Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Blodplater-basert oppdagelsen av nitrogenoksid i blodet ved å måle VASP fosforylering

doi: 10.3791/58647 Published: January 7, 2019

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å løse potensielle bruk av blodplater som en svært følsom nitrogenoksid sensor i blodet. Det beskriver første Platederivert forberedelse og bruk av nitrite og deoxygenated røde blod celler som nitrogenoksid generatorer.

Abstract

Blodplater er blod komponentene ansvarlig for riktig blodpropp. Deres funksjon er sterkt regulert av ulike veier. En av de mest potente vasoactive agentene, nitrogenoksid (NO), kan også fungere som en kraftig inhibitor av trombocyttaggregasjon. Direkte er ingen oppdagelsen i blodet svært utfordrende på grunn av sin høye kryssreaksjon med celle-fri hemoglobin som begrenser ikke half-life millisekund området. Foreløpig basert ingen endringer etter tiltak er bare beregnet på målt endringer av nitrite og nitrate (medlemmer av nitrat-nitritt-ingen metabolske veien). Men nøyaktig, disse målingene er ganske vanskelig å tolke vis en vis faktiske uten endringer, på grunn av det naturlig høye planlagte nitritt og nitrate høyder som er flere størrelsesordener høyere enn forventede endringene ikke seg selv. Derfor er utviklingen av direkte og enkelt metoder som ville tillate en å oppdage ingen direkte lang forfallen. Denne protokollen adresser en potensiell bruk av blodplater som et ingen sensor i blodet. Det beskriver første Platederivert rik plasma (PRP) og vasket Platederivert forberedelser og bruk av nitrite og deoxygenated røde blod celler som ingen generatorer. Fosforylering av VASP på serine 239 (P-VASPSer239) brukes til å oppdage tilstedeværelsen av nr. At VASP protein er svært uttrykt i blodplater og at det er raskt fosforylert når nei finnes fører til en unik mulighet til å bruke denne veien til direkte merker ingen tilstedeværelse i blodet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Blodplater er platen-formet småcellet bruddstykker avledet fra megakaryocytes som er avgjørende for blodpropp. Clotting kaskade startes av ulike bioaktive molekyler (som kollagen eller ADP), utgitt etter skaden av vaskulære veggen. Blodpropp prosessen kan endres, blant ulike effektor av nitrogenoksid (NO). Nei, naturlig produsert av pattedyrceller, er en av de mest allsidige fysiologiske signalene. Det fungerer som en potent vasodilator, nevrotransmitter og immun modulator, for å nevne noen av sine mange funksjoner. I blodet, ikke også bidrar til å regulere omfanget av blodpropp begrenser trombocyttaggregasjon. En av de mest sannsynlig ikke i blodet er nitritt, et uorganiske ion som har vist seg å fungere som en forløper for. Reagerer med røde blodceller (RBCs), nitritt reduseres til Nei og deoxyHb er oksidert til methemoglobin (metHb)1. INGEN løslatt fra RBCs er vasoactive og forårsaker vasorelaxation2. Denne nitritt reduksjon veien er en alternativ ingen generasjon veien, opptrer sammen med og utfyller den klassiske ingen generasjon bane av endothelial nitrogenoksid syntase på hypoxic forhold.

Blodplater seg er ikke kjøpedyktig nedskrive nitritt til nei men er svært følsomme for sin tilstedeværelse. Intakt blodplater, ikke i nanomolar området øker cGMP (EF50 = 10 nM) og fosforylering av VASP (EF50 = 0,5 nM)3. Derfor kan blodplater tjene som en utmerket sensor nitritt reduksjon av RBCs og ingen utslipp til blod. Det finnes flere metoder som direkte kan måle Platederivert aktivisering - som aggregometry og thromboelastography (TEG)4,5. Men krever metodene dyre spesialiserte instrumentering og ganske store mengder materiale. Det er også mulig å overvåke hendelser nedstrøms, etter nei frigis fra RBCs, bruke endringene i blodplater overflaten protein uttrykk – for eksempel P-selectin6. IKKE er også kjent for å øke mengden av cGMP i blodplater7. Tidligere brukte vi cGMP overvåke ingen utslipp til blod etter nitritt reduksjon av deoxygenated RBC8. Dette viste seg for å være en svært følsom; men cGMP er et kortvarig molekyl og oppdagelsen innebærer omfattende arbeid. En annen mulighet, beskrevet i presentert protokollen, bruker fosforylering i vasodilator-stimulert phospho (VASP)-protein for å oppdage tilstedeværelsen av nei i blodet. VASP er et medium av protein kinase G aktivisering, hvilke er fosforylert på samspill med nei gjennom sGC/cGMP veien9. Synlig VASP fosforylering forekommer svært lav uten konsentrasjoner, som kan gjøre blodplater en svært følsom detektor ingen tilstedeværelse i blodet. VASP er svært uttrykt i blodplater, men ikke i andre blod celler, som kan følge selektivt hendelsene som involverer blodplater10.

Hovedmålet med denne protokollen er å beskrive metoden i detalj for påvisning av ingen utslipp i hele blod med dets interaksjon med blodplater ved å overvåke VASP fosforylering11,12. Metoden beskrevet oppdages tidlig lav ingen konsentrasjoner - teoretisk sett i området nanomolar, som gjør den nåværende protokollen mer følsom enn cGMP besluttsomhet, på grunn av bruk av standard Western blot teknikker oppnåelig i de fleste laboratorium innstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Merk: Blodprøver ble innhentet fra NIH blod bank (IRB godkjent protokollen: 99-CC-0168).

1. blod prøve forberedelse

Merk: For å unngå Platederivert aktivisering, trekke blod sakte og bland forsiktig med citrate ved å snu røret flere ganger.

  1. Blodplater-rich plasma (PRP) forberedelse
    1. Tegne 30-50 mL blod med en 20 G eller større diameter nål og Legg i et rør som inneholder natriumsitrat (3.8%) i en 1:9 forholdet eller syre citrate druesukker (ACD) (85 mM trisodium citrate, 66.6 mM sitronsyre, 111 mM glukose, pH 4.5) i 1:6 forholdet.
    2. Aliquot 5 mL av fersk samlet fullblod inn tomme 15-mL konisk rørene. Sentrifuge fullblod 120 x g i 10 min ved romtemperatur.
    3. Nøye samle nedbryting inneholder blodplater (blodplater-rich plasma, PRP) fra den øvre delen av en plast overføring pipette.
      Merk: PRP fra trinn 1.1.3 er klar til bruk i eksperimenter eller for ytterligere behandling å forberede vasket blodplater. Den myke pellet innhentet etter sentrifugering (trinn 1.1.2) inneholder røde blodlegemer og hvite celler og kan være ytterligere renset for å få vasket røde blodlegemer (RBC)-se trinn 1.3. Eksperimentet må være ferdig innen 2 timer etter tegning blod. Når samle PRP (supernatant), unngå samlingen av buffy pels inneholder leukocytter akkumulert i PRP/RBC grensesnittet.
  2. Vasket Platederivert forberedelse (valgfritt)
    1. Sentrifuger samlet PRP 400 x g i 10 min ved romtemperatur. Forkast nedbryting og holde Platederivert pellets.
    2. Forsiktig vaske pellets ved å legge 5 mL CGS buffer (120 mM NaCl, 12.9 mM trisodium citrate og 30 mM glukose, pH 6,5) og sentrifuger på 400 x g i 10 min ved romtemperatur.
    3. Resuspend Platederivert pellets med 3 mL modifisert Tyrode buffer (134 mM NaCl, 0.34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glukose pH 7.4).
    4. Fortynne blodplater (1: 100, som eksempel, 10 µL av blodplater i 990 µL av Rees-Ecker løsning) med Rees Ecker løsning og telle ved hemocytometer.
    5. Justere tettheten av blodplater til 3 x 108 celler/mL ved å legge til Tyrode buffer.
    6. Inkuber Platederivert suspensjon på 37 ° C i 1 time før du starter eksperimentet.
      Merk: Vasket blodplater er stabil 5-8 h på 37 ° C.
  3. Utarbeidelse av vasket røde blodlegemer (RBC)
    1. Etter samlingen, sentrifuge den myke pellet fikk i trinn 1.1.3 2500 x g i 10 min ved romtemperatur.
    2. Forkaste nedbryting og vask RBC pellets med 5 mL PBS med sentrifugering 2500 x g i 10 min ved romtemperatur. Gjenta dette trinnet for 3 timene.
    3. Forkaste PBS og bruke vasket RBCs for videre studier.

2. deoxygenation

  1. Legge 1 mL av blandingen av PRP (i trinn 1.1.4. eller 1.2.4.) og RBCs (forberedt i trinn 1.3.) på den ønskede hematokrit i en polypropylen flaske lukket med en gummipropp. For eksempel 20% hematokrit, Legg til på 200 µL av RBCs 800 µL PRP.
    Merk: Foreslått hematocrits er fra 0% til 40%. Ikke bruk en glassflaske eller kolbe som blodplater overholder glassoverflaten.
  2. Sette inn nålen koblet til helium gass tank i lukket flasken og gjøre gass uttaket ved å sette inn en 26 G nål (figur 1).
  3. Sakte swirl flasken ved romtemperatur.
    Merk: Tillat ikke han gass å boble gjennom blod forberedelse. Langsom gasstrømmen anbefales for denne prosedyren, og svært rask han gasstrømmen fører til økt hemolyse. Mest effektive gasstrømmen må bestemmes av rettssaken, som det svært avhenger geometrien av eksperimentelle.
  4. Regelmessig Følg deoxygenation prosessen ved å måle delvis oksygen trykket (pO2) bruker en co oksymeter.
    Merk: I våre hender redusere 10 min av deoxygenation minsker pO2 til 25 mmHg som kreves for nitritt reduksjon av RBCs. videre deoxygenation ytterligere pO2 til 10 mmHg; Det førte til økt hemolyse og øker i celle-fri hemoglobin (figur 2).

3. røde blodlegemer nitritt reduksjon

  1. Legg 1 mL av PBS (pH 7.4) i 0.0345 g NaNO2 å 500 mM lager løsning av nitritt. Fortynne 500 mM NaNO2 til 250 µM NaNO2 (25 x) av føljetong fortynning i PBS (pH 7.4).
  2. Bruker en microsyringe, injisere nitritt (40 µL) gjennom septum i deoxygenated prøven PRP og RBCs å oppnå siste konsentrasjoner av 10 µM i totalt 1 mL av prøven.
    Merk: I dette eksperimentet er de endelige konsentrasjonene av nitritt brukes 10 µM.
  3. Inkuber prøven på 37 ° C i 10 minutter eller lenger.
    Merk: Justere den eksakte varigheten av RBC inkubasjon med nitritt trengs for maksimal nitritt reduksjon for ulike typer eksperimenter.
  4. Fjern stopper og pipette 1 mL av prøven inn i et microcentrifuge rør.
  5. Sentrifuge 200 x g for 3 min ved romtemperatur.
  6. Pipetter 300 µL av blodplater suspensjon fra den øvre delen av nedbryting og bland med ACD (pH 6,5) i et 1:9-forhold. Kast RBC pellets.
  7. Sentrifuge Platederivert suspensjon på 500 x g for 4 min ved romtemperatur.
  8. Legge til 80 µL av iskalde lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7.4) som inneholder protease hemmer cocktail III (1:500) til blodplater pellets.

4. vestlige Blotting av VASP

  1. Last 15 µg av protein fra hver prøve å 2 separate 10% SDS side gels.
    Merk: Harde stripping buffer, som inneholder b-mercaptoethanol, kan ikke fjerne P-VASPSer239 og VASP antistoffer fra membranen; Derfor bør P-VASP Ser239 og VASP kjøres separat.
  2. Kjøre geléer på 120 V for 1,30 h og overføring til nitrocellulose membranen.
  3. Blokk uspesifisert binding med 5% ikke-fett tørr melk.
  4. Inkuber membranen med P-VASPSer239 (1:500), VASP (1:1, 000) og GAPDH (1:1, 000) for overnatting på 4 ° C.
  5. Inkuber pepperrot peroxidase (HRP) sekundære antistoff med membran i 45 min ved romtemperatur.
  6. Utsette membranen med en imager maskin og kvantifisere bandet tetthet bruker ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Venøse blodprøver har pO2 verdier mellom 50-80 mmHg. Deoxygenation av helium synker raskt pO2 til 25 mmHg innen 10 minutter økt deoxygenation gang litt videre nedgang pO2. Men økte tiden av deoxygenation fører også til betydelig økte nivåer av celle-fri hemoglobin (bestemmes av co oksymeter, visuelt sett på figur 2 som stadig rød coloration plasma) (Figur 2A-B). Økt hemolyse er ikke tilknyttet røring fordi omrøring uten deoxygenation ikke brekning hemolyse (figur 2C).

Vi fant at tilstedeværelsen av RBCs i lysed prøver reduserer P-VASPSer239 og VASP oppdaget av vestlige blotting (Figur 3). Derfor separate vi først blodplater og RBCs før vestlige blots å oppdage P-VASPSer239 i blodplater.

For å vise at det er nok tid til å skille RBCs av blodplater uten å påvirke VASP fosforylering, brukte vi en kortvarig ingen donor. PROLI NONOate (ingen bidragsyteren med halveringstid på 1.8 s ved 37 C pH 7.4), raskt økt P-VASPSer239 i blodplater (innen 10 s med inkubering). P-VASPSer239 av PROLI NONOate er oppdaget for 10 min etter inkubasjon med PRP (Figur 4).

Nitritt øker P-VASPSer239 i blodplater i nærvær av deoxygenated RBCs (pO2 25 mmHg). Nitritt reduktase aktiviteten til deoxygenated RBCs avhenger hematokrit og maksimal effekt er observert på 20% hematokrit (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Deoxygenation kammeret. Blanding av PRP og RBCs legges i en plastflaske lukket med en gummi septum. Lukket flasken er koblet til helium (han) linje med en nål. Oksygen er spyles ut av en liten sprøyte nål (26 G) som en gass stikkontakt.

Figure 2
Figur 2: Delvis oksygen Press (pO2) og celle-fri hemoglobin etter deoxygenation. (A) PRP og RBCs var deoxygenated for 3, 5, 10, 15, 30 og 50 min. pO2 av prøver ble målt med blod gass analyzer (n = 3). Feilfelt er SEM. representant bilder av nedbryting av PRP + RBCs prøver rørt med (B) eller uten helium (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant VASP Western blot band i prøver av PRP/RBCs forberedt på ulike hematokrit. RBCs ble lagt til PRP 1, 5, 10, 15, 20, 40% hematokrit. Blandinger av PRP + RBCs sentrifugeres på 500 x g i 5 min og lysed med lyseringsbuffer.

Figure 4
Figur 4: representant Western blot band av P-VASPSer239 og VASP i PRP etter eksponering for ingen donor PROLI NONOate. PROLI NONOate (10 M) ble lagt til PRP og inkubert ved 37 ° C i 10 og 30 og 1, 2, 5, 10, 20 og 40 minutter.

Figure 5
Figur 5: VASPSer239 fosforylering avhenger pO2 og hematokrit nivåer. (A) PRP + RBCs (20% hematokrit) var deoxygenated til to forskjellige pO2 nivåer, 40 og 25 mmHg. P-VASPSer239 og VASP ble målt etter inkubasjonstiden for deoxygenated prøver med 10 M nitritt ved 37 C i 10 minutter (B) nitritt (10 M) ble lagt inn deoxygenated PRP + RBCs på 0, 10, 20 og 40% hematokrit (pO2 = 25 mmHg). Fold økt (P-VASPSer239) ble beregnet forhold til kontrollen (PRP + RBCs uten nitritt) for hver hematokrit verdi. Feilfelt = SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Siden blodplater aktiveres lett, forsiktig håndtering av blodplater inneholder eksempler er nødvendig. Rask pipettering og kraftig risting bør unngås. Blodplater-hemmere som prostasyklin (PGI2) kan brukes til å hindre Platederivert aktivering; Dette kan imidlertid påvirke noen signalveier inne blodplater. For utarbeidelse av blodplater pellets, vi legger til ACD Platederivert suspensjoner og bruker lav hastighet sentrifugering.

Nylagde blodplater i PRP har en levetid span, opptil 2 timer. For å oppnå høy reproduserbarhet, bør alle eksperimentene gjøres bare med frisk blodplater og 2t etter blod samling. Presentert dataene ble innhentet med blodplater i PRP, som regnes som mer fysiologiske enn vasket blodplater. Selv om levetid og renhet øke vasket blodplater, gjentatte sentrifugering av vasket blodplater kan føre til spontan aktivisering og dette kan føre til inkonsekvent kvalitet Platederivert forberedelser. PRP er foretrukket over vasket blodplater siden prosedyren er raskere og videre behandling kunne aktivere blodplater. Men i spesielle tilfeller representerer når forstyrrelser av plasma blodpropp faktorer kan forstyrre eksperimentelle oppsett, vaske blodplater løsning å unngå disse problemene.

Oksygen forurensning i deoxygenated prøver er det viktigste avgjørende skrittet for denne analysen. RBCs kan samles og deoxygenated før legges til PRP. Imidlertid øker overføre deoxygenated RBCs risikoen for oksygen forurensning. I tillegg deoxygenation av konsentrert RBCs krever mer tid enn deoxygenation av hele preparatet på den ønskede hematokrit, og lengre eksponering for han gass fører til økte nivåer av celle-fri hemoglobin. Selv om celle-fri hemoglobin kan vaskes av deoxygenated RBCs, må fosfat buffer saltvann eller andre buffere brukes til vask være nøye deoxygenated å hindre oksygen forurensning under sentrifugering. Å forkorte forberedelsesprosessen og unngå unødvendig oksygen forurensning, var hver PRP + RBCs prøve forberedt på den ønskede hematokrit først og deretter deoxygenated før en nitritt.

For å kvantifisere P-VASPSer239 ved Western blot, må RBCs være atskilt av blodplater. VASP uttrykkes i RBCs13, men nivåene er nonsignificant sammenlignet med hemoglobin og mye lavere enn i blodplater. Totalt protein konsentrasjon brukes for lasting kontrollene i de vestlige blots, forstyrrer tilstedeværelsen av RBCs i lysate prøver P-VASP og VASP måling av vestlige blotting. En treg hastighet på dephosphorylation av fosfatase enzymer i blodplater14, P-VASP vedvarende i 10 min (Figur 4) og derfor er det mulig å skille RBCs med sentrifugering før samle Platederivert celle lysates.

EF50 for VASP fosforylering er nesten en størrelsesorden lavere enn EF50 for topp cGMP øke, 0,5 nM og 9 nM, henholdsvis3, som gjør VASP fosforylering en av de mest følsomme metodene for å finne lave mengder nr. Men er VASP fosforylering kurven svar til Nei klokkeformet; en fosforylering nedgang er observert etter en topp på 3-30 nM ingen3. Denne ikke-lineære svar på økende ingen konsentrasjoner gjør VASP uegnet for strenge ingen kvantifisering.

Siden blodplater i PRP har en kort levetid, må analysen gjøres i frisk blodplater innen 2 timer etter tegning blod. Inkonsekvensen av pO2 nivåer etter deoxygenation finner siden deoxygenation av prøver er avhengig av strømningshastighet på helium gass og frekvensen av virvlende flasken. Tid for deoxygenation må derfor å prøve. For måling av P-VASP av vestlige blots, antistoff valget er kritisk, og må bruke en direkte ingen donor som en positiv kontroll til å kontrollere spesifisitet. I tillegg til ingen, P-VASPSer239 i blodplater kan bli fosforylert hemming av phosphodiesterease enzymer og aktivering av protein kinase en sti.

Måling av P-VASPSer239 har noen fordeler over cGMP analysen. cGMP i blodplater har en meget kort halveringstid (mindre enn 10 s) og måling av cGMP krever tillegg av fosfodiesterase hemmer3. CGMP målingen bruker også en ganske dyrt ELISA teknikk. VASP bare kan måles ved en in-house Western blot protokoll og er derfor mer tilgjengelig.

Økt P-VASPSer239 i blodplater ble brukt som en sensor for ingen generasjon av inhalert nitritt i vivo6. Derfor viste vi at det er mulig å bruke P-VASPSer239 i blodplater som en markør av ingen generasjon i vitro og in vivo i blodet og muligens i ulike andre situasjoner. Uvanlig lav EF50 gjør denne metoden en utmerket kandidat for å oppdage tilstedeværelsen av svært lav ingen konsentrasjoner i blodet. Derfor gir denne protokollen en mulighet til å studere ingen generasjon i blodet på ulike fysiologiske stimuli, som under blodet koagulasjonssystemet cascade, økt ren stress eller økt betennelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Alan Schechter er oppført som en co-oppfinner på flere patenter utstedt til National Institutes of Health for bruk av nitritt salter for behandling av hjerte-og karsykdommer. Han får avgifter basert på NIH lisensiering av disse patentene for klinisk utvikling, men ingen andre kompensasjon.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av NIH intramural tilskudd til Dr. Alan N. Schechter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9, (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9, (3), e92435 (2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93, (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7, (1), e30380 (2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273, (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120, (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13, (3), e0193747 (2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370, (3), 184-188 (1995).
Blodplater-basert oppdagelsen av nitrogenoksid i blodet ved å måle VASP fosforylering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter