Summary

Thrombozyten-basierte Erkennung von Stickoxid im Blut durch die Messung VASP Phosphorylierung

Published: January 07, 2019
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Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um die mögliche Verwendung von Thrombozyten als hochsensible Stickoxid-Sensor im Blut zu beheben. Es beschreibt erste Thrombozyten Vorbereitung und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als Stickoxid-Generatoren.

Abstract

Blutplättchen sind verantwortlich für die ordnungsgemäße Blutgerinnung Blutbestandteilen. Ihre Funktion ist durch verschiedene Wege stark reguliert. Einer der potentesten vasoaktive Agenten, Stickstoffmonoxid (NO), kann auch als eine mächtige Inhibitor der Thrombozytenaggregation handeln. Direkt ist kein Nachweis im Blut sehr anspruchsvoll aufgrund seiner hohen Reaktivität mit zellfreien Hämoglobin, die keine Halbwertszeit bis Millisekundenbereich begrenzt. Derzeit keine Änderungen nach Interventionen nur geschätzt werden anhand der gemessenen Veränderungen von Nitrit und Nitrat (Mitglieder der Stoffwechselweg der Nitrat-Nitrit-NO). Aber genauer gesagt, sind diese Messungen eher schwierig zu interpretieren gegenüber tatsächlichen keine Änderungen aufgrund der natürlich hohe Ausgangswert Nitrit und Nitratgehalte, die mehrere Größenordnungen höher als erwarteten Veränderungen nicht allein sind. Die Entwicklung der direkte und einfache Methoden, die nicht direkt nachweisen lassen würde ist daher längst überfällig. Dieses Protokoll befasst sich einer möglichen Verwendung von Thrombozyten als eine hochsensible kein Sensor im Blut. Es beschreibt erste Thrombozyten rich Plasma (PRP) und gewaschenen Thrombozyten Vorbereitungen und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als keine Generatoren. Phosphorylierung von VASP an Serin 239 (P-VASPSer239) wird verwendet, um das Vorhandensein von Nr. Die Tatsache, dass VASP Proteins sich besonders in Thrombozyten drückt und dass es schnell phosphoryliert wird, wenn keine vorhanden führt zu eine einmalige Gelegenheit, diesen Weg nutzen, um direkt ohne Präsenz im Blut nachweisen.

Introduction

Thrombozyten sind scheibenförmige kleinzelligen Fragmente aus Megakaryozyten, die entscheidend für die Blutgerinnung sind abgeleitet. Die gerinnende Kaskade wird von verschiedenen bioaktiven Moleküle (wie Kollagen oder ADP), veröffentlicht nach der Verletzung der Gefäßwand initiiert. Die Prozess der Blutgerinnung kann unter verschiedenen Effektoren von Stickstoffmonoxid (NO) geändert werden. Nein, natürlich von Säugerzellen produziert, ist eines der vielseitigsten physiologische Signale. Es wirkt als potenter Vasodilatator, Neurotransmitter und immun-Modulator, einige seiner vielen Funktionen zu nennen. In der Blutbahn hilft auch keine, um das Ausmaß der Blutgerinnung durch Hemmung der Thrombozytenaggregation zu regulieren. Die wahrscheinlichsten Ursachen von NO in den Blutkreislauf zählt Nitrit, eine anorganische Ionen, die gezeigt worden, um als ein Vorläufer der Nr. dienen Reaktion mit roten Blutkörperchen (Erythrozyten), Nitrit reduziert sich auf NO und DeoxyHb ist oxidiert zu Methämoglobin (MetHb)1. Nein von Erythrozyten befreit vasoaktive und verursacht Vasorelaxation2. Dieses Nitrit-Reduktion-Weg ist eine Alternative keine Generation Weg zusammen mit handeln und Ergänzung der klassischen keine Generation Weg durch endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase unter hypoxischen Bedingungen.

Thrombozyten selbst sind nicht in der Lage, Nitrit in NO zu reduzieren, sondern reagieren sehr empfindlich auf ihre Präsenz. In intakten Blutplättchen, nicht in die nanomolaren Reichweite erhöht cGMP (EG50 = 10 nM) und Phosphorylierung von VASP (EG50 = 0,5 nM)3. Thrombozyten können dienen daher als hervorragende Sensor von Nitrit Abbau von Erythrozyten und keine Freisetzung ins Blut. Es gibt mehrere Methoden, die das Ausmaß der Thrombozyten Aktivierung – wie Aggregometry und Thromboelastography (TEG) direkt messen4,5. Diese Methoden erfordern jedoch teuer spezialisierte Instrumentierung und ziemlich große Mengen an Material. Es ist auch möglich, Ereignisse überwachen nachgeschalteten, nach NO wird freigegeben von Erythrozyten, Thrombozyten-Oberfläche Protein-Expression – z. B. P-Selektin6Änderungen bei. Nein ist auch bekannt, die Menge an cGMP in der Thrombozyten-7erhöhen. Früher wir cGMP keine Freisetzung ins Blut nach der Nitrit-Reduzierung durch sauerstoffarmes RBC8zu überwachen. Dies erwies sich als eine sehr empfindliche Methode; Allerdings cGMP ist eine kurzlebige Molekül und seine Entdeckung beinhaltet umfangreiche Arbeit. Eine weitere Möglichkeit, beschrieben in dem vorgestellten Protokoll verwendet Phosphorylierung von gefäßerweiternden stimuliert Phospho (VASP)-Protein, das Vorhandensein von NO im Blut zu erkennen. VASP ist ein Substrat aus Protein Kinase G Aktivierung, die auf die Interaktion mit Nein durch die sGC/cGMP Weg9phosphoryliert wird. Nachweisbare VASP Phosphorylierung tritt bei sehr niedrigen NO-Konzentrationen, die Blutplättchen im Blut einen sehr empfindlichen Detektor keine Präsenz machen könnte. VASP hoch in Thrombozyten angegeben, jedoch nicht in anderen Blutkörperchen, wodurch gezielt die Ereignisse im Zusammenhang mit Thrombozyten10folgen.

Das Hauptziel dieses Protokolls soll die Methode im Detail für den Nachweis von keine Freigabe im Vollblut mit seiner Interaktion mit Thrombozyten durch die Überwachung der VASP Phosphorylierung11,12beschreiben. Das beschriebene Verfahren ermöglicht Früherkennung von niedrigen keine Konzentrationen – theoretisch im nanomolaren Bereich macht dieses Protokolls empfindlicher als cGMP Bestimmung, durch die Verwendung von standard-Western-Blot-Techniken, die in die meisten Labor erreichbare Einstellungen.

Protocol

Hinweis: Blutproben wurden von NIH Blutbank erhalten (IRB Protokoll genehmigt: 99-CC-0168). (1) Blut Probenaufbereitung Hinweis: Zur Vermeidung von Thrombozyten Aktivierung Blut langsam und vorsichtig mischen mit Citrat durch das Rohr mehrmals umdrehen. Platelet-Rich Plasma (PRP) Vorbereitung Ziehen Sie 30 – 50 mL Blut mit einem 20 G oder größeren Durchmesser Nadel u…

Representative Results

Venöse Blutproben haben pO2 Werte zwischen 50-80 MmHg. Sauerstoffabspaltung durch Helium sinkt rasch pO2 bis 25 MmHg innerhalb von 10 min. erhöhte Sauerstoffabspaltung mal etwas weiter sinkt pO2. Erhöhte Zeit Sauerstoffabspaltung führt jedoch auch zu deutlich erhöhten Werten von zellfreien Hämoglobin (bestimmt durch Co Oximeter, visuell auf Abbildung 2 als zunehmend rote Färbung des Plasma gesehen) (<strong clas…

Discussion

Da Thrombozyten leicht aktiviert werden, schonendes Handling von Thrombozyten-haltigen Proben erforderlich ist. Schnellen pipettieren und kräftig schütteln sollte vermieden werden. Thrombozyten-Hemmer wie Prostazyklin (PGI2) können verwendet werden, um Thrombozyten Aktivierung zu verhindern; Dies kann jedoch einige Signalwege innerhalb der Blutplättchen beeinflussen. Für die Vorbereitung von Thrombozyten Pellets wir die Thrombozyten-Suspensionen ACD hinzufügen und langsamem Zentrifugation verwenden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Intramurale, Dr. Alan N. Schechter NIH finanziert.

Materials

Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

References

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Cite This Article
Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

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