Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um die mögliche Verwendung von Thrombozyten als hochsensible Stickoxid-Sensor im Blut zu beheben. Es beschreibt erste Thrombozyten Vorbereitung und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als Stickoxid-Generatoren.
Abstract
Blutplättchen sind verantwortlich für die ordnungsgemäße Blutgerinnung Blutbestandteilen. Ihre Funktion ist durch verschiedene Wege stark reguliert. Einer der potentesten vasoaktive Agenten, Stickstoffmonoxid (NO), kann auch als eine mächtige Inhibitor der Thrombozytenaggregation handeln. Direkt ist kein Nachweis im Blut sehr anspruchsvoll aufgrund seiner hohen Reaktivität mit zellfreien Hämoglobin, die keine Halbwertszeit bis Millisekundenbereich begrenzt. Derzeit keine Änderungen nach Interventionen nur geschätzt werden anhand der gemessenen Veränderungen von Nitrit und Nitrat (Mitglieder der Stoffwechselweg der Nitrat-Nitrit-NO). Aber genauer gesagt, sind diese Messungen eher schwierig zu interpretieren gegenüber tatsächlichen keine Änderungen aufgrund der natürlich hohe Ausgangswert Nitrit und Nitratgehalte, die mehrere Größenordnungen höher als erwarteten Veränderungen nicht allein sind. Die Entwicklung der direkte und einfache Methoden, die nicht direkt nachweisen lassen würde ist daher längst überfällig. Dieses Protokoll befasst sich einer möglichen Verwendung von Thrombozyten als eine hochsensible kein Sensor im Blut. Es beschreibt erste Thrombozyten rich Plasma (PRP) und gewaschenen Thrombozyten Vorbereitungen und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als keine Generatoren. Phosphorylierung von VASP an Serin 239 (P-VASPSer239) wird verwendet, um das Vorhandensein von Nr. Die Tatsache, dass VASP Proteins sich besonders in Thrombozyten drückt und dass es schnell phosphoryliert wird, wenn keine vorhanden führt zu eine einmalige Gelegenheit, diesen Weg nutzen, um direkt ohne Präsenz im Blut nachweisen.
Introduction
Thrombozyten sind scheibenförmige kleinzelligen Fragmente aus Megakaryozyten, die entscheidend für die Blutgerinnung sind abgeleitet. Die gerinnende Kaskade wird von verschiedenen bioaktiven Moleküle (wie Kollagen oder ADP), veröffentlicht nach der Verletzung der Gefäßwand initiiert. Die Prozess der Blutgerinnung kann unter verschiedenen Effektoren von Stickstoffmonoxid (NO) geändert werden. Nein, natürlich von Säugerzellen produziert, ist eines der vielseitigsten physiologische Signale. Es wirkt als potenter Vasodilatator, Neurotransmitter und immun-Modulator, einige seiner vielen Funktionen zu nennen. In der Blutbahn hilft auch keine, um das Ausmaß der Blutgerinnung durch Hemmung der Thrombozytenaggregation zu regulieren. Die wahrscheinlichsten Ursachen von NO in den Blutkreislauf zählt Nitrit, eine anorganische Ionen, die gezeigt worden, um als ein Vorläufer der Nr. dienen Reaktion mit roten Blutkörperchen (Erythrozyten), Nitrit reduziert sich auf NO und DeoxyHb ist oxidiert zu Methämoglobin (MetHb)1. Nein von Erythrozyten befreit vasoaktive und verursacht Vasorelaxation2. Dieses Nitrit-Reduktion-Weg ist eine Alternative keine Generation Weg zusammen mit handeln und Ergänzung der klassischen keine Generation Weg durch endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase unter hypoxischen Bedingungen.
Thrombozyten selbst sind nicht in der Lage, Nitrit in NO zu reduzieren, sondern reagieren sehr empfindlich auf ihre Präsenz. In intakten Blutplättchen, nicht in die nanomolaren Reichweite erhöht cGMP (EG50 = 10 nM) und Phosphorylierung von VASP (EG50 = 0,5 nM)3. Thrombozyten können dienen daher als hervorragende Sensor von Nitrit Abbau von Erythrozyten und keine Freisetzung ins Blut. Es gibt mehrere Methoden, die das Ausmaß der Thrombozyten Aktivierung - wie Aggregometry und Thromboelastography (TEG) direkt messen4,5. Diese Methoden erfordern jedoch teuer spezialisierte Instrumentierung und ziemlich große Mengen an Material. Es ist auch möglich, Ereignisse überwachen nachgeschalteten, nach NO wird freigegeben von Erythrozyten, Thrombozyten-Oberfläche Protein-Expression – z. B. P-Selektin6Änderungen bei. Nein ist auch bekannt, die Menge an cGMP in der Thrombozyten-7erhöhen. Früher wir cGMP keine Freisetzung ins Blut nach der Nitrit-Reduzierung durch sauerstoffarmes RBC8zu überwachen. Dies erwies sich als eine sehr empfindliche Methode; Allerdings cGMP ist eine kurzlebige Molekül und seine Entdeckung beinhaltet umfangreiche Arbeit. Eine weitere Möglichkeit, beschrieben in dem vorgestellten Protokoll verwendet Phosphorylierung von gefäßerweiternden stimuliert Phospho (VASP)-Protein, das Vorhandensein von NO im Blut zu erkennen. VASP ist ein Substrat aus Protein Kinase G Aktivierung, die auf die Interaktion mit Nein durch die sGC/cGMP Weg9phosphoryliert wird. Nachweisbare VASP Phosphorylierung tritt bei sehr niedrigen NO-Konzentrationen, die Blutplättchen im Blut einen sehr empfindlichen Detektor keine Präsenz machen könnte. VASP hoch in Thrombozyten angegeben, jedoch nicht in anderen Blutkörperchen, wodurch gezielt die Ereignisse im Zusammenhang mit Thrombozyten10folgen.
Das Hauptziel dieses Protokolls soll die Methode im Detail für den Nachweis von keine Freigabe im Vollblut mit seiner Interaktion mit Thrombozyten durch die Überwachung der VASP Phosphorylierung11,12beschreiben. Das beschriebene Verfahren ermöglicht Früherkennung von niedrigen keine Konzentrationen - theoretisch im nanomolaren Bereich macht dieses Protokolls empfindlicher als cGMP Bestimmung, durch die Verwendung von standard-Western-Blot-Techniken, die in die meisten Labor erreichbare Einstellungen.
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Protocol
Hinweis: Blutproben wurden von NIH Blutbank erhalten (IRB Protokoll genehmigt: 99-CC-0168).
(1) Blut Probenaufbereitung
Hinweis: Zur Vermeidung von Thrombozyten Aktivierung Blut langsam und vorsichtig mischen mit Citrat durch das Rohr mehrmals umdrehen.
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Platelet-Rich Plasma (PRP) Vorbereitung
- Ziehen Sie 30 – 50 mL Blut mit einem 20 G oder größeren Durchmesser Nadel und fügen Sie in ein Röhrchen mit Natriumcitrat (3,8 %) in einer 1:9 Ratio oder Acid Citrat Dextrose (ACD) (85 mM Trinatrium Citrat, 66,6 mM Zitronensäure, 111 mM Glukose, pH 4,5) im Verhältnis 1:6.
- Aliquoten 5 mL frisch gesammelten Vollblut in leer 15 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie Vollblut bei 120 X g für 10 min bei Raumtemperatur.
- Sorgfältig sammeln des Überstands enthält die Blutplättchen (Thrombozyten-Reiches Plasma, PRP) aus dem oberen Teil durch eine Kunststoff Transferpipette.
Hinweis: PRP aus Schritt 1.1.3 ist bereit für den Einsatz in Experimente oder für die Weiterverarbeitung vorbereiten gewaschen Thrombozyten. Das weiche Pellet nach Zentrifugation (Schritt 1.1.2) den Erythrozyten und Leukozyten enthält und kann weitere erhalten gereinigt, um gewaschene Erythrozyten (RBC) erhalten – siehe Schritt 1.3. Das Experiment muss fertig innerhalb von 2 Stunden nach der Blutentnahme. Beim Sammeln von PRP (überstand) vermeiden Sie die Sammlung von buffy Coat-haltigen Leukozyten auf der PRP/RBC Oberfläche angesammelt.
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Gewaschene Thrombozyten Vorbereitung (optional)
- Zentrifuge gesammelt PRP bei 400 X g für 10 min bei Raumtemperatur. Den Überstand verwerfen und die Thrombozyten Pellets.
- Waschen Sie vorsichtig die Pellets durch Zugabe von 5 mL CGS Puffer (120 mM NaCl, Trinatrium Citrat und 30 mM Glukose 12,9 mM, pH 6,5) und Zentrifuge bei 400 X g für 10 min bei Raumtemperatur.
- Aufschwemmen der Thrombozyten-Pellets mit 3 mL modifizierte Tyrode-Puffer (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12 mM Nahco33, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM Glukose pH 7.4).
- Verdünnen der Thrombozyten (1: 100 – beispielsweise 10 µL Thrombozyten in 990 µL Rees-Ecker-Lösung) mit Rees Ecker Lösung und Graf von Hemocytometer.
- Passen Sie die Dichte der Thrombozyten, 3 x 108 Zellen/mL durch Zugabe von Tyrode-Puffer.
- Inkubieren Sie die Thrombozytenzahl Aussetzung bei 37 ° C für 1 h vor Beginn des Experiments.
Hinweis: Gewaschene Thrombozyten sind stabil für 5 – 8 h bei 37 ° C.
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Vorbereitung der gewaschenen Erythrozyten (RBC)
- Zentrifugieren Sie nach der Sammlung die weichen Pellet in Schritt 1.1.3 bei 2.500 X g für 10 min bei Raumtemperatur erhalten.
- Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das RBC-Pellet mit 5 mL PBS durch Zentrifugation bei 2.500 X g für 10 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt für 3 Mal.
- Entsorgen der PBS und gewaschene Erythrozyten für weitere Experimente verwenden.
(2) Sauerstoffabspaltung
- Fügen Sie 1 mL der Mischung von PRP (erstellt in Schritt 1.1.4. oder 1.2.4.) und Erythrozyten (vorbereitet in Schritt 1.3.) auf die gewünschte Hämatokrit in eine Polypropylen-Flasche mit einem Gummistopfen verschlossen. Zum Beispiel bei 20 % Hämatokrit fügen Sie 200 µL der Erythrozyten 800 µL PRP hinzu.
Hinweis: Vorgeschlagenen Hämatokritwerte von 0 % bis zu 40 %. Verwenden Sie keine Glasflasche oder Kolben, da Thrombozyten Glasoberfläche einhalten. - Stechen Sie die Nadel mit Helium-Gas-Tank in der geschlossenen Flasche verbunden und machen Sie den Gasaustritt durch eine 26 G Nadel (Abbildung 1).
- Langsam schwenken die Flasche bei Raumtemperatur.
Hinweis: Lassen Sie sich nicht He Gas durch Blut Vorbereitung Blasen wirft. Langsam Gas Flow ist für dieses Verfahren vorzuziehen, und übermäßig schnell He Gasstrom führt zu erhöhte Hämolyse. Der effizienteste Gasstrom muss durch Versuch, bestimmt werden, da es stark von der Geometrie des experimentellen Aufbaus abhängt. - In regelmäßigen Abständen folgen Sie Sauerstoffabspaltung Prozess durch die Messung des partiellen Sauerstoffdruck (pO-2) mit einem Co Oximeter.
Hinweis: In unseren Händen 10 min Sauerstoffabspaltung sinkt pO2 bis 25 MmHg ist erforderlich für Nitrit Abbau von Erythrozyten. Fortsetzung Sauerstoffabspaltung weiter pO2 um 10 MmHg reduzieren; Es führte jedoch zu erhöhten Hämolyse und eine Erhöhung der zellfreien Hämoglobin (Abbildung 2).
3. rote Blutzelle-Nitrit Reduktion
- Fügen Sie 1 mL PBS (pH 7,4) in 0,0345 g NaNO2 500 mM Stammlösung von Nitrit zu machen. Verdünnen Sie 500 mM NaNO2 bis 250 µM NaNO2 (25 X) durch serielle Verdünnung mit PBS-Puffer (pH 7,4).
- Mit einem Microsyringe, injizieren Sie Nitrit (40 µL) durch das Septum in die sauerstoffarmes Stichprobe von PRP und Erythrozyten Endkonzentrationen von 10 µM in insgesamt 1 mL der Probe zu erreichen.
Hinweis: In diesem Experiment ist die Endkonzentrationen von Nitrit verwendet 10 µM. - Inkubation der Probe bei 37 ° C für 10 Minuten oder länger.
Hinweis: Stellen Sie die genaue Dauer der RBC Inkubation mit Nitrit für maximale Nitrit Ermäßigung für verschiedene Arten von Experimenten benötigt. - Entfernen Sie stopfen und Pipette 1 mL der Probe zu einem Microcentrifuge Schlauch.
- Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 3 min bei Raumtemperatur.
- Pipette 300 µL der Thrombozytenzahl Aussetzung aus dem oberen Teil des Überstands und mischen mit ACD (pH 6,5) im Verhältnis 1:9. Entsorgen Sie das RBC-Pellet.
- Zentrifugieren Sie die Thrombozytenzahl Aussetzung bei 500 X g für 4 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 80 µL eiskalte Lyse Puffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5 % NP-40, pH 7.4) mit Protease-Inhibitor cocktail III (1: 500), die Thrombozyten pellets.
4. westliche Beflecken von VASP
- Laden Sie 15 µg des Proteins von jeder Probe in 2 separaten 10 % SDS-PAGE Gelen.
Hinweis: Rauen abstreifenden Puffer, die b-Mercaptoethanol enthält, kann nicht P-VASPSer239 und VASP Antikörper aus der Membran entfernt werden; P-VASP Ser239 und VASP sollten daher separat ausgeführt werden. - Führen Sie die Gele bei 120 V für 1,30 h und Übertragung der Nitrozellulose-Membran.
- Block unspezifische Bindung mit 5 % fettfreie Trockenmilch.
- Inkubieren Sie die Membran mit P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1 000) und GAPDH (1:1 000) für eine Nacht bei 4 ° c
- Inkubieren Sie Meerrettich-Peroxidase (HRP) sekundäre Antikörper mit der Membran für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
- Setzen Sie die Membran mit einer Imager-Maschine und Quantifizierung der Band-Dichte mit ImageJ.
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Representative Results
Venöse Blutproben haben pO2 Werte zwischen 50-80 MmHg. Sauerstoffabspaltung durch Helium sinkt rasch pO2 bis 25 MmHg innerhalb von 10 min. erhöhte Sauerstoffabspaltung mal etwas weiter sinkt pO2. Erhöhte Zeit Sauerstoffabspaltung führt jedoch auch zu deutlich erhöhten Werten von zellfreien Hämoglobin (bestimmt durch Co Oximeter, visuell auf Abbildung 2 als zunehmend rote Färbung des Plasma gesehen) (Abbildung 2A-B). Erhöhte Hämolyse ist nicht rühren, weil rühren ohne Sauerstoffabspaltung nicht dazu, Hämolyse (Abbildung 2 veranlassen) zugeordnet.
Wir fanden, dass das Vorhandensein von RBCs in lysierten Proben verringert sich P-VASPSer239 und VASP erkannt durch Western Blot (Abbildung 3). Daher trennen wir zuerst Thrombozyten und Erythrozyten vor dem Ausführen von Western Blots um P-VASPSer239 in Thrombozyten zu erkennen.
Um zu zeigen, dass es genügend Zeit, Erythrozyten aus Blutplättchen zu trennen, ohne VASP Phosphorylierung, verwendeten wir eine kurzlebige kein Spender. PROLI NONOate (kein Spender mit Halbwertszeit von 1,8 s bei 37 C pH 7.4), rasch erhöhte P-VASPSer239 in Thrombozyten (innerhalb von 10 s der Inkubation). P-VASPSer239 induziert durch PROLI NONOate detektiert für 10 min nach der Inkubation mit PRP (Abbildung 4).
Nitrit erhöht P-VASPSer239 in Thrombozyten im Beisein von sauerstoffarmes Erythrozyten (pO2 25 MmHg). Nitrit-Reduktase-Aktivität der sauerstoffarmes Erythrozyten, Hämatokrit hängt und die maximale Wirkung wird bei 20 % Hämatokrit (Abbildung 5) beobachtet.
Abbildung 1: Sauerstoffabspaltung Kammer. Mischung von PRP und Erythrozyten ergänzt, in einer Plastikflasche mit einem Gummiseptum verschlossen. Die geschlossene Flasche ist mit Helium (He) Linie mit Hilfe einer Nadel verbunden. Sauerstoff wird durch eine kleine Spritzennadel (26 G) dient als ein Gasaustritt ausgespült.
Abbildung 2: Partielle Sauerstoffdruck (pO-2) und zellfreie Hämoglobin nach Sauerstoffabspaltung. (A) PRP und Erythrozyten Proben wurden desoxygeniert für 3, 5, 10, 15, 30 und 50 min. pO2 Proben von Blut-Gas-Analysator gemessen wurden (n = 3). Fehlerbalken sind SEM Vertreter Bilder Überstand der PRP + Erythrozyten Proben mit (B) gerührt oder ohne Helium (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Vertreter VASP Western Blot Bands in Proben von PRP/Erythrozyten an verschiedenen Hämatokrit vorbereitet. Erythrozyten wurden in PRP hinzugefügt, um 1, 5, 10, 15, 20, 40 % Hämatokrit. Mischungen von PRP + Erythrozyten wurden 500 X g für 5 min zentrifugiert und lysiert mit Lyse Puffer.
Abbildung 4: Vertreter Western Blot Bands von P-VASPSer239 und VASP in PRP nach Exposition gegenüber kein Spender PROLI NONOate. PROLI NONOate (10 M) wurde in PRP hinzugefügt und bei 37 ° C für 10 bis 30 s und 1, 2, 5, 10, 20 und 40 min inkubiert.
Abbildung 5: VASPSer239 Phosphorylierung hängt pO2 und Hämatokrit. (A) PRP + Erythrozyten (20 % Hämatokrit) wurden zwei verschiedene pO2 Ebenen, desoxygeniert 40 und 25 MmHg. P-VASPSer239 und VASP wurden nach der Inkubation sauerstoffarmes Proben mit 10 M Nitrit bei 37 C für 10 min. (B) gemessen Nitrit (10 M) wurde in sauerstoffarmes PRP + Erythrozyten bei 0, 10, 20 und 40 % Hämatokrit hinzugefügt (pO2 = 25 MmHg). Fache erhöht (P-VASPSer239) wurde relativ zum Steuerelement (PRP + Erythrozyten ohne Nitrit) für jeden Hämatokrit-Wert berechnet. Fehlerbalken = SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Da Thrombozyten leicht aktiviert werden, schonendes Handling von Thrombozyten-haltigen Proben erforderlich ist. Schnellen pipettieren und kräftig schütteln sollte vermieden werden. Thrombozyten-Hemmer wie Prostazyklin (PGI2) können verwendet werden, um Thrombozyten Aktivierung zu verhindern; Dies kann jedoch einige Signalwege innerhalb der Blutplättchen beeinflussen. Für die Vorbereitung von Thrombozyten Pellets wir die Thrombozyten-Suspensionen ACD hinzufügen und langsamem Zentrifugation verwenden.
Frisch zubereitete Thrombozyten in PRP haben eine begrenzte Lebensdauer, span, bis zu 2 h. Um hohe Reproduzierbarkeit zu erreichen, sollten alle Versuche nur mit frischen Thrombozyten und innerhalb von 2 Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt werden. Die dargestellten Daten stammen mit Thrombozyten in PRP, physiologischer als gewaschene Thrombozyten gilt. Obwohl die Lebensdauer und Reinheit für gewaschene Thrombozyten erhöhen, wiederholte Zentrifugation bei Vorbereitung der gewaschenen Thrombozyten kann zu deren spontane Aktivierung führen und dadurch kann inkonsistente Qualität der Thrombozyten Vorbereitungen. PRP ist über gewaschenen Thrombozyten bevorzugt, da das Verfahren schneller ist und weiteren Bearbeitung konnte Thrombozyten aktiviert. Wenn die Einmischung der Plasma Blutgerinnungsfaktoren Versuchsaufbau, stören könnten stellt jedoch in bestimmten Fällen waschen Thrombozyten Lösung für diese Probleme zu vermeiden.
Sauerstoff-Kontamination in sauerstoffarmes Proben ist der wichtigste kritische Schritt für diese Probe. Erythrozyten können gebündelt und desoxygeniert bevor Sie die PRP hinzugefügt. Übertragung von sauerstoffarmes Erythrozyten erhöht jedoch das Risiko einer Kontamination der Sauerstoff. Darüber hinaus Sauerstoffabspaltung konzentrierte RBCs erfordert mehr Zeit als Sauerstoffabspaltung die volle Vorbereitung auf die gewünschte Hämatokrit und längerer Exposition gegenüber He Gas führt zu erhöhten Werten von zellfreien Hämoglobin. Obwohl zellfreie Hämoglobin aus sauerstoffarmes RBCs gewaschen werden kann, müssen die Phosphat-Puffer Kochsalzlösung oder anderen Puffer zum Waschen verwendet sorgfältig sauerstoffarmes, Sauerstoff Kontamination während der Zentrifugation zu verhindern sein. Zu verkürzen den Vorbereitungsprozess und vermeiden unnötige Sauerstoff Verunreinigung, war jeder PRP + Erythrozyten Probe zuerst auf die gewünschte Hämatokrit vorbereitet und dann desoxygeniert vor der Zugabe von Nitrit.
Quantifizierung des P-VASPSer239 von Western-Blot, müssen Erythrozyten aus den Thrombozyten getrennt werden. VASP drückt sich in Erythrozyten13, aber die Levels sind unwichtigen im Vergleich zu Hämoglobin und viel niedriger als in Thrombozyten. Da insgesamt Proteinkonzentration zum Laden von Steuerelementen in der Western Blots dient, stört das Vorhandensein von RBCs in lysate Proben mit P-VASP VASP Messung durch westliche Beflecken. Aufgrund einer langsamen Rate des Dephosphorylation durch Phosphatase Enzyme in Thrombozyten14P-VASP wird für 10 min (Abbildung 4) getragen und daher ist es möglich, durch Zentrifugation vor der Erhebung Plättchen Zelle Lysates RBCs trennen.
Die EG50 für VASP Phosphorylierung ist fast eine Größenordnung niedriger als die EG-50 für den Gipfel cGMP erhöhen, 0,5 nM und 9 nM, bzw.3, wodurch VASP Phosphorylierung eines der empfindlichsten Methoden zum Nachweis von geringe Mengen an Nr. Allerdings ist die VASP Phosphorylierung Kurve in Antwort auf NO glockenförmig; eine Phosphorylierung Abnahme ist nach dem Höchststand von 3-30 nM3beobachtet. Diese nichtlinearen Reaktion auf steigenden keine Konzentrationen macht VASP ungeeignet für strenge keine Quantifizierung.
Da Thrombozyten in PRP eine kurze Lebensdauer haben, muss der Test in frischen Thrombozyten innerhalb von 2 h nach Blutentnahme durchgeführt werden. Die Widersprüchlichkeit der pO2 Ebenen nach der Sauerstoffabspaltung gefunden werden kann, da die Sauerstoffabspaltung Proben die Durchflussmenge von Helium-Gas und Geschwindigkeit der wirbelnden der Flaschenhals abhängig ist. Daher muss die Zeit für Sauerstoffabspaltung durch Versuch ermittelt werden. Für die Messung von P-VASP durch Western Blot die Antikörper-Wahl ist von entscheidender Bedeutung, und man braucht, um einer direkte kein Spender als Positivkontrolle verwenden, um die Spezifität zu überprüfen. Neben Nein, P-VASPSer239 in Thrombozyten können durch die Hemmung der Phosphodiesterease Enzyme und die Aktivierung der Proteinkinase einen Weg phosphoryliert werden.
Die Messung der P-VASPSer239 hat einige Vorteile gegenüber cGMP-Assay. cGMP in Thrombozyten hat eine sehr kurze Halbwertszeit (weniger als 10 s) und die Messung von cGMP erfordert die Zugabe von Phosphodiesterase-Hemmer3. Die cGMP-Messung verwendet außerdem eine ziemlich teuer ELISA-Technik. VASP gemessen werden einfach durch einen hauseigenen Western-Blot-Protokoll und ist daher leichter verfügbar.
Erhöhte P-VASPSer239 in Thrombozyten wurde erfolgreich als Sensor für keine Generation von inhalativen Nitrit in Vivo6verwendet. Daher haben wir gezeigt, dass es möglich ist, P-VASPSer239 in Thrombozyten als Marker keine Generation in vitro und in vivo im Blut und möglicherweise auch in verschiedenen anderen Situationen zu verwenden. Die ungewöhnlich niedrigen EC50 stellt diese Methode einen ausgezeichneten Kandidat für die Erkennung der Anwesenheit von sehr niedrigen keine Konzentrationen im Blut. Dieses Protokoll bietet daher, eine Möglichkeit zu studieren keine Generation im Blut auf verschiedene physiologische Reize, wie z. B. während Blut Koagulation Kaskade, erhöhte Belastung durch schiere oder Entzündungen erhöht.
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Disclosures
Dr. Alan Schechter notiert als Coerfinder auf mehrere Patente erteilt, die National Institutes of Health für die Verwendung von Nitrit Salze zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Krankheiten. Er erhält Lizenzgebühren basierend auf NIH Lizenzen für diese Patente für die klinische Entwicklung aber keine andere Entschädigung.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Intramurale, Dr. Alan N. Schechter NIH finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2-; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
