Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando VASP fosforilazione

doi: 10.3791/58647 Published: January 7, 2019

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per affrontare l'uso potenziale delle piastrine come un sensore molto sensibile dell'ossido di azoto nel sangue. Esso descrive la preparazione iniziale della piastrina e l'uso di nitrito e di cellule rosse del sangue deossigenate come generatori di ossido nitrico.

Abstract

Le piastrine sono le componenti del sangue responsabili della coagulazione sanguigna corretta. Loro funzione altamente è regolata da varie vie. Uno dei più potenti agenti vasoattivi, ossido nitrico (NO), può anche agire come un potente inibitore dell'aggregazione piastrinica. Diretto nessun rilevamento nel sangue è molto impegnativo a causa della sua alta reattività con emoglobina senza cellula che non limita Half-Life per la gamma di millisecondo. Attualmente, nessun cambiamento dopo gli interventi sono solo stimati basato sui cambiamenti misurati di nitriti e nitrati (membri del pathway metabolici di nitrato-nitrito-NO). Tuttavia precisa, queste misure sono piuttosto difficili da non interpretare vis à vis effettivo modifiche, a causa del nitrito naturalmente elevato della linea di base e livelli che sono diversi ordini di grandezza superiori a cambiamenti attesi non sé di nitrati. Di conseguenza, lo sviluppo di metodi diretti e semplici che permetterebbero di individuare direttamente NO è attesa da tempo. Questo protocollo non risolve un potenziale impiego delle piastrine come un altamente sensibili sensore nel sangue. Descrive come nessun generatori di plasma ricco di piastrine iniziale (PRP) e delle piastrine lavate i preparativi e l'uso di nitrito e di cellule rosse del sangue deossigenate. Fosforilazione della VASP a serina 239 (P-VASPSer239) viene utilizzata per rilevare la presenza di NO. Il fatto che la proteina VASP è altamente espressa in piastrine e che esso viene rapidamente fosforilata quando nessuno è presente conduce a un'occasione unica per utilizzare questa via per non rilevare direttamente la presenza nel sangue.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Le piastrine sono piccole cellule a forma di disco frammenti derivate dai megacariociti che sono fondamentali per la coagulazione del sangue. La cascata di coagulazione è iniziata da varie molecole bioattive (come collagene o ADP), pubblicati dopo la ferita della parete vascolare. Processo di coagulazione del sangue può essere modificato, tra vari effettori dall'ossido nitrico (NO). NO, prodotta naturalmente dalle cellule di mammiferi, è uno dei più versatili segnali fisiologici. Esso agisce come un potente vasodilatatore, neurotrasmettitore e modulatore immunitario, per citarne alcune delle sue numerose funzioni. Nel sangue, NO anche aiuta a regolare l'entità della coagulazione del sangue inibendo l'aggregazione della piastrina. Una delle fonti più probabile di NO nel sangue è nitrito, un ione inorganico che ha dimostrato di servire come un precursore del No. Reagendo con globuli rossi (RBCs), nitrito è ridotto a n e deoxyHb è ossidato a metaemoglobina (metHb)1. NO rilasciato da globuli rossi è vasoattivi e provoca vasodilatazione2. Questo percorso di riduzione di nitriti non è un supplente nessun percorso di generazione, agire insieme con e non integrare la classica nessun percorso di generazione mediante endoteliale di ossido nitrico sintasi in condizioni di ipossia.

Le piastrine se stessi non sono in grado di ridurre il nitrito in NO ma sono molto sensibili alla sua presenza. In piastrine intatte, non nel nanomolari gamma aumenta cGMP (CE50 = 10 nM) e fosforilazione della VASP (CE50 = 0.5 nM)3. Di conseguenza, le piastrine possono servire come un ottimo sensore di riduzione di nitrito di RBCs e nessun rilascio nel sangue. Ci sono diversi metodi che possono misurare direttamente il grado di attivazione piastrinica - come aggregometria e tromboelastografia (TEG)4,5. Tuttavia, questi metodi richiedono strumentazione specializzata costosi e piuttosto grandi quantità di materiale. È inoltre possibile monitorare gli eventi a valle, dopo NO viene rilasciato da globuli rossi, utilizzando i cambiamenti nell'espressione di proteina di superficie delle piastrine – ad esempio P-selectin6. NON è noto anche per aumentare la quantità di cGMP in piastrine7. In precedenza, abbiamo usato cGMP per non controllare nessun rilascio nel sangue dopo la riduzione del nitrito di deossigenata RBC8. Ciò rivelata per essere un metodo molto sensibile; Tuttavia, cGMP è una molecola di breve durata e la relativa rilevazione coinvolge vasto lavoro. Un'altra possibilità, descritta nel protocollo presentato, utilizza la fosforilazione del phospho vasodilatatore-stimolata (VASP)-proteina per rilevare la presenza di NO nel sangue. VASP è un substrato di attivazione della proteina chinasi G, che è fosforilata sull'interazione con NO attraverso la via sGC/cGMP9. Fosforilazione VASP rilevabile si verifica molto basso senza concentrazioni, che potrebbero rendere le piastrine un rivelatore molto sensibile di nessuna presenza nel sangue. VASP è altamente espresso in piastrine, ma non in altre cellule del sangue, che permette di seguire in modo selettivo gli eventi che coinvolgono le piastrine10.

L'obiettivo principale del presente protocollo è di descrivere il metodo in dettaglio per la rilevazione di nessun rilascio nel sangue intero utilizzando la sua interazione con le piastrine monitorando VASP fosforilazione11,12. Il metodo descritto non consente di individuazione tempestiva di basso vi erano concentrazioni - teoricamente in gamma nanomolar che rende più sensibile di determinazione di cGMP, dovute all'uso di tecniche standard Western blot realizzabili in laboratorio la maggior parte del presente protocollo Impostazioni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nota: I campioni di sangue sono stati ottenuti dalla banca del sangue di NIH (IRB approvato protocollo: 99-CC-0168).

1. sangue preparazione del campione

Nota: Per evitare l'attivazione della piastrina, prelievo di sangue lentamente e mescolare delicatamente con citrato capovolgendo la provetta diverse volte.

  1. Preparazione di plasma ricco di piastrine (PRP)
    1. 30 – 50 mL di sangue utilizzando un 20 G o un ago di diametro più grande di disegnare e aggiungere in una provetta contenente citrato di sodio (3.8%) in un rapporto di 1:9 o acido citrato destrosio (ACD) (citrato trisodico 85mm, acido citrico 66,6 mM, 111 millimetri di glucosio, pH 4.5) in un rapporto di 1:6.
    2. Aliquotare 5 mL di sangue intero appena raccolti in provette coniche da 15 mL vuote. Centrifugare il sangue intero a 120 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    3. Raccogliere con cura il supernatante contenente le piastrine (plasma ricco di piastrine, PRP) dalla parte superiore mediante una pipetta di trasferimento in plastica.
      Nota: PRP dal punto 1.1.3 è pronto per l'uso negli esperimenti o per un'ulteriore elaborazione per preparare lavato le piastrine. Il morbido pellet ottenuto dopo centrifugazione (punto 1.1.2) contiene globuli rossi e globuli bianchi e può essere ulteriormente purificato per ottenere lavati globuli rossi (RBC) — vedere passaggio 1.3. L'esperimento deve essere finito entro 2 h dopo il prelievo di sangue. Quando si raccolgono PRP (surnatante), evitare la raccolta di buffy coat-contenenti leucociti accumulato nell'interfaccia di PRP/RBC.
  2. Preparazione delle piastrine lavate (opzionale)
    1. Centrifuga raccolti PRP a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e mantenere i pellet della piastrina.
    2. Lavare delicatamente i pellet aggiungendo 5 mL di tampone CGS (120 mM NaCl, 12,9 millimetri trisodio citrato e 30 mM di glucosio, pH 6,5) e centrifuga a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    3. Risospendere il pellet della piastrina con 3 mL di buffer di Tyrode modificato (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12mm NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2mm CaCl2, 10 mM a pH 7,4 glucosio).
    4. Diluire le piastrine (1: 100 — come esempio, 10 µ l di piastrine nel 990 µ l di soluzione di Rees-Ecker) con soluzione di Rees Ecker e conteggio di un emocitometro.
    5. Regolare la densità delle piastrine a 3 x 108 cellule/mL aggiungendo Tyrode buffer.
    6. Incubare la sospensione della piastrina a 37 ° C per 1 h prima di iniziare l'esperimento.
      Nota: Piastrine lavate sono stabili per 5 – 8 h a 37 ° C.
  3. Preparazione della lavata di globuli rossi (RBC)
    1. Dopo la raccolta, centrifugare il pellet morbido ottenuto nel passaggio da 1.1.3 a 2.500 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    2. Scartare il surnatante e lavare la pallina di RBC con 5 mL di PBS mediante centrifugazione a 2.500 x g per 10 min a temperatura ambiente. Ripetere questa operazione per 3 volte.
    3. Scartare il PBS e utilizzare globuli rossi lavati per ulteriori esperimenti.

2. deossigenazione

  1. Aggiungere 1 mL di una miscela di PRP (preparata al punto 1.1.4. o 1.2.4.) e globuli rossi (preparati al passaggio 1.3.) presso l'ematocrito desiderata in una bottiglia in polipropilene chiusa con un tappo di gomma. Ad esempio, al 20% ematocrito, aggiungere 200 µ l di RBCs a 800 µ l di PRP.
    Nota: Ha suggerito gli ematocriti sono da 0% fino al 40%. Non utilizzare una bottiglia di vetro o il pallone come le piastrine aderiscono alla superficie di vetro.
  2. Inserire l'ago collegato al serbatoio di elio gas in bottiglia chiusa e rendere l'uscita del gas con l'inserimento di un ago da 26 G (Figura 1).
  3. Roteare lentamente la bottiglia a temperatura ambiente.
    Nota: Non consentire il gas He bolla attraverso la preparazione di sangue. Flusso di gas lento è preferibile per questa procedura ed eccessivamente veloce flusso di gas di lui conduce al hemolysis aumentato. Il flusso di gas più efficiente deve essere determinato dalla prova, come altamente dipende dalla geometria del setup sperimentale.
  4. Periodicamente è possibile seguire il processo di deossigenazione misurando la pressione parziale dell'ossigeno (pO2) utilizzando un Co-ossimetro.
    Nota: Nelle nostre mani, 10 min di deossigenazione diminuzioni pO2 a 25 mmHg, che è necessaria per la riduzione del nitrito di RBCs. continuando la deossigenazione ridurre ulteriormente pO2 a 10 mmHg; Tuttavia, ha condotto al hemolysis aumentato e l'aumento dell'emoglobina senza cellula (Figura 2).

3. globuli nitrito riduzione

  1. Aggiungere 1 mL di PBS (pH 7.4) in 0,0345 g di NaNO2 per rendere la soluzione di riserva di 500 mM di nitrito. Diluizione seriale in PBS (pH 7.4), diluire 500 mM NaNO2 a 250 µM NaNO2 (25x).
  2. Utilizzando una microsiringa, iniettare nitrito (40 µ l) attraverso il setto nel campione deossigenato di PRP e globuli rossi per ottenere le concentrazioni finali di 10 µM in totale 1 mL di campione.
    Nota: In questo esperimento, le concentrazioni finali di nitrito utilizzato è di 10 µM.
  3. Incubare il campione a 37 ° C per 10 minuti o più.
    Nota: Regolare l'esatta durata di incubazione di RBC con nitrito necessario per la riduzione del nitrito massima per diversi tipi di esperimenti.
  4. Rimuovere il tappo e la pipetta da 1 mL del campione in una provetta da microcentrifuga.
  5. Centrifugare a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente.
  6. Dispensare 300 µ l della sospensione piastrinica da parte superiore del surnatante e mescolare con il ACD (pH 6,5) in un rapporto di 1:9. Scartare il pellet di RBC.
  7. Centrifugare la sospensione delle piastrine a 500 x g per 4 min a temperatura ambiente.
  8. Aggiungere 80 µ l di tampone di lisi ghiacciata (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7.4) contenente inibitore della proteasi cocktail III (1: 500) il recettore piastrinico pellet.

4. Western Blotting della VASP

  1. Carico 15 µ g di proteina da ogni campione a 2 separati 10% gel di SDS-PAGE.
    Nota: Buffer di strippaggio duro, che contiene b-mercaptoetanolo, non è possibile rimuovere gli anticorpi P-VASPSer239 e VASP dalla membrana; di conseguenza, P-VASP Ser239 e VASP dovrebbe essere gestito separatamente.
  2. Eseguire i gel 120 V per h 1,30 e trasferimento alla membrana di nitrocellulosa.
  3. Legame non specifico di blocco con 5% senza grassi del latte secco.
  4. Incubare la membrana con P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000) e GAPDH (1:1, 000) per una notte a 4 ° C.
  5. Incubare anticorpo secondario di rafano perossidasi (HRP) con la membrana per 45 min a temperatura ambiente.
  6. Esporre la membrana con una macchina di imager e quantificare la densità di banda usando ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I campioni di sangue venoso hanno pO2 valori tra 50-80 mmHg. Deossigenazione di elio diminuisce velocemente pO2 a 25 mmHg entro 10 min. Increased deossigenazione tempo leggermente maggiori diminuzioni pO2. Tuttavia, tempo aumentato di deossigenazione inoltre conduce ai livelli significativamente aumentati di emoglobina senza cellula (determinato dal Co-ossimetro, visivamente visto in Figura 2 come colorazione sempre più rossa di plasma) (Figura 2A-B). Hemolysis aumentato non è associato con mescolando perché mescolando senza deossigenazione non induce emolisi (Figura 2).

Abbiamo trovato che la presenza di globuli rossi in campioni lisati diminuisce P-VASPSer239 e VASP rilevato da Western blotting (Figura 3). Pertanto, separiamo in primo luogo le piastrine e globuli rossi prima di eseguire il Western blot per rilevare P-VASPSer239 in piastrine.

Per mostrare che c'è abbastanza tempo per separare i globuli rossi fuori piastrine senza intaccare la fosforilazione VASP, abbiamo non usato un breve durata nessun donatore. PROLI NONOate (nessun donatore con emivita di 1.8 s a 37 C pH 7.4), rapidamente aumentato P-VASPSer239 nelle piastrine (entro 10 s di incubazione). P-VASPSer239 indotta da PROLI NONOate viene rilevata per 10 min dopo l'incubazione con PRP (Figura 4).

Nitrito aumenta P-VASPSer239 in piastrine in presenza di globuli rossi deossigenate (pO2 25 mmHg). Nitrito riduttasi attività di RBCs deossigenata dipende dall'ematocrito e il massimo effetto è osservato a 20% ematocrito (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: camera di deossigenazione. Miscela di PRP e RBCs è aggiunto in una bottiglia di plastica chiusa con un setto di gomma. Il flacone chiuso è collegato alla linea di elio (He) utilizzando un ago. Ossigeno è risciacquato da un ago di siringa piccola (26 G) che serve come una presa di gas.

Figure 2
Figura 2: Pressione parziale dell'ossigeno (pO2) e senza cellula di emoglobina dopo deossigenazione. Esempi di PRP (A) e globuli rossi erano desossigenati per 3, 5, 10, 15, 30 e 50 min. pO2 dei campioni sono stati misurati dall'analizzatore di gas del sangue (n = 3). Barre di errore sono immagini SEM. rappresentante del surnatante di PRP + RBCs campioni mescolato con (B) o senza Elio (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: bande di macchia rappresentante VASP Western in campioni di PRP/RBCs preparati alle varie ematocrito. Globuli rossi sono stati aggiunti in PRP a 1, 5, 10, 15, 20, 40% ematocrito. Miscele di PRP + globuli rossi sono state centrifugate a 500 x g per 5 min e lisate con tampone di lisi.

Figure 4
Figura 4: rappresentante Western blot bande di P-VASPSer239 e VASP in PRP dopo l'esposizione a nessun donatore PROLI NONOate. NONOate PROLI (10 M) è stato aggiunto in PRP e incubate a 37 ° C per 10 e 30 s e 1, 2, 5, 10, 20 e 40 min.

Figure 5
Figura 5: VASPSer239 fosforilazione dipende dai livelli di ematocrito e2 pO. (A) PRP + RBCs (20% ematocrito) erano desossigenato a due livelli di diversi pO2 , 25 e 40 mmHg. P-VASPSer239 e VASP sono stati misurati dopo l'incubazione dei campioni deossigenati con 10 M nitrito a 37 ° C per 10 min (B) nitrito (10 M) è stato aggiunto in deossigenata PRP + RBCs a 0, 10, 20 e 40% ematocrito (pO2 = 25 mmHg). Fold è aumentato (P-VASPSer239) è stata calcolata rispetto al controllo (PRP + RBCs senza nitrito) per ogni valore di ematocrito. Barre di errore = SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Poiché le piastrine sono attivate, un trattamento delicato del piastrina-contenenti campioni è richiesto. Pipettaggio veloce e vigorosa agitazione dovrebbe essere evitati. Inibitori delle piastrine come prostaciclina (PGI2) possono essere utilizzati per impedire l'attivazione della piastrina; Tuttavia, questo potrebbe influire sulla alcune vie di segnalazione all'interno delle piastrine. Per la preparazione di pellet della piastrina, aggiungiamo ACD per le sospensioni della piastrina e utilizzare centrifugazione a bassa velocità.

Preparate le piastrine in PRP hanno una vita limitata portata, fino a 2 h. Per ottenere un'elevata riproducibilità, tutti gli esperimenti dovrebbero essere fatto solo con piastrine fresche ed entro 2 h dopo la raccolta del sangue. I dati presentati sono stati ottenuti con le piastrine in PRP, che è considerato più fisiologico di piastrine lavate. Anche se la durata e la purezza aumentare per piastrine lavate, centrifugazione ripetuti durante la preparazione delle piastrine lavate può portare alla loro attivazione spontanea e questo potrebbe causare incoerenti qualità delle preparazioni della piastrina. PRP è preferita sopra piastrine lavate poiché la procedura è più veloce e ulteriore manipolazione potrebbe attivare le piastrine. Tuttavia, in casi specifici, quando l'interferenza di fattori della coagulazione del plasma potrebbe interferire con l'installazione sperimentale, piastrine di lavaggio rappresenta soluzione per evitare questi problemi.

Contaminazione di ossigeno nei campioni deossigenati è il passo più importante critico per questo test. Globuli rossi possono essere riuniti e deossigenati prima di essere aggiunti per la PRP. Tuttavia, trasferimento di RBCs deossigenata aumenta il rischio di contaminazione di ossigeno. Inoltre, deossigenazione di globuli rossi concentrati richiede più tempo di deossigenazione della preparazione completa presso l'ematocrito desiderata, e più lunga esposizione a gas egli conduce ai livelli aumentati dell'emoglobina senza cellula. Sebbene senza cellula dell'emoglobina può essere lavato fuori deossigenata RBCs, la soluzione salina tampone fosfato o altri buffer utilizzati per il lavaggio deve essere attentamente deossigenato per prevenire la contaminazione di ossigeno durante la centrifugazione. Per abbreviare il processo di preparazione ed evitare la contaminazione di ossigeno inutili, ogni campione PRP + RBCs era preparato presso l'ematocrito desiderato prima e poi desossigenato prima dell'aggiunta di nitriti.

Per quantificare i P-VASPSer239 mediante Western blot, globuli rossi devono essere separati fuori le piastrine. VASP è espressa in RBCs13, ma i livelli sono molto inferiori in piastrine e non significativa rispetto all'emoglobina. Poiché la concentrazione nella proteina totale viene utilizzato per il caricamento di controlli in Western blot, la presenza di globuli rossi nei campioni di lisato interferisce con P-VASP e VASP misurazione mediante Western blotting. A causa di un lento tasso di defosforilazione di enzimi fosfatasi in piastrine14, P-VASP è sostenuta per 10 min (Figura 4) e pertanto è possibile separare i globuli rossi per centrifugazione prima di raccogliere i lisati cellulari della piastrina.

La CE50 per fosforilazione VASP è quasi un ordine di grandezza inferiore rispetto al CE50 per aumentare il picco cGMP, 0,5 nM e 9 nM, rispettivamente3, che rende la fosforilazione di VASP uno dei metodi più sensibili per rilevare la presenza di importi bassi di NO. Tuttavia, la curva di fosforilazione VASP in risposta a NO è a forma di campana; Dopo un picco 3-30 nM di n.3, si osserva una diminuzione di fosforilazione. Questa risposta non lineare a nessun concentrazioni aumentanti rende VASP inadatto per rigorosa alcuna quantificazione.

Poiché le piastrine in PRP hanno una vita breve, il dosaggio deve essere eseguito in piastrine fresche entro 2 h dopo prelievo di sangue. L'incoerenza dei livelli2 pO dopo la deossigenazione può essere trovato poiché la deossigenazione di campioni dipende la portata di gas elio e tasso di agitando la bottiglia. Pertanto, il tempo per deossigenazione deve essere determinata da trial. Per la misura di P-VASP dalle macchie occidentali, la scelta dell'anticorpo è critica, e uno ha bisogno di non utilizzare un telefono nessun donatore come controllo positivo per verificare la specificità. Oltre a NO, P-VASPSer239 in piastrine può essere fosforilato dall'inibizione degli enzimi phosphodiesterease e l'attivazione della chinasi di proteina una via.

La misura di P-VASPSer239 ha alcuni vantaggi rispetto ai test di cGMP. cGMP in piastrine ha un'emivita molto breve (meno di 10 s) e la misurazione di cGMP richiede l'aggiunta di inibitori della fosfodiesterasi inibitore3. Inoltre, la misurazione di cGMP utilizza una tecnica di ELISA piuttosto costosa. VASP può essere misurata semplicemente da un protocollo di in-House Western blot e pertanto è più prontamente disponibile.

P-VASP aumentoSer239 in piastrine è stato utilizzato con successo come un sensore per nessuna generazione da nitrito inalato in vivo6. Di conseguenza, abbiamo mostrato che è possibile utilizzare P-VASPSer239 in piastrine come indicatore di nessuna generazione in vitro e in vivo nel sangue e, possibilmente, in varie altre situazioni. L'insolitamente basso CE50 rende questo metodo un ottimo candidato per non rilevare la presenza di molto basso vi erano concentrazioni nel sangue. Di conseguenza, questo protocollo fornisce una possibilità di non studiare nessuna generazione nel sangue a vari stimoli fisiologici, come ad esempio durante la cascata di coagulazione del sangue, puro sforzo aumentato o aumentato l'infiammazione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Alan Schechter è elencato come co-inventore su numerosi brevetti rilasciati ai National Institutes of Health, per l'uso di nitrito sali per il trattamento delle malattie cardiovascolari. Egli riceve i diritti d'autore basati su NIH licenze di questi brevetti per lo sviluppo clinico, ma nessun altro indennizzo.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione intramurale NIH Dr Alan N. Schechter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9, (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9, (3), e92435 (2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93, (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7, (1), e30380 (2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273, (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120, (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13, (3), e0193747 (2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370, (3), 184-188 (1995).
Rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando VASP fosforilazione
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter