: secuencias de los cebadores utilizados en qKAT 1, 27.

KIR gene 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DP1 2DL 4 3DL 1
EX9
3DL 1
EX9
3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4
Total
2DS4
FL
2DS4
DEL
3DL 2
EX4
3DL 2
EX9
Número de copia más frecuente 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

Tabla 5: Número de copia más frecuente para KIR genes comúnmente observados en las muestras de origen Europea.

Reglas de desequilibrio de acoplamiento para qKAT basado en poblaciones europeas Verificación de número de copia
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 y KIR3DL2 son marco genes presentes en ambos haplotipos. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 y KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 y KIR2DL2 son en el LD con otros 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 y KIR2DL3 son alelos del mismo gen 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 y KIR2DL1 son en el LD con otros 2DP1=2 DL 1
5 Exón 4 de KIR3DL1 y KIR3DL2 equivale al exón 9 de KIR3DL1 y KIR3DL2 respectivamente. 3DL1ex4=3DL1ex9 y 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 y KIR3DS1 son los alelos 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 y KIR2DS5 son en el LD con KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 y KIR2DS1 están en LD 3DS1=2DS1
9 Presencia de otal KIR2DS1 y KIR2DS4Tes mutuamente exclusiva en un haplotipo 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL y KIR2DS4del son variantes de KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabla 6: ligamiento entre KIR genes observados comúnmente en poblaciones de origen a europeo se pueden usar para comprobar el número de copia de datos 1,27.

Discussion

Describimos un nuevo método semiautomático de alto rendimiento, llamado qKAT, que facilita la copia número tipificación de genes KIR . El método es una mejora sobre los métodos convencionales como SSP-PCR, que son de bajo rendimiento y sólo pueden indicar la presencia o ausencia de estos genes altamente polimórficos.

La exactitud de los datos del número de copia obtenidas depende de múltiples factores, incluyendo la calidad y uniformidad de la concentración de las muestras del gDNA y la calidad de los reactivos. La calidad y precisión de las muestras del gDNA a través de una placa son muy importantes ya que las variaciones en la concentración a través de la placa pueden resultar en errores en el cálculo del número de copia. Puesto que los análisis se validaron utilizando conjuntos de muestra de origen Europea, datos de cohortes de otras partes del mundo requieren controles más a fondo. Esto es para asegurar que casos de deserción del alelo o atascamiento no específico primer punta de prueba no son malinterpretados como variación en número de copias.

Mientras que los ensayos fueron diseñados y optimizados para funcionar como alto rendimiento, puede ser modificados para ejecutar menos ejemplos. La métrica de confianza en el software de análisis número de copia es afectada cuando se analizan menos muestras, pero esto puede mejorarse si se incluyen muestras de ADN genómicas de control con un conocido número de copia de genes KIR en la placa y muestra más repeticiones incluido.

Laboratorios sin líquido y placa-manipulación de robots, mezcla principal puede dispensar utilizando pipetas de varios canales y placas pueden cargarse manualmente en el instrumento de la qPCR.

El objetivo principal detrás del desarrollo de qKAT fue crear un método de alto rendimiento, alta resolución y rentable simple, genotipo IIC para enfermedad estudios de asociación. Esto fue alcanzado con éxito ya que qKAT se ha empleado en la investigación sobre el papel de KIR en varios estudios de Asociación de enfermedad grande, incluyendo una gama de enfermedades infecciosas, condiciones autoinmunes y embarazo trastornos4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El proyecto recibido financiamiento del Consejo de investigación médica (MRC), el Consejo Europeo de investigación (CEI) bajo el programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo no. 695551 de la subvención) y el Instituto Nacional de salud (NIH) de Cambridge Biomédica centro de investigación y NIH investigación sangre y trasplante de unidad de investigación (NIHR BTRU) en donación de órganos y trasplante en la Universidad de Cambridge y en colaboración con sangre de NHS y trasplante (NHSBT). Las opiniones expresadas son las de los autores y no necesariamente las del NHS, el NIHR, el Departamento de salud o la NHSBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020
MilliQ water
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

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qKAT: semiautomáticos cuantitativa escribiendo de la asesino-célula inmunoglobulina-como Receptor de Genes
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Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

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