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Medicine

प्लेटलेट आधारित वीएएसपी फास्फारिलीकरण को मापने के द्वारा रक्त में नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58647
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Department of Pharmacology, Faculty of Dentistry, Mahidol University, 2Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

Summary

यहां, हम रक्त में एक अति संवेदनशील नाइट्रिक ऑक्साइड संवेदक के रूप में प्लेटलेट्स के संभावित उपयोग को संबोधित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह प्रारंभिक प्लेटलेट तैयारी और नाइट्रिक ऑक्साइड जनरेटर के रूप में नाइट्राइट और deoxygenated लाल रक्त कोशिकाओं के उपयोग का वर्णन है ।

Abstract

प्लेटलेट्स उचित रक्त के थक्के के लिए जिंमेदार रक्त अवयव हैं । उनके समारोह में अत्यधिक विभिन्न मार्ग द्वारा विनियमित है । सबसे शक्तिशाली vasoactive एजेंटों में से एक, नाइट्रिक ऑक्साइड (सं), भी प्लेटलेट एकत्रीकरण के एक शक्तिशाली अवरोधक के रूप में कार्य कर सकते हैं । प्रत्यक्ष रक्त में कोई पता लगाने बहुत सेल मुक्त हीमोग्लोबिन कि सीमा नहीं आधा जीवन मिलीसेकंड रेंज के साथ अपनी उच्च जेट के कारण चुनौतीपूर्ण है । वर्तमान में, हस्तक्षेप के बाद कोई परिवर्तन केवल नाइट्राइट और नाइट्रेट (नाइट्रेट के सदस्यों-नाइट्राइट-कोई चयापचय मार्ग) के मापा परिवर्तन के आधार पर अनुमान कर रहे हैं । लेकिन सटीक, इन माप बल्कि तुलना में एक तुलना वास्तविक कोई परिवर्तन की व्याख्या करने के लिए मुश्किल हैं, स्वाभाविक रूप से उच्च आधारभूत नाइट्राइट और नाइट्रेट के स्तर के कारण है कि परिमाण के कई आदेश नहीं खुद की उंमीद परिवर्तन से अधिक कर रहे हैं । इसलिए, प्रत्यक्ष और सरल तरीकों कि एक का पता लगाने के लिए कोई सीधे की अनुमति होगी के विकास के लंबे समय से अपेक्षित है । यह प्रोटोकॉल रक्त में अत्यधिक संवेदनशील कोई संवेदक के रूप में प्लेटलेट्स के संभावित उपयोग को संबोधित करता है । यह प्रारंभिक प्लेटलेट रिच प्लाज्मा (पीआरपी) और धोया प्लेटलेट की तैयारी का वर्णन करता है और कोई जनरेटर के रूप में नाइट्राइट और deoxygenated लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग करें । फास्फारिलीकरण में वीएएसपी की serine २३९ (पी-वीएएसपीSer239) की उपस्थिति का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । तथ्य यह है कि वीएएसपी प्रोटीन अत्यधिक प्लेटलेट्स में व्यक्त की है और है कि यह तेजी से phosphorylated है जब कोई मौजूद है इस मार्ग का उपयोग करने के लिए सीधे रक्त में कोई उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक अनूठा अवसर की ओर जाता है ।

Introduction

प्लेटलेट्स megakaryocytes से व्युत्पन्न छोटे डिस्क के आकार के कोशिका के टुकड़े होते हैं जो रक्त के थक्के के लिए महत्वपूर्ण होते हैं । थक्के झरना विभिन्न (जैसे कोलेजन या ADP के रूप में) सक्रिय अणुओं, संवहनी दीवार की चोट के बाद जारी द्वारा शुरू की है । नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) द्वारा विभिन्न प्रभावों के बीच रक्त के थक्के प्रक्रिया को संशोधित किया जा सकता है । नहीं, स्वाभाविक रूप से स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित, सबसे बहुमुखी शारीरिक संकेतों में से एक है । यह एक शक्तिशाली vasodilator, न्यूरोट्रांसमीटर और प्रतिरक्षा संग्राहक के रूप में कार्य करता है, इसके कई कार्यों के कुछ नाम है । खून में, कोई भी प्लेटलेट एकत्रीकरण बाधा द्वारा रक्त के थक्के की सीमा को विनियमित करने में मदद करता है. खून में नहीं की सबसे अधिक संभावना स्रोतों में से एक नाइट्राइट, एक अकार्बनिक आयन है कि नहीं के एक अग्रदूत के रूप में सेवा दिखाया गया है । लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) के साथ प्रतिक्रिया, नाइट्राइट नहीं करने के लिए कम है और deoxyHb methemoglobin (metHb)1के लिए ऑक्सीकरण हो जाता है । कोई RBCs से जारी vasoactive है और2vasorelaxation कारणों । इस नाइट्राइट कमी मार्ग एक वैकल्पिक कोई पीढ़ी मार्ग, के साथ अभिनय और hypoxic शर्तों पर endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस द्वारा शास्त्रीय कोई पीढ़ी पथ पूरक है ।

प्लेटलेट्स अपने आप में नाइट्राइट कम नहीं कर पा रहे हैं, लेकिन अपनी उपस्थिति के प्रति बहुत संवेदनशील हैं । बरकरार प्लेटलेट्स में, नहीं nanomolar रेंज में cGMP बढ़ जाती है (चुनाव आयोग५० = 10 एनएम) और वीएएसपी के फास्फारिलीकरण (ईसी५० = ०.५ एनएम)3। इसलिए, प्लेटलेट्स RBCs और रक्त में कोई रिलीज द्वारा नाइट्राइट कमी के एक उत्कृष्ट संवेदक के रूप में सेवा कर सकते हैं । वहां कई तरीके है कि सीधे प्लेटलेट सक्रियकरण की हद तक उपाय कर सकते है-जैसे aggregometry और thromboelastography (TEG)4,5। हालांकि, इन तरीकों महंगा विशेष उपकरण और सामग्री की जगह बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । यह भी घटनाओं बहाव पर नजर रखने के लिए संभव है, के बाद कोई RBCs से जारी है, प्लेटलेट की सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का उपयोग कर-जैसे पी-selectin6। कोई भी प्लेटलेट्स7में cGMP की मात्रा बढ़ाने के लिए जाना जाता है । पहले, हम deoxygenated आरबीसी8द्वारा नाइट्राइट कमी के बाद रक्त में कोई रिलीज की निगरानी करने के लिए cGMP का इस्तेमाल किया । यह एक बहुत ही संवेदनशील पद्धति साबित हुई; हालांकि, cGMP एक लघु अणु रहता है और इसका पता लगाने के व्यापक परिश्रम शामिल है । एक और संभावना है, प्रस्तुत प्रोटोकॉल में वर्णित है, vasodilator के फास्फारिलीकरण-उत्तेजित phospho (वीएएसपी) का उपयोग करता है-प्रोटीन रक्त में नहीं की उपस्थिति का पता लगाने के लिए । वीएएसपी प्रोटीन कळेनासे जी सक्रियण, जो sGC/cGMP मार्ग9के माध्यम से नहीं के साथ बातचीत पर phosphorylated है की एक सब्सट्रेट है । detectable वीएएसपी फास्फारिलीकरण बहुत कम नहीं सांद्रता पर होता है, जो प्लेटलेट्स रक्त में कोई उपस्थिति की एक बहुत ही संवेदनशील डिटेक्टर बना सकता है । वीएएसपी प्लेटलेट्स में अत्यधिक व्यक्त की है, लेकिन अन्य रक्त कोशिकाओं में नहीं है, जो चुनिंदा प्लेटलेट्स10शामिल घटनाओं का पालन करने की अनुमति देता है.

इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य वीएएसपी फास्फारिलीकरण11,12की निगरानी के द्वारा प्लेटलेट्स के साथ अपनी बातचीत का उपयोग कर पूरे रक्त में कोई रिलीज का पता लगाने के लिए विस्तार से विधि का वर्णन है । वर्णित विधि कम नहीं सांद्रता का जल्दी पता लगाने की अनुमति देता है-सैद्धांतिक रूप से nanomolar रेंज में जो वर्तमान प्रोटोकॉल cGMP निर्धारण से अधिक संवेदनशील बनाता है, मानक पश्चिमी दाग सबसे प्रयोगशाला में प्राप्त तकनीक के उपयोग की वजह से सेटिंग्स.

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Protocol

नोट: NIH ब्लड बैंक (आईआरबी अनुमोदित प्रोटोकॉल: ९९-CC-०१६८) से रक्त के नमूने प्राप्त किए गए ।

1. ब्लड सैंपल तैयार करना

नोट: प्लेटलेट सक्रियण से बचने के लिए, धीरे खून आकर्षित और कई बार ट्यूब औंधा द्वारा साइट्रेट के साथ धीरे से मिश्रण ।

  1. प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा (पीआरपी) की तैयारी
    1. एक 20 ग्राम या बड़ा व्यास सुई का उपयोग कर रक्त की 30-50 मिलीलीटर ड्रा और एक १११ अनुपात में एक 1:9 अनुपात या एसिड साइट्रेट डेक्सट्रोज (एसीडी) (८५ मिमी trisodium साइट्रेट, ६६.६ मिमी साइट्रिक एसिड, ४.५ मिमी ग्लूकोज, पीएच 1:6) में सोडियम साइट्रेट (३.८%) युक्त ट्यूब में जोड़ें ।
    2. Aliquot खाली 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में ताजा एकत्र पूरे रक्त की 5 मिलीलीटर । १२० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पूरे रक्त केंद्रापसारक ।
    3. ध्यान से एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट द्वारा ऊपरी हिस्से से प्लेटलेट्स (प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा, पीआरपी) युक्त supernatant इकट्ठा ।
      नोट: से पीआरपी कदम 1.1.3 प्रयोगों में उपयोग के लिए या आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार करने के लिए धोया प्लेटलेट्स तैयार है । नरम केंद्रापसारक के बाद प्राप्त की गोली (1.1.2 कदम) लाल रक्त कोशिकाओं और सफेद कोशिकाओं में शामिल है और आगे धोया लाल रक्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए शुद्ध कर सकते है (आरबीसी)-कदम १.३ देखें। प्रयोग रक्त ड्राइंग के बाद 2 ज के भीतर समाप्त होने की जरूरत है । पीआरपी (supernatant) एकत्रित करते समय, buffy कोट-युक्त ल्यूकोसाइट्स के संग्रह को पीआरपी/आरबीसी इंटरफेस पर जमा से बचें ।
  2. धोया प्लेटलेट तैयारी (वैकल्पिक)
    1. केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ४०० x g में पीआरपी एकत्र । supernatant को त्यागें और प्लेटलेट छर्रों रखें ।
    2. धीरे सीजीएस बफर (१२० mm NaCl, १२.९ mm trisodium साइट्रेट और 30 mm ग्लूकोज, ६.५ पीएच) के 5 मिलीलीटर जोड़कर छर्रों धोने और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
    3. संशोधित Tyrode बफर के 3 मिलीलीटर (१३४ mm NaCl, ०.३४ mm णः2PO4, २.९ mm KCl, 12 मिमी NaHCO3, 20 मिमी HEPES, 1 मिमी MgCl2, 2 मिमी CaCl2, 10 मिमी ग्लूकोज पीएच ७.४) के साथ प्लेटलेट छर्रों resuspend ।
    4. प्लेटलेट्स पतला (1:100-उदाहरण के रूप में, Rees-Ecker समाधान के ९९० µ l में प्लेटलेट्स के 10 µ एल) Rees Ecker समाधान के साथ और hemocytometer द्वारा गणना ।
    5. Tyrode बफर जोड़कर प्लेटलेट्स का घनत्व 3 x 108 कोशिकाओं/
    6. प्रयोग शुरू करने से पहले 1 h के लिए ३७ ° c पर प्लेटलेट निलंबन की मशीन ।
      नोट: धोया प्लेटलेट्स ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5-8 ज के लिए स्थिर हैं ।
  3. धोने लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) की तैयारी
    1. संग्रह के बाद, नरम गोली २,५०० x g पर चरण 1.1.3 में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्राप्त करने के केंद्रापसारक ।
    2. supernatant को त्यागें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २,५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ आरबीसी गोली धो लो । इस चरण को 3 बार दोहराएं ।
    3. पंजाबियों को त्यागें और आगे के प्रयोगों के लिए धोया RBCs का उपयोग करें ।

2. ऑक्सीजन

  1. पीआरपी के मिश्रण की 1 मिलीलीटर जोड़ें (1.1.4. या कदम में तैयार 1.2.4.) और RBCs (चरण १.३ में तैयार.) में वांछित हेमाटोक्रिट पर एक के एक रबर डाट के साथ बंद बोतल । उदाहरण के लिए, 20% हेमाटोक्रिट पर, २०० µ l को RBCs के ८०० µ l में जोड़ें ।
    नोट: सुझाए गए hematocrits 0% से ४०% तक हैं । कांच की बोतल या कुप्पी का प्रयोग न करें क्योंकि प्लेटलेट्स कांच की सतह का पालन करते हैं ।
  2. बंद बोतल में हीलियम गैस टैंक से जुड़ी सुई डालें और 26 ग्राम सुई (चित्रा 1) डालने से गैस की दुकान बना लें ।
  3. धीरे से कमरे के तापमान पर बोतल घूमता है ।
    नोट: वह खून की तैयारी के माध्यम से बुलबुला गैस की अनुमति नहीं है । धीमी गैस प्रवाह इस प्रक्रिया के लिए बेहतर है, और जरूरत से ज्यादा तेजी से वह गैस के प्रवाह में वृद्धि हुई hemolysis की ओर जाता है । सबसे कुशल गैस प्रवाह परीक्षण द्वारा निर्धारित की जरूरत है, क्योंकि यह उच्च प्रयोगात्मक सेटअप की ज्यामिति पर निर्भर करता है ।
  4. आंशिक ऑक्सीजन दबाव (पीओ2) का उपयोग कर एक सह-oximeter को मापने के द्वारा आवधिक रूप से ऑक्सीजन प्रक्रिया का पालन करें ।
    नोट: हमारे हाथ में, ऑक्सीजन के 10 मिनट के पीओ2 से 25 mmHg जो RBCs द्वारा नाइट्राइट कमी के लिए आवश्यक है कम हो जाती है । सतत् ऑक्सीजन को आगे पीओ2 से 10 mmHg कम किया; हालांकि, इससे कोशिका-मुक्त हीमोग्लोबिन (चित्रा 2) में वृद्धि हुई hemolysis और बढ़ जाती है ।

3. लाल रक्त कोशिका नाइट्राइट कमी

  1. नाइट्राइट के ५०० mM स्टॉक सॉल्यूशन बनाने के लिए2 . 1 नैनो (pH ७.४) के ०.०३४५ ग्राम में जोड़ें । पंजाब में सीरियल कमजोर पड़ने से ५०० mM नैनो2 से २५० µ एम नैनो2 (25x) पतला (पीएच ७.४) ।
  2. एक microsyringe का प्रयोग, पट के माध्यम से नाइट्राइट (४० µ एल) इंजेक्शन पीआरपी और deoxygenated के RBCs नमूना में 10 µ मीटर के अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए कुल 1 मिलीलीटर में नमूना ।
    नोट: इस प्रयोग में नाइट्राइट के अंतिम सांद्रता का उपयोग १० µ मी.
  3. 10 मिनट या उससे अधिक समय के लिए ३७ ° c पर नमूना मशीन ।
    नोट: नाइट्राइट के साथ आरबीसी मशीन की सटीक अवधि को समायोजित प्रयोगों के विभिंन प्रकार के लिए अधिक से अधिक नाइट्राइट कमी के लिए आवश्यक है ।
  4. डाट निकालें और एक microcentrifuge ट्यूब में नमूने के 1 मिलीलीटर पिपेट ।
  5. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. पिपेट के ऊपरी भाग से प्लेटलेट सस्पेंशन के ३०० µ एल और एसीडी (पीएच ६.५) के साथ मिश्रण एक 1:9 अनुपात में । आरबीसी गोली त्यागें ।
  7. ५०० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए प्लेटलेट निलंबन केंद्रापसारक ।
  8. जोड़ें ८० µ आइस-शीत lysis बफर के एल (१५० mm NaCl, ५० mm Tris, ०.५% NP-४०, पीएच ७.४) से युक्त को छेड़ने वाला अवरोधक कॉकटेल III (1:500) प्लेटलेट छर्रों ।

4. वीएएसपी का वेस्टर्न सोख्ता

  1. प्रत्येक नमूना से 2 अलग 10% एसडीएस-पृष्ठ जैल से प्रोटीन की 15 µ g लोड करें ।
    नोट: कठोर अलग करना बफर है, जिसमें बी-mercaptoethanol हैं, झिल्ली से पी-वीएएसपीSer239 और वीएएसपी एंटीबॉडी नहीं निकाल सकते; इसलिए, पी-वीएएसपी Ser239 और वीएएसपी अलग से चलाया जाना चाहिए ।
  2. १.३० एच के लिए १२० वी में जैल भागो और nitrocellulose झिल्ली को हस्तांतरण ।
  3. ब्लॉक गैर विशिष्ट 5% गैर वसा वाले सूखे दूध के साथ बाध्यकारी ।
  4. पी-वीएएसपीSer239 (1:500), वीएएसपी (1:1000) और GAPDH (1:1000) के साथ झिल्ली की गर्मी रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
  5. गर्मी कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए झिल्ली के साथ सहिजन peroxidase (एचआरपी) माध्यमिक एंटीबॉडी ।
  6. एक imager मशीन के साथ झिल्ली बेनकाब और ImageJ का उपयोग कर बैंड घनत्व यों तो ।

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Representative Results

शिरापरक रक्त के नमूने 50-80 mmHg के बीच पीओ2 मान है । हीलियम द्वारा ऑक्सीजन 10 मिनट के भीतर पीओ2 से 25 mmHg कम हो जाती है । बढ़ा हुआ ऑक्सीजन समय थोड़ा और कम हो जाती है पीओ2। हालांकि, ऑक्सीजन की वृद्धि का समय भी कोशिका मुक्त हीमोग्लोबिन के काफी वृद्धि हुई स्तर की ओर जाता है (सह-Oximeter द्वारा निर्धारित, नेत्रहीन प्लाज्मा के तेजी से लाल रंगाई के रूप में चित्रा 2 पर देखा) (चित्र 2a-बी). बढ़ी हुई hemolysis सरगर्मी के साथ जुड़ा हुआ नहीं है क्योंकि बिना किसी हलचल के hemolysis प्रेरित नहीं करता है (चित्रा 2c) ।

हमने पाया है कि लीजड ड नमूनों में RBCs की उपस्थिति पी-वीएएसपीSer239 और पश्चिमी वीएएसपी (चित्रा 3) द्वारा पता लगाया सोख्ता कम हो जाती है । इसलिए प्लेटलेट्स में पी-वीएएसपीSer239 का पता लगाने के लिए पश्चिमी दाग चलाने से पहले हमने पहले प्लेटलेट्स और RBCs अलग कर लिए ।

दिखाने के लिए पर्याप्त समय है वीएएसपी फास्फारिलीकरण को प्रभावित किए बिना प्लेटलेट्स के बाहर RBCs अलग करने के लिए, हम एक छोटे से नहीं दाता रहते थे । PROLI NONOate (१.८ एस के आधे जीवन के साथ कोई दाता ३७ सी पीएच ७.४ पर), तेजी से वृद्धि हुई पी-प्लेटलेट्स में वीएएसपीSer239 (मशीन के 10 एस के भीतर) । पी-वीएएसपीSer239 द्वारा प्रेरित PROLI NONOate 10 मिनट के लिए पीआरपी के साथ मशीन के बाद पता चला है (4 अंक) ।

नाइट्राइट deoxygenated RBCs (पीओ2 25 mmHg) की मौजूदगी में प्लेटलेट्स में पी-वीएएसपीSer239 बढ़ जाती है । deoxygenated RBCs की नाइट्राइट रिडक्टेस गतिविधि हेमाटोक्रिट पर निर्भर करती है और अधिकतम प्रभाव 20% हेमाटोक्रिट (चित्रा 5) पर मनाया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: ऑक्सीजन चैंबर । एक रबर पट के साथ बंद एक प्लास्टिक की बोतल में पीआरपी और RBCs का मिश्रण जोड़ा जाता है । बंद बोतल एक सुई का उपयोग हीलियम (वह) लाइन से जुड़ा है । ऑक्सीजन एक छोटी सी सिरिंज सुई (26 ग्राम) एक गैस आउटलेट के रूप में सेवारत द्वारा बाहर निकाली है ।

Figure 2
चित्रा 2: आंशिक ऑक्सीजन दबाव (पीओ2) और ऑक्सीजन के बाद कोशिका मुक्त हीमोग्लोबिन । (क) पीआरपी और RBCs नमूने 3, 5, 10, 15, 30 और ५० मिनट के लिए deoxygenated थे. पीओ2 नमूनों की रक्त गैस विश्लेषक द्वारा मापा गया (n = 3) । त्रुटि सलाखों SEM. supernatant पीआरपी के प्रतिनिधि चित्र + RBCs नमूनों के साथ उभारा (ख) या हीलियम (सी) के बिना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न हेमाटोक्रिट पर तैयार किए गए पीआरपी/RBCs के नमूनों में प्रतिनिधि वीएएसपी वेस्टर्न ब्लाट बैंड. RBCs 1, 5, 10, 15, 20, ४०% हेमाटोक्रिट को पीआरपी में जोड़ा गया । पीआरपी के मिश्रण + RBCs 5 मिनट और lysis बफर के साथ लीजड ड के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक थे ।

Figure 4
चित्रा 4: पी के प्रतिनिधि पश्चिमी दाग बैंड-वीएएसपीSer239 और वीएएसपी कोई दाता PROLI NONOate के लिए जोखिम के बाद पीआरपी में । PROLI NONOate (10 मीटर) पीआरपी में जोड़ा गया था और 10 और 30 एस और 1, 2, 5, 10, 20 और ४० मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।

Figure 5
चित्रा 5: वीएएसपीSer239 फास्फारिलीकरण पीओ2 और हेमाटोक्रिट के स्तर पर निर्भर करता है । (क) पीआरपी + RBCs (२०% हेमाटोक्रिट) को दो भिन्न पो२ स्तरों, ४० और २५ mmHg को deoxygenated गया. पी-वीएएसपीSer239 और वीएएसपी 10 मिनट के लिए ३७ C पर 10 मीटर नाइट्राइट के साथ deoxygenated नमूनों की मशीन के बाद मापा गया था । (ख) नाइट्राइट (10 मीटर) deoxygenated पीआरपी + RBCs में 0, 10, 20 और ४०% हेमाटोक्रिट (pO2 = 25 mmHg) में जोड़ा गया था । गुना वृद्धि हुई (P-वीएएसपीSer239) प्रत्येक हेमाटोक्रिट मान के लिए नियंत्रण (पीआरपी + RBCs बिना नाइट्राइट) के सापेक्ष गणना की गई थी । त्रुटि सलाखों = SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

चूंकि प्लेटलेट्स आसानी से सक्रिय हो जाते हैं, प्लेटलेट युक्त नमूनों की कोमल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है । तेज pipetting और जोरदार झटकों से बचना चाहिए । प्लेटलेट अवरोधकों जैसे prostacyclin (पीजीआई2) प्लेटलेट सक्रियण को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता; हालांकि, इस प्लेटलेट्स के अंदर कुछ संकेत रास्ते को प्रभावित कर सकते हैं । प्लेटलेट छर्रों की तैयारी के लिए, हम प्लेटलेट सस्पेंशन करने के लिए एसीडी जोड़ने और कम गति केंद्रापसारक का उपयोग करें ।

पीआरपी में हौसले से तैयार प्लेटलेट्स एक सीमित जीवन अवधि, 2 एच तक है । उच्च reproducibility प्राप्त करने के लिए, सभी प्रयोगों केवल ताजा प्लेटलेट्स के साथ और रक्त संग्रह के बाद 2 ज के भीतर किया जाना चाहिए । प्रस्तुत डेटा पीआरपी में प्लेटलेट्स के साथ प्राप्त किया गया था, जो धोया प्लेटलेट्स से अधिक शारीरिक माना जाता है । हालांकि जीवन काल और धोया प्लेटलेट्स के लिए शुद्धता में वृद्धि, धोया प्लेटलेट्स की तैयारी के दौरान दोहराया केंद्रापसारक उनके सहज सक्रियण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और इस प्लेटलेट की तैयारी की असंगत गुणवत्ता में परिणाम हो सकता है. पीआरपी को धोया प्लेटलेट्स पर प्राथमिकता के बाद से प्रक्रिया में तेजी से है और आगे हैंडलिंग प्लेटलेट्स को सक्रिय कर सकता है । हालांकि, विशिष्ट मामलों में, जब प्लाज्मा रक्त के थक्के कारकों के हस्तक्षेप प्रयोगात्मक सेटअप के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, धोने प्लेटलेट्स इन समस्याओं से बचने के लिए समाधान का प्रतिनिधित्व करता है ।

deoxygenated नमूनों में ऑक्सीजन संदूषण इस परख के लिए सबसे महत्वपूर्ण अहम कदम है । RBCs को पीआरपी में जोड़े जाने से पहले परित और deoxygenated जा सकता है । हालांकि, deoxygenated RBCs स्थानांतरित ऑक्सीजन संदूषण का खतरा बढ़ जाता है । इसके अलावा, केंद्रित RBCs के ऑक्सीजन वांछित हेमाटोक्रिट में पूर्ण तैयारी के ऑक्सीजन से अधिक समय की आवश्यकता है, और अब वह गैस के लिए जोखिम सेल मुक्त हीमोग्लोबिन के स्तर में वृद्धि की ओर जाता है । हालांकि कोशिका मुक्त हीमोग्लोबिन deoxygenated RBCs के बाहर धोया जा सकता है, फास्फेट बफर खारा या अन्य धोने के लिए इस्तेमाल किया buffers सावधानी से deoxygenated के दौरान ऑक्सीजन संदूषण को रोकने के लिए किया जाना चाहिए । तैयारी की प्रक्रिया को कम करने और अनावश्यक ऑक्सीजन संदूषण से बचने के लिए, प्रत्येक पीआरपी + RBCs नमूना पहले वांछित हेमाटोक्रिट पर तैयार किया गया था और फिर नाइट्राइट के अलावा पहले deoxygenated ।

पश्चिमी दाग द्वारा पी-वीएएसपीSer239 का पता लगाने के लिए, RBCs प्लेटलेट्स से अलग किया जाना चाहिए । वीएएसपी13RBCs में व्यक्त किया जाता है, लेकिन हीमोग्लोबिन की तुलना में स्तर नगण्य है और प्लेटलेट्स की तुलना में बहुत कम है । चूंकि कुल प्रोटीन एकाग्रता पश्चिमी दाग में नियंत्रण लोड करने के लिए प्रयोग किया जाता है, lysate नमूनों में RBCs की उपस्थिति पश्चिमी सोख्ता द्वारा पी-वीएएसपी और वीएएसपी माप के साथ हस्तक्षेप । प्लेटलेट्स14में फॉस्फेट एंजाइमों द्वारा dephosphorylation की एक धीमी दर के कारण, पी-वीएएसपी 10 मिनट (चित्रा 4) के लिए निरंतर है और इसलिए यह प्लेटलेट सेल lysates इकट्ठा करने से पहले केंद्रापसारक द्वारा RBCs अलग करने के लिए संभव है ।

वीएएसपी फास्फारिलीकरण के लिए ec५० लगभग परिमाण के एक आदेश के लिए५० चुनाव आयोग से पीक cGMP वृद्धि, ०.५ एनएम और 9 एनएम, क्रमशः3, जो बनाता है वीएएसपी फास्फारिलीकरण की उपस्थिति का पता लगाने के लिए सबसे संवेदनशील तरीकों में से एक है कम मात्रा में नहीं । हालांकि, नहीं के जवाब में वीएएसपी फास्फारिलीकरण वक्र घंटी के आकार का है; एक फास्फारिलीकरण कमी नहीं3के 3-30 एनएम पर नुकीला के बाद मनाया जाता है । कोई सांद्रता बढ़ाने के लिए यह रैखिक प्रतिक्रिया वीएएसपी कठोर कोई ठहराव के लिए अनुपयुक्त बनाता है ।

चूंकि पीआरपी में प्लेटलेट्स एक छोटी जीवन अवधि है, परख रक्त ड्राइंग के बाद 2 घंटे के भीतर ताजा प्लेटलेट्स में किया जाना चाहिए । पीओ2 स्तर की विसंगति के बाद ऑक्सीजन के नमूनों की ऑक्सीजन हीलियम गैस और बोतल घूमता की दर के प्रवाह की दर पर निर्भर है पाया जा सकता है के बाद । इसलिए, ऑक्सीजन के लिए समय परीक्षण के द्वारा निर्धारित की जरूरत है । पश्चिमी दाग से पी-वीएएसपी की माप के लिए, एंटीबॉडी विकल्प महत्वपूर्ण है, और एक को एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक प्रत्यक्ष नहीं दाता का उपयोग करने की जरूरत है विशिष्टता की जांच करें । नहीं के अलावा, प्लेटलेट्स में पी-वीएएसपीSer239 phosphodiesterease एंजाइमों और प्रोटीन के सक्रियकरण कळेनासे एक मार्ग के निषेध द्वारा phosphorylated जा सकता है ।

पी के माप-वीएएसपीSer239 cGMP परख पर कुछ लाभ है । प्लेटलेट्स में cGMP एक बहुत ही कम आधा जीवन है (कम से 10 s) और cGMP की माप फोस्फोडाईस्टेरेज अवरोधक के अलावा की आवश्यकता है3. इसके अलावा, cGMP माप एक नहीं बल्कि महंगी एलिसा तकनीक का उपयोग करता है । वीएएसपी बस एक घर में पश्चिमी दाग प्रोटोकॉल द्वारा मापा जा सकता है और इसलिए और अधिक आसानी से उपलब्ध है ।

बढ़ी हुई पी-वीएएसपीSer239 में प्लेटलेट्स को सफलतापूर्वक vivo6में साँस नाइट्राइट करके कोई पीढ़ी के लिए सेंसर के रूप में इस्तेमाल किया गया. इसलिए, हमने दिखाया है कि यह संभव है कि इन विट्रो में और vivo में रक्त में और संभवत: विभिन्न अन्य स्थितियों में किसी भी पीढ़ी के मार्कर के रूप में प्लेटलेट्स में पी-वीएएसपीSer239 का उपयोग करने के लिए । असामांय रूप से कम ईसी५० इस विधि रक्त में बहुत कम नहीं सांद्रता की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक उत्कृष्ट उंमीदवार बनाता है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल एक संभावना विभिंन शारीरिक उत्तेजनाओं में रक्त में कोई पीढ़ी के अध्ययन के लिए, जैसे रक्त जमावट झरना के दौरान, सरासर तनाव या वृद्धि की सूजन बढ़ जाती है ।

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Disclosures

डॉ एलन Schechter कई हृदय रोगों के उपचार के लिए नाइट्राइट लवण के उपयोग के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों को जारी किए गए पेटेंट पर एक सह के आविष्कारक के रूप में सूचीबद्ध है । वह नैदानिक विकास के लिए इन पेटेंट के NIH लाइसेंस के आधार पर रॉयल्टी प्राप्त करता है, लेकिन कोई अंय मुआवजा ।

Acknowledgments

यह काम डॉ एलन एन Schechter को NIH अंदर अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

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References

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दवा अंक १४३ प्लेटलेट्स लाल रक्त कोशिकाएं नाइट्राइट नाइट्रिक ऑक्साइड रक्त के थक्के deoxyhemoglobin वीएएसपी प्रोटीन
प्लेटलेट आधारित वीएएसपी फास्फारिलीकरण को मापने के द्वारा रक्त में नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने
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Srihirun, S., Schechter, A. N.,… More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

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