Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58647

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לטפל להשתמש הפוטנציאל של טסיות דם כמו חיישן רגיש מאוד תחמוצת החנקן בדם. זה מתאר טסיות הראשונית הכנה ושימוש חנקיתי ו רווית תאי דם אדומים גנרטורים תחמוצת החנקן.

Abstract

הטסיות הן רכיבי הדם אחראי על קרישת הדם תקין. תפקידם הוא מאוד מווסתות על ידי מסלולים שונים. אחד הסוכנים vasoactive הקטלניים ביותר, תחמוצת החנקן (NO), יכול גם לפעול מעכב חזק של הצטברות של טסיות דם. ישיר אין זיהוי בדם הוא מאוד מאתגר עקב שלה תגובתיות גבוהה עם המוגלובין ללא תא המגביל מחצית אין חיים על הטווח אלפיות השנייה. כיום, אין שינויים לאחר התערבויות מוערכות רק בהתבסס על שינויים מדודה של חנקיתי חנקתי (חברים של מסלול מטבולי חנקת-חנקיתי-לא). עם זאת מדויק, מדידות אלה הם די קשה לפרש מול בפועל ללא שינויים, עקב חנקיתי בסיסית גבוהה באופן טבעי טונות רמות שנמצאים במספר סדרי גודל גבוה יותר מאשר שינויים צפויים לא עצמו. לכן, בפיתוח שיטות ישירה ופשוטה שתאפשר אחד לזהות לא ישירות הוא מזמן. פרוטוקול זה מטפל שימוש פוטנציאלי של טסיות כמו רגישות גבוהה לא חיישן בדם. זה מתאר פלזמה עשיר טסיות הראשונית (PRP) ואת ההכנות טסיות שטף את השימוש חנקיתי רווית תאי דם אדומים גנרטורים אין. זירחון של VASP-סרין 239 (P-VASPSer239) משמש כדי לזהות הנוכחות של מס העובדה כי חלבון VASP מתבטאת מאוד טסיות הדם, כי זה הוא במהירות phosphorylated כאשר לא קיים מוביל הזדמנות ייחודית לשימוש מסלול זה ישירות לאתר בו שום נוכחות בדם.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הטסיות הן שברי תאים קטנים בצורת דיסק נגזר megakaryocytes כי הם חיוניים קרישת הדם. המפל קרישת דם הוא שיזם מולקולות ביו שונים (כגון קולגן או ADP), שוחרר לאחר פציעתו של קיר כלי הדם. תהליך קרישת הדם יכול להיות שונה, בין effectors השונים על ידי תחמוצת החנקן (NO). . לא, באופן טבעי המיוצר על ידי תאי יונקים, הוא אחד המגוונים ביותר אותות פיזיולוגיים. היא פועלת vasodilator חזק, מוליך עצבי, אפנן המערכת החיסונית, שם כמה הפונקציות הרבות שלה. בכלי הדם, לא גם מסייע לווסת את היקף קרישת הדם על ידי עיכוב הצטברות של טסיות דם. אחד המקורות סביר ביותר לא במחזור הדם הוא חנקיתי, יון אנאורגניים זה הוכח להוות סימן מקדים של מס מגיבה עם כדוריות דם אדומות (RBCs) חנקיתי מופחתת ללא, deoxyHb תחמוצת methemoglobin (metHb)1. לא שוחררו RBCs הוא vasoactive וגורם vasorelaxation2. מסלול זה הפחתת חנקיתי הוא תוכנית חלופית אין מסלול הדור, מתנהג יחד עם ו משלימים קלאסית אין שביל דור על ידי סינתאז תחמוצת החנקן אנדותל-תנאים ובשפתיים.

טסיות הדם עצמם אינם מסוגלים להפחית חנקיתי לתוך לא אבל רגישים מאוד את נוכחותה. בטסיות תקין, לא ב- nanomolar טווח מגדילה cGMP (EC50 = 10 ננומטר), זירחון של VASP (EC50 = 0.5 ננומטר)3. לכן, טסיות עשויים לשמש חיישן מעולה של הפחתת חנקיתי RBCs, אין שחרור לדם. ישנן מספר שיטות שבהן באפשרותך למדוד ישירות את היקף ההפעלה טסיות - כגון aggregometry ו- thromboelastography (TEG)4,5. עם זאת, שיטות אלה דורשים יקר במכשור מיוחד, כמויות די גדולות של חומר. זה גם אפשרי לעקוב אחר אירועים במורד הזרם, לאחר לא הוא שוחרר מן RBCs, באמצעות השינויים בביטוי חלבונים משטח טסיות – כגון בחירת שמלות P6. לא ידוע גם להגדיל את כמות cGMP ב טסיות הדם7. בעבר, היינו cGMP לפקח אין שחרור לתוך הדם לאחר הפחתה חנקיתי מאת RBC רווית8. זה הוכיח להיות שיטה מאוד רגיש; עם זאת, cGMP הוא מולקולה קצרת ימים, זיהוי שלו כרוכה עבודה נרחב. אפשרות נוספת, שמתואר פרוטוקול שהוצגו, משתמשת זירחון של פוספו מגורה מרחיב כלי דם (VASP)-חלבון כדי לזהות הנוכחות של NO בדם. VASP הוא מצע של הפעלת קינאז גרם חלבון, אשר הוא phosphorylated על האינטראקציה עם לא דרך הסטארגייט/cGMP מסלול9. זרחון VASP לזיהוי מתרחשת ללא נמוך מאוד ריכוזי, שעלולה לגרום טסיות גלאי רגיש מאוד אין נוכחות בדם. VASP מתבטאת מאוד טסיות, אך לא בתאים אחרים בדם, מה שמאפשר לעקוב באופן סלקטיבי את האירועים הקשורים טסיות10.

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת בפירוט עבור זיהוי אין שחרור בדם כל שימוש ביחסיו עם טסיות דם על-ידי ניטור VASP זרחון11,12. השיטה המתוארת מאפשרת גילוי מוקדם של נמוך אין ריכוזים - תיאורטית בטווח nanomolar מה שהופך את הפרוטוקול הנוכחי רגיש יותר נחישות cGMP, עקב השימוש של טכניקות תספיג סטנדרטי השגה במעבדה רוב הגדרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: דגימות דם, התקבלו בנק הדם NIH (IRB אושר פרוטוקול: 99-CC-0168).

1. דם לטעום הכנה

הערה: כדי למנוע הפעלת טסיות דם, דם לאט ומערבבים בעדינות עם ציטראט על-ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים.

  1. טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) הכנה
    1. לצייר 30 – 50 מ"ל של דם באמצעות 20 גרם או מחט בקוטר גדול יותר ולהוסיף לתוך צינור המכילים סודיום ציטרט (3.8%) יחס 1:9 או דקסטרוז ציטראט חומצה (ACD) (ציטראט trisodium 85 מ מ, מ מ 66.6 חומצת לימון, גלוקוז 111 מ מ, pH 4.5) על יחס 1:6.
    2. Aliquot 5 מ של דם טרי שנאספו לתוך צינורות חרוט 15-mL ריק. צנטריפוגה דם מלא ב x 120 g 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. בזהירות לאסוף את תגובת שיקוע המכיל טסיות הדם (טסיות דם עשיר פלזמה, PRP) מן החלק העליון על ידי פיפטה העברת פלסטיק.
      הערה: PRP מהשלב 1.1.3 הוא מוכן לשימוש בניסויים או עיבוד נוסף כדי להכין שטף את טסיות הדם. בגדר רך שהושג לאחר צנטריפוגה (שלב 1.1.2) מכיל כדוריות דם אדומות, כדוריות לבנות, ניתן לטהר כדי לקבל שטף תאי דם אדומים (RBC) — ראה שלב 1.3. הניסוי צריך להסתיים בתוך שעתיים לאחר עד זוב דם. בעת איסוף PRP (supernatant), למנוע את האוסף של לויקוציטים באפי המכילות את המעיל, שנצבר על הממשק PRP/RBC.
  2. טסית דם שטף הכנה (אופציונלי)
    1. צנטריפוגה אסף PRP ב x 400 g 10 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע ולשמור את כדורי טסיות.
    2. יש לשטוף בעדינות את כדורי על-ידי הוספת 5 מ של מאגר הרמטכ ל (120 מ"מ NaCl, גלוקוז ציטראט ו- 30 מ מ trisodium 12.9 מ"מ, pH 6.5), צנטריפוגה ב x 400 g 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. Resuspend כדורי טסיות 3 מ ל Tyrode שונה מאגר (134 מ מ NaCl, 0.34 ממ NaH2PO4, 2.9 מ"מ אשלגן כלורי, 12 מ מ NaHCO3, 20 מ מ. HEPES, מ מ 1 MgCl2, מ מ 2 CaCl2, 10 מ מ גלוקוז pH 7.4).
    4. לדלל טסיות הדם (בטחונות — לדוגמה, 10 µL של טסיות ב 990 µL של ריס-Ecker פתרון) עם פתרון Ecker ריס, מונה על-ידי hemocytometer.
    5. להתאים את הצפיפות של טסיות כדי 3 x 108 תאים למ"ל על-ידי הוספת Tyrode מאגר.
    6. דגירה ההשעיה טסיות ב 37 ° C עבור 1 h לפני תחילת הניסוי.
      הערה: טסיות דם שטף יציבים עבור 5-8 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
  3. הכנה של תאי דם אדומים (RBC) שטף
    1. אחרי האוסף, centrifuge בגדר רך שהושג בשלב 1.1.3 ב x 2,500 g 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר RBC 5 מ ל- PBS, על ידי צנטריפוגה ב x 2,500 g 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה עבור 3 פעמים.
    3. למחוק את PBS ולהשתמש RBCs שטף לניסויים נוספים.

2. deoxygenation

  1. להוסיף 1 מ"ל של התערובת של PRP (מוכן בשלב 1.1.4. או 1.2.4.) ואת RBCs (מוכן ב- 1.3 צעד.)-המטוקריט הרצוי לתוך בקבוק פוליפרופילן סגור עם פקק גומי. לדוגמה, ב- 20% המטוקריט, להוסיף 200 µL של RBCs µL 800 של PRP.
    הערה: הציע hematocrits הם בין 0% עד 40%. אל תשתמש בקבוק זכוכית או הבקבוק כפי טסיות לדבוק משטח זכוכית.
  2. את המחט מחוברת מיכל גז הליום לתוך הבקבוק סגור ולעשות ששקע גז על ידי החדרת מחט 26 G (איור 1).
  3. אט-אט מערבולת מהבקבוק בטמפרטורת החדר.
    הערה: אל תאפשר גז הוא בועה דרך הדם הכנה. זרימת הגז איטי עדיפה עבור הליך זה, ומוביל זרימת הגז הוא מהיר בצורה מוגזמת המוליזה מוגברת. זרימת הגז היעילה ביותר צריך להיקבע על ידי משפט, כמו זה מאוד תלוי הגיאומטריה של ההתקנה ניסיוני.
  4. מעת לעת מבצעים תהליך deoxygenation על ידי מדידת הלחץ חמצן חלקית (pO2) באמצעות oximeter שיתוף.
    הערה: בידיים שלנו, 10 דקות של deoxygenation ירידות פו2 ל- 25 מ מ כספית אשר נדרש עבור הפחתת חנקיתי מאת RBCs. המשך deoxygenation לצמצם עוד יותר את פו2 עד 10 מ מ כספית; עם זאת, זה הוביל המוליזה מוגברת ומגדיל ללא תא המוגלובין (איור 2).

3. תאי הדם האדומים חנקיתי הפחתת

  1. להוסיף 1 מ"ל ל- PBS (pH 7.4) לתוך g 0.0345 של ננו2 להכין תמיסת חנקיתי מניות 500 מ מ. לדלל 500 מ מ NaNO2 250 מיקרומטר NaNO2 (25 x) על ידי דילול סדרתי ב- PBS (pH 7.4).
  2. שימוש של microsyringe, להזריק חנקיתי (40 µL) דרך מחצה לתוך דגימת דם לא מחומצן PRP ו RBCs להשגת ריכוז סופי של 10 מיקרומטר ב סה כ 1 מ של דגימה.
    הערה: בניסוי זה, ריכוזי חנקיתי המשמש הסופי הוא 10 מיקרומטר.
  3. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או יותר.
    הערה: התאמת משך הדגירה RBC המדויק עם חנקיתי לצורך הפחתת חנקיתי מקסימלי עבור סוגים שונים של ניסויים.
  4. הסר את בסימפטומים ולא במחלה עצמה ואת פיפטה 1 מ"ל של המדגם לתוך צינור microcentrifuge.
  5. צנטריפוגה ב x 200 g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. פיפטה µL 300 של ההשעיה טסית דם מן החלק העליון של תגובת שיקוע, מערבבים עם ACD (pH 6.5) יחס של 1:9. להתעלם בגדר RBC.
  7. Centrifuge התליה טסיות ב x 500 g למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. להוסיף µL 80 המאגר הקר פירוק (150 מ מ NaCl, 50 מ מ. טריס, 0.5% NP-40, pH 7.4) המכיל מעכבי פרוטאז גללים קוקטייל השלישי (שבערך) טסיות.

4. סופג המערבי של VASP

  1. לטעון µg 15 של החלבון מן כל מדגם 2 ג'לים מרחביות-דף נפרד של 10%.
    הערה: מאגר הפשטת קשים, אשר מכיל b-mercaptoethanol, לא יכול להסיר נוגדנים P-VASPSer239 ו VASP הקרום; לכן, P-VASP Ser239 ו VASP אמורה לפעול בנפרד.
  2. הפעל את ג'לים-120 V עבור 1.30 h והעברת למוח ניטרוצלולוזה.
  3. בלוק כריכת שאינם ספציפיים עם 5% שומן חלב יבש.
  4. דגירה הקרום עם P-VASPSer239 (שבערך), VASP (1:1, 000), GAPDH (1:1, 000) נלון ב 4 º C.
  5. דגירה חזרת peroxidase (HRP) נוגדנים משניים עם קרום למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לחשוף את הקרום עם מכונת imager ולכמת את צפיפות הלהקה באמצעות ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

דגימות דם ורידי יש פו2 ערכים בין 50-80 מ מ כספית. Deoxygenation על ידי הליום יורדת במהירות פו2 ל- 25 מ מ כספית בתוך 10 דקות הגדילו deoxygenation-זמן פו ובירידות מעט יותר2. עם זאת, זמן מוגברת של deoxygenation גם מוביל רמות גבוהות באופן משמעותי של המוגלובין ללא תא (שנקבע על ידי Oximeter שיתוף, מבחינה ויזואלית לראות על איור 2 מוספים יותר ויותר אדומה פלזמה) (איור 2 א). המוליזה מוגברת אינה משויכת זע כי ערבוב ללא deoxygenation לא לגרום המוליזה (איור 2C).

מצאנו כי הנוכחות של RBCs בדגימות lysed מקטין P-VASPSer239 ו VASP שזוהה על-ידי המערב סופג (איור 3). לכן, אנחנו קודם נפרדות טסיות RBCs לפני הפעלת שהכלים המערבי לאתר P-VASPSer239 טסיות דם.

כדי להראות שאין מספיק זמן כדי להפריד RBCs מחוץ טסיות מבלי להשפיע על זירחון VASP, השתמשנו קצרי מועד לא תורם. PROLI NONOate (לא תורם עם half-life של 1.8 s ב- 37 C pH 7.4), במהירות מוגברת P-VASPSer239 של טסיות הדם (בתוך 10 s של דגירה). P-VASPSer239 המושרה על ידי PROLI NONOate מזוהה במשך 10 דקות לאחר הדגירה עם PRP (איור 4).

חנקיתי מגביר P-VASPSer239 של טסיות הדם בנוכחות RBCs דם לא מחומצן (pO2 25 מ מ כספית). פעילות רדוקטאז חנקיתי RBCs רווית תלוי המטוקריט, האפקט המקסימלי נצפית ב- 20% המטוקריט (איור 5).

Figure 1
איור 1: תא Deoxygenation. תערובת של PRP RBCs נוסף לתוך בקבוק פלסטיק הסקרנית מחצה גומי. הבקבוק סגור מחובר לקו הליום (He) באמצעות מחט. חמצן הוא ריקון על ידי מחט מזרק קטן (26 גרם) הגשה פורקן גז.

Figure 2
איור 2: לחץ החמצן החלקי (pO2) והמוגלובין חופשי תא לאחר deoxygenation. (א) PRP דגימות RBCs היו רווית עבור 3, 5, 10, 15, 30, 50 דקות פו2 דוגמאות של נמדדו על ידי מנתח גז דם (n = 3). קווי שגיאה הן תמונות ב- SEM. נציג של תגובת שיקוע של דגימות PRP + RBCs מעורבב עם (B) או בלי הליום (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: להקות חשופה נציג VASP המערבי בדגימות של PRP/RBCs מוכן במלון המטוקריט שונים. RBCs נוספו לתוך PRP 1, 5, 10, 15, 20, 40% המטוקריט. תערובות PRP + RBCs היו centrifuged ב x 500 g למשך 5 דקות, lysed עם פירוק מאגר.

Figure 4
איור 4: להקות חשופה נציג המערבי של P-VASPSer239 ו VASP ב PRP לאחר חשיפה לא תורם PROLI NONOate. PROLI NONOate (10 מ') הוסיף לתוך PRP, מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 30 s ו- 1, 2, 5, 10, 20 ו- 40 דקות.

Figure 5
איור 5: VASPSer239 זרחון תלוי2 pO ורמות המטוקריט. PRP (A) + RBCs (20% המטוקריט) היו רווית שתי רמות2 pO שונים, 40 ו- 25 מ מ כספית. P-VASPSer239 ו VASP נמדדו לאחר הדגירה של דגימות דם לא מחומצן עם 10 מ' חנקיתי ב 37 C עבור 10 דקות (B) חנקיתי (10 מ') נוספה לתוך רווית PRP + RBCs ב- 0, 10, 20 ו- 40% המטוקריט (pO2 = 25 מ מ כספית). קיפול מוגברת (P-VASPSer239) מחושב באופן יחסי שליטה (PRP + RBCs ללא חנקיתי) עבור כל ערך המטוקריט. קווי שגיאה = ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מאז טסיות מופעלים בקלות, עדין טיפול של טסית דם המכילים דוגמאות נדרש. יש להימנע pipetting מהר, ומנענע נמרצת. מעכבי טסיות כגון prostacyclin (PGI2) יכול לשמש כדי למנוע הפעלה טסית דם; עם זאת, זה עלול להשפיע על איזה איתות המסלולים בתוך טסיות הדם. עבור הכנת כדורי טסיות, אנו להוסיף ACD המתלים טסיות ולהשתמש נמוך מהירות צנטריפוגה.

טסיות הדם הטרי ב PRP יש חיים מוגבל להתפרס, עד 2 שעות. כדי להשיג הפארמצבטית גבוהה, כל הניסויים צריך להיעשות רק עם טסיות דם טרי ובתוך שעתיים לאחר איסוף דם. הנתונים שהוצגו התקבלו עם טסיות ב PRP, אשר נחשבת פיזיולוגית יותר מאשר טסיות שטף. למרות תוחלת החיים וטוהר להגדיל עבור טסיות שטף, צנטריפוגה חוזרות במהלך ההכנה של טסיות שטף יכול להוביל ההפעלה הספונטנית שלהם והדבר עלול לגרום באיכות לא עקבי של טסיות ההכנות. PRP היא עדיפה על טסיות שטף מאז ההליך מהיר יותר, לטפל בזה יכול להפעיל טסיות. עם זאת, במקרים מסוימים, כאשר התערבותו של פלזמה דם גורמי קרישה יכול להפריע הגדרת הניסוי, שטיפת טסיות מייצג פתרון כדי להימנע מבעיות אלה.

זיהום החמצן בדגימות דם לא מחומצן היא השלב הקריטי החשוב ביותר עבור זה וזמינותו. RBCs יכול להיות איחדו רווית חמצן, לפני להתווסף את PRP. עם זאת, העברת דם לא מחומצן RBCs מגביר את הסיכון של זיהום החמצן. בנוסף, deoxygenation של RBCs מרוכז דורשת זמן רב יותר deoxygenation של התכשיר המלא המטוקריט הרצוי ולאחר חשיפה ארוך יותר הוא גז מוביל רמות גבוהות של המוגלובין ללא תא. למרות המוגלובין ללא תאים יכולים להישטף החוצה RBCs רווית, פוספט מאגר מלוחים או מאגרים אחרים משמש לרחצה חייב להיות רווית בקפידה כדי למנוע זיהום החמצן במהלך צנטריפוגה. כדי לקצר את תהליך ההכנה ולמנוע זיהום החמצן מיותרת, כל מדגם PRP + RBCs היה מוכן במלון המטוקריט הרצוי קודם רווית חמצן, אז לפני התוספת של חנקיתי.

כדי לכמת P-VASPSer239 על ידי תספיג, RBCs חייבים להיות מופרדים מתוך טסיות הדם. VASP מתבטאת RBCs13, אך הרמות הם nonsignificant לעומת המוגלובין, הרבה יותר נמוך של טסיות דם. מאז ריכוז החלבון הכולל משמש עבור טעינת הפקדים שהכלים המערבי, הנוכחות של RBCs בדגימות lysate מפריע P-VASP ומדידה VASP מאת סופג המערבי. בשל קצב איטי של dephosphorylation על ידי אנזימים פוספטאז טסיות14, P-VASP מתמשכת למשך 10 דקות (איור 4), לכן ניתן להפריד RBCs על ידי צנטריפוגה לפני איסוף טסיות תא lysates.

ה EC50 עבור VASP זרחון הוא כמעט בסדר גודל נמוך יותר מאשר ה EC50 בשביל להגדיל cGMP שיא, 0.5 ננומטר ו 9 ננומטר, בהתאמה3, מה שהופך את זרחון VASP באחת השיטות הרגישים ביותר כדי לזהות הנוכחות של כמויות נמוכות של מס עם זאת, עקומת זרחון VASP בתגובה לא הוא בצורת פעמון; ירידה זרחון הוא ציין אחרי שדורג 3-30 nM של3. תגובה זו לא לינארית הגדלת ריכוזים לא גורם VASP מצוייה קפדני אין כימות.

מאז טסיות ב PRP יש תוכלת חיים קצרה, וזמינותו חייב להתבצע תוך טסיות דם טרי בתוך שעתיים לאחר עד זוב דם. ניתן למצוא את חוסר העקביות של פו רמות2 לאחר deoxygenation מאז deoxygenation של דגימות תלויה קצב הזרימה של גז הליום ואת קצב מתערבל את הבקבוק. לכן, הזמן deoxygenation צריך להיקבע על ידי המשפט. לשקילת P-VASP מאת שהכלים המערבי, הבחירה נוגדן הוא קריטי, צריך להשתמש ישיר לא תורם כפקד חיובית לבדיקת יחודיות. בנוסף לא, P-VASPSer239 של טסיות הדם יכול להיות phosphorylated על ידי עיכוב של אנזימים phosphodiesterease והפעלה של קינאז שביל.

המדד של P-VASPSer239 יש כמה יתרונות לעומת cGMP assay. cGMP ב טסיות דם יש מחצית חיים קצר מאוד (פחות מ- 10 s) המדידה של cGMP דורש התוספת של מעכבי phosphodiesterase3. כמו כן, המדידה cGMP משתמש בטכניקה אליסה היקרים למדי. VASP נמדד פשוט על ידי פרוטוקול תספיג שבאתר ועל כן זמינים יותר.

P-VASP מוגברתSer239 של טסיות הדם בהצלחה שימש חיישן לדור לא על ידי חנקיתי בשאיפה vivo6. לכן, אנחנו הראו שניתן להשתמש P-VASPSer239 טסיות כסמן של הדור אין ויטרו, ויוו בדם ואולי גם במצבים שונים אחרים. ה EC נמוך מהרגיל50 הופך שיטה זו מועמד מצוין עבור גילוי הנוכחות של נמוך מאוד אין ריכוזים בדם. לכן, פרוטוקול זה מספק אפשרות ללמוד אין דור בדם לגירויים פיזיולוגיים שונים, כגון במהלך אשד קרישת דם, גדל ללחץ מוחלט או גדל דלקת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד ר אלן שכטר מופיע בתור ממציא שיתוף על מספר הפטנטים להנפיק את מכוני הבריאות הלאומיים לשימוש של מלחי חנקיתי לטיפול במחלות לב וכלי דם. הוא מקבל תמלוגים על סמך NIH רישוי פטנטים אלו עבור הפיתוח הקליני אבל אין פיצויים אחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי מענק מגזר NIH ד ר אלן ש שכטר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9, (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9, (3), e92435 (2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93, (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7, (1), e30380 (2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273, (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120, (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13, (3), e0193747 (2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370, (3), 184-188 (1995).
זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter