Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Trombocyt-baseret detektion af nitrogenoxid i blodet ved at måle VASP fosforylering

doi: 10.3791/58647 Published: January 7, 2019

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at løse den potentielle anvendelse af blodplader som en yderst følsom oxid sensor i blodet. Det beskriver indledende trombocyt udarbejdelse og anvendelse af nitrit og deoxygenated røde blodlegemer som nitrogenoxid generatorer.

Abstract

Blodplader er de ansvarlig for korrekt blodpropper blodkomponenter. Deres funktion er stærkt reguleret af forskellige veje. En af de mest potente vasoaktive agenter, nitrogenoxid (NO), kan også fungere som en kraftig hæmmer af trombocytaggregation. Direkte er ingen opdagelse i blodet meget udfordrende på grund af sin høje reaktivitet med celle-frit hæmoglobin, der begrænser ikke half-life til rækken millisekund. I øjeblikket, baseret ingen ændringer efter interventioner skønnes kun på målte ændringer af nitrit og nitrat (medlemmer af nitrat-nitrit-ingen stofskiftevej). Men præcis, disse målinger er temmelig vanskeligt at fortolke vis en vis faktiske uden ændringer, på grund af den naturligt høje baseline nitrit og nitrat niveauer, der er flere størrelsesordener højere end forventede ændringer af nogen selv. Derfor, udvikling af direkte og enkle metoder, der gør det muligt at påvise NO direkte er længst. Denne protokol adresser en potentiel anvendelse af blodplader som en yderst følsom ingen sensor i blodet. Det beskriver indledende trombocyt rige plasma (PRP) og vasket trombocyt præparater og anvendelse af nitrit og deoxygenated røde blodlegemer som ingen generatorer. Fosforylering af VASP på Serin 239 (P-VASPSer239) bruges til at påvise tilstedeværelsen af nr. Det faktum at VASP protein er stærkt udtrykt i blodplader og at det hurtigt er fosforyleret når ingen er til stede fører til en enestående mulighed for at bruge denne sti til direkte ingen paavisning i blodet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Blodplader er lille disk-formet celle fragmenter stammer fra megakaryocytes, der er afgørende for blodpropper. Den blodpropper kaskade er initieret af forskellige bioaktive molekyler (såsom kollagen eller ADP), udgivet efter skade af vaskulære væg. De blodet til at størkne proces kan ændres blandt forskellige effektorer af nitrogenoxid (NO). Nej, naturligt produceret af pattedyrceller, er en af de mest alsidige fysiologiske signaler. Det fungerer som en potent vasodilatator, neurotransmitter og immun modulator, at nævne et par af dens mange funktioner. I blodbanen, ikke også hjælper med at regulere omfanget af blodpropper ved at hæmme trombocytaggregation. En af de mest sandsynlige kilder til Nej i blodbanen er nitrit, en uorganisk ion, der har vist sig at fungere som en forløber for nr. Reagerer med røde blodlegemer (RBC), nitrit er reduceret til Nej og deoxyHb oxideres til methemoglobin (metHb)1. INGEN frigivet fra røde blodlegemer er vasoaktive og forårsager vasorelaxation2. Denne nitrit reduktion pathway er suppleant ingen generation pathway, handler sammen med og supplere den klassiske ingen generation sti af endotelial nitrogenoxid syntase på hypoksiske betingelser.

Blodplader, selv er ikke i stand til at reducere nitrit i nr men er meget følsomme over for sin tilstedeværelse. I intakt blodplader, ikke i nanomolar vifte øger cGMP (EF50 = 10 nM) og fosforylering af VASP (EF50 = 0,5 nM)3. Derfor, blodplader kan tjene som en fremragende sensor af nitrit reduktion af røde blodlegemer og ingen overgang til blodet. Der er flere metoder, som direkte kan måle omfanget af trombocyt aktivering - såsom aggregometry og thromboelastography (TEG)4,5. Disse metoder kræver dog dyre specialiserede instrumentering og temmelig store mængder af materiale. Det er også muligt at overvåge hændelser downstream, efter nej er frigivet fra RBC, ved hjælp af ændringerne i trombocyttal overflade protein udtryk – såsom P-selectin6. IKKE er også kendt for at øge mængden af cGMP i blodplader7. Tidligere brugte vi cGMP at overvåge ingen overgang til blod efter nitrit reduktion af deoxygenated RBC8. Dette viste sig for at være en meget følsom metode; men cGMP er en kortvarig molekyle og dens afsløring indebærer omfattende arbejdskraft. En anden mulighed, beskrevet i præsenteres protokollen bruger fosforylering af vasodilator-stimuleret phospho (VASP)-protein til at påvise tilstedeværelsen af NO i blodet. VASP er et substrat af protein kinase G aktivisering, hvilke er fosforyleret på samspillet med NO gennem sGC/cGMP vej9. Påviselige VASP fosforylering sker ved meget lav NO koncentrationer, som kunne gøre blodplader en meget følsomme detektor ingen tilstedeværelse i blodet. VASP er stærkt udtrykt i blodplader, men ikke i andre celler, som giver mulighed for at følge selektivt de begivenheder, der involverer blodplader10.

Hovedformålet med denne protokol er at beskrive metoden i detaljer til påvisning af ingen udgivelse i fuldblod med sin interaktion med trombocytter ved overvågning VASP fosforylering11,12. Den beskrevne metode giver tidlig påvisning af lav ingen koncentrationer - teoretisk i nanomolar rækkevidde, hvilket gør denne protokol mere følsomme end cGMP bestemmelse, som følge af brugen af standard vestlige skamplet teknikker opnåeligt i de fleste laboratorium indstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bemærk: Blodprøver blev indhentet fra NIH blodbank (IRB godkendt protokollen: 99-CC-0168).

1. blod prøve forberedelse

Bemærk: For at undgå trombocyt aktivering, udgyde blod langsomt og blandes forsigtigt med citrat ved at vende røret flere gange.

  1. Trombocyt-rich plasma (PRP) forberedelse
    1. Tegne 30-50 mL blod ved hjælp af en 20 G eller større diameter nål og tilføje ind i et rør, der indeholder natrium citrat (3,8%) i en 1:9 forholdet eller citrat syre dextrose (ACD) (85 mM Trinatriumcitrat, 66.6 mM citronsyre, 111 mM glucose, pH 4,5) i forholdet 1:6.
    2. Alikvot 5 mL frisk indsamlede fuldblod i tomme 15 mL konisk rør. Der centrifugeres fuldblod på 120 x g i 10 min. ved stuetemperatur.
    3. Omhyggeligt indsamle supernatanten indeholdende trombocytter (blodplader-rich plasma, PRP) fra den øvre del af plast overførsel pipette.
      Bemærk: PRP fra trin 1.1.3 er klar til brug i eksperimenter eller til videre forarbejdning at forberede vasket blodplader. Den bløde pellet fremstillet efter centrifugering (trin 1.1.2) indeholder røde blodlegemer og hvide blodlegemer og kan være yderligere renset for at få vasket røde blodlegemer (RBC) — Se trin 1.3. Eksperimentet skal være færdige inden for 2 h efter tegning blod. Når du indsamler PRP (supernatanten), undgå indsamling af buffy coat-holdige leukocytter akkumuleret på grænsefladen PRP/RBC.
  2. Vasket trombocyt forberedelse (valgfri)
    1. Centrifuge indsamlet PRP ved 400 x g i 10 min. ved stuetemperatur. Supernatanten og holde trombocyt pellets.
    2. Forsigtigt vaske piller ved tilsætning af 5 mL af CGS buffer (120 mM NaCl, 12.9 mM trinatrium citrat og 30 mM glucose, pH 6,5), og der centrifugeres ved 400 x g i 10 min. ved stuetemperatur.
    3. Resuspend trombocyt pellets med 3 mL af modificerede Tyrode buffer (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glukose pH 7,4).
    4. Fortynd blodpladerne (1: 100 — som eksempel, 10 µL trombocytter i 990 µL af Rees-Ecker løsning) med Rees Ecker løsning og Greven af hemocytometer.
    5. Juster tætheden af blodplader til 3 x 108 celler/mL ved at tilføje Tyrode buffer.
    6. Inkuber trombocyt suspension ved 37 ° C i 1 time før du starter eksperimentet.
      Bemærk: Vasket blodplader er stabil i 5-8 timer ved 37 ° C.
  3. Forberedelse af vaskede røde blodlegemer (RBC)
    1. Efter samlingen, centrifugeres den bløde pellet fremstillet i trin 1.1.3 på 2.500 x g i 10 min. ved stuetemperatur.
    2. Supernatanten og vaske RBC pellet med 5 mL PBS ved centrifugering ved 2500 x g i 10 min. ved stuetemperatur. Gentag dette trin for 3 gange.
    3. Kassér PBS og brug vasket røde blodlegemer for yderligere eksperimenter.

2. deoxygenation

  1. Der tilsættes 1 mL af blandingen af PRP (forberedt i trin 1.1.4. eller 1.2.4.) og røde blodlegemer (udarbejdet i trin 1.3.) på den ønskede hæmatokrit i en polypropylen flasken lukkes med en gummiprop. For eksempel, på 20% hæmatokrit, tilføje 200 µL af røde blodlegemer til 800 µL af PRP.
    Bemærk: Foreslåede hematocrits er fra 0% op til 40%. Brug ikke en glasflaske eller kolbe, som blodplader overholde glasoverfladen.
  2. Indsætte nålen tilsluttet helium gastank i den lukkede flaske og gøre gas outlet ved at indsætte en 26 G kanyle (figur 1).
  3. Langsomt swirl flaske ved stuetemperatur.
    Bemærk: Tillad ikke han gas til boble gennem blod forberedelse. Langsom gasflow er at foretrække for denne procedure, og alt for hurtigt han gasflow fører til øget hæmolyse. Den mest effektive gasflow skal bestemmes ved forsøg, da det stærkt afhænger af opsætningen af eksperimenterende geometri.
  4. Regelmæssigt Følg deoxygenation processen ved at måle den delvise ilt pres (pO2) ved hjælp af en fælles oximeter.
    Bemærk: I vores hænder, 10 min af deoxygenation falder pO2 til 25 mmHg, hvilket er nødvendigt for nitrit reduktion af røde blodlegemer. fortsat deoxygenation yderligere reducere pO2 til 10 mmHg; men det førte til øget hæmolyse og stigninger i celle-frit hæmoglobin (figur 2).

3. rød blod celle nitrit reduktion

  1. Der tilsættes 1 mL PBS (pH 7,4) i 0.0345 g af NaNO2 at gøre 500 mM stamopløsning af nitrit. Fortynd 500 mM NaNO2 til 250 µM NaNO2 (25 x) ved seriel fortynding i PBS (pH 7,4).
  2. Ved hjælp af mikrosprøjte indsprøjtes nitrit (40 µL) gennem septum i deoxygenated prøven af PRP og røde blodlegemer til at opnå endelige koncentrationer af 10 µM i total 1 mL af prøven.
    Bemærk: I dette eksperiment er de endelige koncentrationen af nitrit bruges 10 µM.
  3. Inkuber prøve ved 37 ° C i 10 minutter eller længere.
    Bemærk: Justere den nøjagtige varighed af RBC inkubation med nitrit behov for maksimal nitrit reduktion til forskellige slags eksperimenter.
  4. Fjern proppen og afpipetteres 1 mL af prøven i et microcentrifuge rør.
  5. Der centrifugeres ved 200 x g i 3 min ved stuetemperatur.
  6. Tilsæt 300 µL af trombocyt suspension fra den øverste del af supernatanten og bland med ACD (pH 6,5) i forholdet 1:9. Kassér RBC pellet.
  7. Der centrifugeres trombocyt suspension ved 500 x g i 4 min ved stuetemperatur.
  8. Tilsættes 80 µL af iskold lysisbuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7,4) indeholdende protease hæmmer cocktail III (1: 500) til trombocyt pellets.

4. Western Blotting af VASP

  1. Indlæse 15 µg af protein fra hver prøve til 2 separate 10% SDS-PAGE geler.
    Bemærk: Barske stripping buffer, som indeholder b-mercaptoethanol, kan ikke fjerne P-VASPSer239 og VASP antistoffer fra membran; Derfor, P-VASP Ser239 og VASP skal køres separat.
  2. Kør geler på 120 V på 1,30 h og overførsel til nitrocellulose membran.
  3. Blokere ikke-specifik binding med 5% fedtfrit tørt mælk.
  4. Inkuber membran med P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000) og GAPDH (1:1, 000) for natten over ved 4 ° C.
  5. Inkuber peberrod peberrodsperoxidase (HRP) sekundær antistof med membran for 45 min ved stuetemperatur.
  6. Udsætte membranen med en imager maskine og kvantificere band tæthed ved hjælp af ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Venøse blodprøver har pO2 værdier mellem 50-80 mmHg. Deoxygenation af helium aftager hurtigt pO2 til 25 mmHg inden for 10 min. øget deoxygenation tid lidt længere falder pO2. Men øget tid af deoxygenation også fører til betydeligt øgede niveauer af celle-frit hæmoglobin (bestemmes af co Oximeter, visuelt ses på figur 2 som i stigende grad rød farvning af plasma) (Figur 2A-B). Øget hæmolyse er ikke knyttet til omrøring fordi omrøring uden deoxygenation ikke fremkalde hæmolyse (figur 2 c).

Vi fandt, at tilstedeværelsen af røde blodlegemer i mængden prøver nedsætter P-VASPSer239 og VASP opdaget ved Western blotting (figur 3). Derfor, vi først skille blodplader og røde blodlegemer før du kører Western blotting for at finde P-VASPSer239 blodplader.

For at vise, at der er tid nok til at adskille røde blodlegemer ud af blodplader uden at påvirke VASP fosforylering, brugte vi en kortvarig ingen donor. PROLI NONOate (ingen donor med halveringstid på 1,8 s ved 37 C pH 7,4), hurtigt øget P-VASPSer239 i blodplader (inden for 10 s inkubation). P-VASPSer239 induceret af PROLI NONOate er fundet i 10 min efter inkubation med PRP (figur 4).

Nitrit øger P-VASPSer239 i blodplader i overværelse af deoxygenated røde blodlegemer (pO2 25 mmHg). Nitrit-reduktase aktivitet af deoxygenated RBC afhænger hæmatokrit og den maksimale effekt er observeret på 20% hæmatokrit (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Deoxygenation kammer. Blanding af PRP og røde blodlegemer er tilføjet i en plastflaske, lukket med en gummi septum. Den lukkede flaske er tilsluttet helium (He) linje ved hjælp af en nål. Ilt er skyllet ud af en lille sprøjte nål (26 G) tjener som en gas outlet.

Figure 2
Figur 2: Delvis ilt pres (pO2) og celle-frit hæmoglobin efter deoxygenation. (A) PRP og røde blodlegemer prøver var deoxygenated for 3, 5, 10, 15, 30 og 50 min. pO2 prøver blev målt ved blod gas analyzer (n = 3). Fejllinjer er SEM. repræsentant billeder af supernatanten af PRP + RBC prøver rørte med (B) eller uden helium (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant VASP Western skamplet bands i prøver af PRP/røde blodlegemer forberedt på forskellige hæmatokrit. Røde blodlegemer blev føjet til PRP til 1, 5, 10, 15, 20, 40% hæmatokrit. Blandinger af PRP + røde blodlegemer var centrifugeres 500 x g i 5 min og mængden med lysisbuffer.

Figure 4
Figur 4: repræsentant Western skamplet bands af P-VASPSer239 og VASP i PRP efter udsættelse for ingen donor PROLI NONOate. PROLI NONOate (10 M) blev tilføjet i PRP og inkuberes ved 37 ° C i 10 og 30 s og 1, 2, 5, 10, 20 og 40 min.

Figure 5
Figur 5: VASPSer239 fosforylering afhænger pO2 og hæmatokritværdi niveauer. (A) PRP + røde blodlegemer (20% hæmatokrit) var deoxygenated til to forskellige pO2 niveauer, 40 og 25 mmHg. P-VASPSer239 og VASP blev målt efter inkubation af deoxygenated prøver med 10 M nitrit ved 37 C i 10 min. (B) nitrit (10 M) blev tilføjet i deoxygenated PRP + røde blodlegemer på 0, 10, 20 og 40% hæmatokrit (pO2 = 25 mmHg). Fold øget (P-VASPSer239) blev beregnet i forhold til kontrol (PRP + RBC uden nitrit) for hver hæmatokrit værdi. Fejllinjer = SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Da blodplader nemt aktiveres, skånsom håndtering af trombocyt-holdige prøver er påkrævet. Hurtig pipettering og livlig ryste bør undgås. Trombocyttal hæmmere såsom prostacyclin (BGB2) kan bruges til at forhindre trombocyt aktivering; men dette kan påvirke nogle signaling veje inde blodpladerne. Forberedelse af trombocyt pellets, vi tilføje ACD til trombocyt suspensioner og bruge centrifugering.

Frisklavet blodplader i PRP har en begrænset levetid, levetid, op til 2 h. For at opnå høj reproducerbarhed, skal alle eksperimenter gøres kun med friske blodplader og inden for 2 h efter blod samling. De præsenterede data blev indhentet med blodplader i PRP, som anses for mere fysiologisk end vasket blodplader. Selvom levetid og renhed øger for vasket blodplader, gentagne centrifugering under forberedelse af vasket blodplader kan føre til deres spontane aktivering og dette kan medføre inkonsekvente kvaliteten af trombocyt præparater. PRP foretrækkes frem for vasket blodplader, da proceduren er hurtigere og yderligere håndtering kunne aktivere blodplader. Dog i særlige tilfælde repræsenterer når indblanding af plasma blod koagulationsfaktorer kunne blande sig med eksperimentel opsætning, vask blodplader løsning til at undgå disse problemer.

Ilt forurening i deoxygenated prøver er den vigtigste afgørende skridt til dette assay. Røde blodlegemer kan være samlet og deoxygenated før den føjes til PRP. Dog øger overføre deoxygenated RBC risikoen for oxygen forurening. Derudover deoxygenation af koncentreret RBC kræver mere tid end deoxygenation i fuld forberedelse på den ønskede hæmatokrit, og længere eksponering for han gas fører til øget niveauer af celle-frit hæmoglobin. Selv om celle-frit hæmoglobin kan vaskes ud af deoxygenated RBC, skal fosfat buffer saltvand eller andre buffere anvendes til vask være omhyggeligt deoxygenated at forebygge ilt kontamineres under centrifugeringen. For at forkorte forberedelsesprocessen og undgå unødvendige ilt forurening, hver PRP + RBC prøve blev udarbejdet på den ønskede hæmatokrit først og derefter deoxygenated før tilsætning af nitrit.

For at kvantificere P-VASPSer239 af vestlige skamplet, skal RBC adskilles af trombocytterne. VASP er udtrykt i røde blodlegemer13, men niveauerne er ubetydelige i forhold til hæmoglobin og meget lavere end i blodplader. Da samlede proteinkoncentration bruges til indlæsning af kontrolelementer i de Western blotting, interfererer tilstedeværelsen af røde blodlegemer i lysate prøver med P-VASP og VASP måling af Western blotting. På grund af en langsom dephosphorylation af fosfatase enzymer i blodplader14, P-VASP fastholdes for 10 min (figur 4) og det er derfor muligt at adskille røde blodlegemer ved centrifugering før indsamling trombocyt cellelysater.

EF50 for VASP fosforylering er næsten en størrelsesorden lavere end EF-50 i peak cGMP Øg, 0,5 nM og 9 nM, henholdsvis3, hvilket gør VASP fosforylering, en af de mest følsomme metoder til at påvise tilstedeværelsen af lavt beløb af nr. Men VASP fosforylering kurve i svar til Nej er klokkeformet; en fosforylering fald er observeret efter at være toppet på 3-30 nM af3. Denne ikke-lineære svar på stigende ingen koncentrationer gør VASP uegnet til streng ingen kvantificering.

Da blodplader i PRP har en kort levetid, skal analysen gøres i frisk blodplader i 2 h efter tegning blod. Den manglende sammenhæng i pO2 niveauer efter deoxygenation kan findes, da deoxygenation af prøver er afhængig af strømningshastigheden af helium gas og af hvirvlende flasken. Tidspunkt for deoxygenation skal derfor bestemmes ved forsøg. Til måling af P-VASP ved Western blotting antistof valg er afgørende, og man skal bruge en direkte ingen donor som positiv kontrol til at kontrollere specificitet. Ud over NO, P-VASPSer239 i blodplader kan blive fosforyleret af hæmning af phosphodiesterease enzymer og aktivering af protein kinase en vej.

Måling af P-VASPSer239 har nogle fordele i forhold til cGMP assay. cGMP i blodplader har en meget kort halveringstid (mindre end 10 s) og måling af cGMP kræver tilføjelse af phosphodiesterase inhibitor3. Også, cGMP måling bruger en temmelig dyrt ELISA-teknik. VASP simpelthen kan måles ved en in-house vestlige skamplet protokollen og derfor er mere let tilgængelige.

Øget P-VASPSer239 i blodplader blev med succes brugt som en sensor for ingen generation af inhaleret nitrit i vivo6. Derfor viste vi, at det er muligt at bruge P-VASPSer239 i blodplader som markør af ingen generation in vitro- og in vivo i blodet og eventuelt i forskellige andre situationer. Det usædvanligt lave EF50 gør denne metode en fremragende kandidat til påvisning af tilstedeværelsen af meget lav ingen koncentrationer i blodet. Derfor giver denne protokol mulighed for at studere ingen generation i blodet på forskellige fysiologiske stimuli, såsom under blod koagulationskaskaden, øget lutter stress eller øget inflammation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Alan Schechter er opført som medopfinder på flere patenter udstedt til National Institutes of Health til brug af nitrit salte til behandling af hjerte-kar-sygdomme. Han modtager royalties baseret på NIH licens til disse patenter for klinisk udvikling, men ingen anden kompensation.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af NIH murene tilskud til Dr. Alan N. Schechter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9, (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9, (3), e92435 (2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93, (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7, (1), e30380 (2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273, (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120, (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13, (3), e0193747 (2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370, (3), 184-188 (1995).
Trombocyt-baseret detektion af nitrogenoxid i blodet ved at måle VASP fosforylering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter