Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Trombocyt-baserad detektion av kväveoxid i blodet genom att mäta VASP fosforylering

doi: 10.3791/58647 Published: January 7, 2019

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att åtgärda den potentiella användningen av trombocyter som en mycket känslig kväveoxid sensor i blod. Det beskriver inledande trombocytantal förberedelse och användning av nitrit och syrefattigt röda blodkroppar som kväveoxid generatorer.

Abstract

Trombocyter är ansvarig för korrekt blodkoagulation blodkomponenter. Deras funktion är hårt reglerad av olika vägar. En av de mest potenta vasoaktiva ämnen, kväveoxid (NO), kan också fungera som en kraftfull hämmare av trombocytaggregationen. Direkt är ingen upptäckt i blod mycket utmanande på grund av dess höga reaktivitet med cell-fritt hemoglobin som begränsar ingen halveringstid att millisekunden spänna. För närvarande utifrån inga ändringar efter insatser beräknas endast uppmätta förändringar av nitrit och nitrat (medlemmar i nitrat-nitrit-NO metabolism). Men exakt, dessa mätningar är ganska svårt att tolka gentemot faktiska utan ändringar, på grund av den naturligt höga baslinjen nitrit och nitrat i nivåer som är flera tiopotenser högre än förväntade förändringar av inga själv. Därför är utvecklingen av direkt och enkla metoder som gör det möjligt för en att upptäcka nr direkt efterlängtad. Detta protokoll adresser en potentiell användning av blodplättar som en mycket känslig ingen sensor i blod. Det beskriver inledande trombocytantal rika plasma (PRP) och tvättade trombocytantal preparat och användningen av nitrit och syrefattigt röda blodkroppar som ingen generatorer. Fosforylering av VASP på Serin 239 (P-VASPSer239) används för att upptäcka förekomsten av NO. Det faktum att VASP proteinet uttrycks mycket i trombocyter och att det snabbt är fosforyleras då ingen är närvarande leder till en unik möjlighet att använda denna väg att direkt detektera ingen närvaro i blodet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trombocyter är små skivformiga cellen fragment härrör från megakaryocyter som är viktiga för blodets koagulering. Koagulering kaskad initieras av olika bioaktiva molekyler (såsom kollagen eller ADP), släppt efter skadan av kärlväggen. Blod koagulering process kan ändras, bland olika effektorer av kväveoxid (NO). Nej, produceras naturligt av däggdjursceller, är en av de mest mångsidiga fysiologiska signalerna. Det fungerar som en potent vasodilator, signalsubstans och immunmodulator, för att nämna några av dess många funktioner. I blodet, inget också hjälper till att reglera omfattningen av blodproppar genom att hämma trombocytaggregationen. En av de mest sannolika källorna för NO i blodomloppet är nitrit, en oorganisk Jon som har visat sig fungera som en föregångare av NO. Reagera med röda blodkroppar (RBC), nitrit reduceras till NO och deoxyHb oxideras till methemoglobin (metHb)1. NR släppt från röda blodkroppar är vasoaktiva och orsakar vasorelaxation2. Denna nitrit minskning väg är en suppleant ingen generation väg, agerar tillsammans med och kompletterar den klassiska ingen generation sökväg av endothelial kväveoxid syntas på hypoxisk villkor.

Trombocyter själva är inte kunna reducera nitrit till NO men är mycket känsliga för sin närvaro. I intakt trombocyter, inte i nanomolar utbudet ökar cGMP (EG50 = 10 nM) och fosforylering av VASP (EG50 = 0,5 nM)3. Trombocyter kan därför tjäna som ett utmärkt sensor av nitrit minskning av röda blodkroppar och ingen utsättning i blod. Det finns flera metoder som direkt kan mäta omfattningen av trombocytaktivering - såsom aggregometry och thromboelastography (TEG)4,5. Dessa metoder kräver dock dyra specialiserade instrumentering och ganska stora mängder material. Det är också möjligt att övervaka händelser nedströms, efter NO frisätts från RBC, använda ändringarna i trombocytantal ytan proteinuttryck – till exempel P-selektin6. Nej är också känt att öka mängden av cGMP i trombocyter7. Tidigare använde vi cGMP att övervaka något utsläpp i blodet efter nitrit reduktion av syrefattigt RBC8. Detta visade sig vara en mycket känslig metod; cGMP är en kortlivad molekyl dock och dess upptäckt handlar om omfattande arbete. En annan möjlighet, beskrivs i protokollet presenteras, använder fosforylering av de vasodilaterande-stimulerad phospho (VASP)-protein för att upptäcka förekomsten av NO i blod. VASP är ett substrat av protein kinase G aktiveringen, som är fosforyleras vid samspelet med nr via sGC/cGMP vägen9. Detekterbara VASP fosforylering inträffar vid mycket låg nr koncentrationer, som kunde göra blodplättar en mycket känslig detektor av ingen närvaro i blodet. VASP uttrycks mycket i trombocyter, men inte i andra blodkroppar, vilket gör för att följa selektivt de händelser som involverar trombocyter10.

Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att beskriva metoden i detalj för detektion av inga utsläpp i helblod med dess interaktion med trombocyter genom övervakning VASP fosforylering11,12. Den beskrivna metoden möjliggör tidig upptäckt av låg ingen koncentrationer - teoretiskt i intervallet nanomolar vilket gör protokolls känsligare än cGMP beslutsamhet, på grund av användning av standard Western blot teknik kan uppnås i de flesta laboratorium inställningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Obs: Blodprov erhölls från NIH Blodbanken (IRB godkända protokoll: 99-CC-0168).

1. blod provberedning

Obs: För att undvika trombocytaktivering, dra blod sakta och blanda försiktigt med citrat genom att vända rör flera gånger.

  1. Trombocyt-rich plasma (PRP) förberedelse
    1. Rita 30 – 50 mL blod med 20 G eller större diameter nål och tillsätt i ett rör som innehåller natriumcitrat (3,8%) i en 1:9-förhållande eller syra citrat dextros (ACD) (85 mM Trinatriumcitrat, 66,6 mM citronsyra, 111 mM glukos, pH 4,5) i förhållandet 1:6.
    2. Alikvotens 5 mL nyligen uppsamlat helblod in tom 15 mL koniska rören. Centrifugera helblod vid 120 x g under 10 minuter vid rumstemperatur.
    3. Omsorgsfullt samla supernatanten innehållande trombocyter (blodplättar-rich plasma, PRP) från den övre delen av plast överföring pipett.
      Obs: PRP från steg 1.1.3 är klar för användning i experiment eller för vidare bearbetning att förbereda tvättas trombocyter. Den mjuka pelleten som erhållits efter centrifugering (steg 1.1.2) innehåller röda blodkroppar och vita blodkroppar och kan vara ytterligare renas för att få tvättade röda blodkroppar (RBC) — se steg 1.3. Experimentet måste vara färdiga inom 2 h efter rita blod. När samlande PRP (supernatanten), undvika insamling av buffy coat-innehållande leukocyter samlats på gränssnittet PRP/RBC.
  2. Tvättade trombocytantal förberedelse (tillval)
    1. Centrifugera samlat PRP vid 400 x g under 10 minuter vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och hålla trombocyter pellets.
    2. Försiktigt tvätta pellets genom att tillsätta 5 mL CGS buffert (120 mM NaCl, 12,9 mM trinatrium citrat och 30 mM glukos, pH 6,5) och centrifugera vid 400 x g under 10 minuter vid rumstemperatur.
    3. Återsuspendera trombocytantal pellets med 3 mL modifierade Tyrode buffert (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glukos pH 7,4).
    4. Späd blodplättarna (1: 100 – som exempel, 10 µL av trombocyter i 990 µL Rees-Ecker lösning) med Rees Ecker lösning och greve av hemocytometer.
    5. Justera tätheten på trombocyter till 3 x 108 celler/mL genom att lägga till Tyrode buffert.
    6. Inkubera trombocytantal suspensionen vid 37 ° C för 1 h innan experimentet.
      Obs: Tvättade trombocyter är stabila i 5 – 8 timmar vid 37 ° C.
  3. Beredning av tvättade röda blodkroppar (RBC)
    1. Efter insamlingen, Centrifugera mjuk pelleten erhölls i steg 1.1.3 vid 2500 x g under 10 minuter vid rumstemperatur.
    2. Avlägsna supernatanten och tvätta RBC pelleten med 5 mL PBS genom centrifugering vid 2500 x g under 10 minuter vid rumstemperatur. Upprepa detta steg för 3 gånger.
    3. Kassera PBS och använda tvättade röda blodkroppar för ytterligare experiment.

2. syrebrist

  1. Tillsätt 1 mL av blandningen av PRP (bereddes i steg 1.1.4. eller 1.2.4.) och röda blodkroppar (förberedd i steg 1.3.) på den önska hematokrit i en polypropylen flaska försluten med en gummipropp. Exempelvis på 20% hematokrit, tillsätt 200 µL av röda blodkropparna till 800 µL av PRP.
    Obs: Föreslog hämatokrit är från 0% upp till 40%. Använd inte en glasflaska eller kolv som trombocyter följa glasytan.
  2. Stick in nålen ansluten till helium gastank till den stängda flaskan och gör gas utlopp genom kanylen 26 G (figur 1).
  3. Sakta snurra flaskan i rumstemperatur.
    Obs: Tillåt inte han gas bubbla genom blod förberedelser. Långsam gasflödet är att föredra för detta förfarande, och alltför snabb han gasflödet leder till ökad hemolys. Mest effektiva gasflödet behöver bestämmas genom rättegång, eftersom det beror mycket på geometri av den experimentella setup.
  4. Regelbundet följa syrebrist processen genom att mäta partiskt syre trycket (pO2) med en samtidig oximeter.
    Obs: I våra händer, 10 min av syrebrist minskar pO2 till 25 mmHg som krävs för nitrit minskning av röda blodkroppar. fortsätter syrebrist ytterligare minska pO2 till 10 mmHg; men ledde det till ökad hemolys och ökningar av cellfria hemoglobin (figur 2).

3. röda blodkroppar nitrit minskning

  1. Tillsätt 1 mL PBS (pH 7,4) in 0.0345 g av NaNO2 att göra 500 mM stamlösning av nitrit. Späd 500 mM NaNO2 till 250 µM NaNO2 (25 x) av seriell utspädning i PBS (pH 7,4).
  2. Använder en mikrosprutan, injicera nitrit (40 µL) genom septum i syrefattigt provet av PRP och röda blodkropparna för att uppnå slutliga koncentrationer av 10 µM i totalt 1 mL av provet.
    Obs: I detta experiment, de slutliga koncentrationerna av nitrit som används är 10 µM.
  3. Inkubera provet vid 37 ° C i 10 min eller längre.
    Obs: Justera den exakta varaktigheten av RBC inkubation med nitrit som behövs för maximal nitrit minskning för olika typ av experiment.
  4. Ta bort proppen och pipett 1 mL av provet i en mikrocentrifug rör.
  5. Centrifugera vid 200 x g under 3 minuter vid rumstemperatur.
  6. Pipettera 300 µL av trombocyter upphängning från den övre delen av supernatanten och blanda med ACD (pH 6.5) i förhållandet 1:9. Kassera RBC pelleten.
  7. Centrifugera trombocytantal suspensionen vid 500 x g i 4 min i rumstemperatur.
  8. Tillsätt 80 µL iskall lyseringsbuffert (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7,4) innehållande proteashämmare cocktail III (1: 500) till antalet trombocyter pellets.

4. Western Blotting av VASP

  1. Läsa in 15 µg av proteinet från varje prov till 2 separata 10% SDS-PAGE geler.
    Obs: Hårda stripp buffert, som innehåller b-merkaptoetanol, inte ta bort P-VASPSer239 och VASP antikroppar från membranet; Därför bör P-VASP Ser239 och VASP köras separat.
  2. Kör gelen vid 120 V för 1.30 h och överföring till nitrocellulosa membranet.
  3. Blockera icke-specifik bindning med 5% fettfri torr mjölk.
  4. Inkubera över natten vid 4 ° C. membranet med P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000) och GAPDH (1:1, 000)
  5. Inkubera pepparrotperoxidas (HRP) sekundär antikropp med membranet för 45 min i rumstemperatur.
  6. Exponera membranet med en imager maskin och kvantifiera bandet tätheten använder ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Venösa blodprov har pO2 värden mellan 50-80 mmHg. Syrebrist av helium minskar snabbt pO2 till 25 mmHg inom 10 min. ökad syrebrist tid något ytterligare minskningar pO2. Dock ökade tiden för syrebrist leder också till avsevärt ökade nivåer av cellfria hemoglobin (bestäms av samtidig Oximeter, visuellt sett på bild 2 som alltmer rödfärgning av plasma) (Figur 2A-B). Ökad hemolys är inte associerad med omrörning eftersom omrörning utan syrebrist inte inducerar hemolys (figur 2 c).

Vi fann att förekomsten av röda blodkroppar i lyserat prover minskar P-VASPSer239 och VASP upptäcks av Western blotting (figur 3). Därför separat vi först trombocyter och röda blodkroppar innan du kör Western blotting för att påvisa P-VASPSer239 i trombocyter.

För att visa att det finns tillräckligt med tid att skilja röda blodkropparna ur trombocyter utan att påverka VASP fosforylering, använde vi ett kortlivat ingen givare. PROLI NONOate (ingen givare med halveringstiden 1,8 s vid 37 C pH 7,4), snabbt ökat P-VASPSer239 i trombocyter (inom 10 s inkubation). P-VASPSer239 induceras av PROLI NONOate detekteras i 10 min efter inkubering med PRP (figur 4).

Nitrit ökar P-VASPSer239 i trombocyter i närvaro av syrefattigt röda blodkroppar (pO2 25 mmHg). Nitrit-reduktas aktivitet av syrefattigt röda blodkroppar beror på hematokrit och maximal effekt observeras på 20% hematokrit (figur 5).

Figure 1
Figur 1: syrebrist kammare. Blandning av PRP och RBC: er läggs till i en plastflaska som avslutades med en gummi septum. Den stängda flaskan är ansluten till helium (He) linje med hjälp av en nål. Syre är spolas ut genom en liten spruta nål (26 G) som fungerar som en gas utlopp.

Figure 2
Figur 2: Partiell syre tryck (pO2) och cell-fritt hemoglobin efter syrebrist. (A) PRP och röda blodkropparna prover var syrefattigt för 3, 5, 10, 15, 30 och 50 min. pO2 prover mättes av blod gas analyzer (n = 3). Felstaplar är SEM. representativa bilder av supernatanten av PRP + röda blodkropparna prover rörde med (B) eller utan helium (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representant VASP Western blot band i prover av PRP/RBK beredd på olika hematokrit. Röda blodkropparna lades in PRP till 1, 5, 10, 15, 20, 40% hematokrit. Blandningar av PRP + röda blodkroppar var centrifugeras vid 500 x g i 5 min och lyserat med lyseringsbuffert.

Figure 4
Figur 4: representant Western blot P-VASPSer239 och band VASP i PRP efter exponering för ingen givare PROLI NONOate. PROLI NONOate (10 M) lades in PRP och inkuberas vid 37 ° C i 10 och 30 s och 1, 2, 5, 10, 20 och 40 min.

Figure 5
Figur 5: VASPSer239 fosforylering beror på pO2 och hematokrit. (A) PRP + röda blodkroppar (20% hematokrit) var syrefattigt till två olika pO2 nivåer, 40 och 25 mmHg. P-VASPSer239 och VASP mättes efter inkubering av syrefattigt prover med 10 M nitrit vid 37 ° C i 10 min. (B) nitrit (10 M) lades till syrefattigt PRP + röda blodkroppar på 0, 10, 20 och 40% hematokrit (pO2 = 25 mmHg). Fold ökade (P-VASPSer239) beräknades relativt kontrollen (PRP + RBC utan nitrit) för varje hematokrit värde. Felstaplar = SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Eftersom trombocyter aktiveras lätt, skonsam hantering av trombocyt-innehållande prover krävs. Snabb pipettering och kraftig skakning bör undvikas. Trombocythämmare såsom prostacyklin (SGB2) kan användas för att förhindra trombocytaktivering; Detta kan emellertid påverka vissa signalvägar inuti blodplättarna. För beredning av trombocyter pellets, vi lägger till ACD trombocytantal upphängningarna och använder lågt varvtal centrifugering.

Nylagade trombocyter i PRP har en begränsad livslängd livslängd, upp till 2 h. För att uppnå hög reproducerbarhet, bör alla experiment göras endast med färska trombocyter och inom 2 h efter blodtappning. Presenterade uppgifter erhölls med PRP, som anses mer fysiologiska än tvättade trombocyter blodplättar. Även om livslängden och renhet öka för tvättade trombocyter, upprepade centrifugering under beredning av tvättade blodplättar kan leda till deras spontana aktivering och detta kan leda till inkonsekvent kvalitet av trombocyter preparat. PRP är att föredra framför tvättade trombocyter eftersom förfarandet är snabbare och vidare hantering kunde aktivera trombocyter. Dock i särskilda fall representerar när störningar av plasma koaguleringsfaktorerna kunde störa experiment, tvätta trombocyter lösning för att undvika dessa problem.

Syre kontaminering i syrefattigt prover är den viktigaste kritiska steget för denna analys. Röda blodkroppar kan poolade och syrefattigt innan de läggs till Lösenordsreplikeringsprincipen. Överföra syrefattigt röda blodkropparna ökar dock risken för syre kontaminering. Dessutom syrebrist av koncentrerade röda blodkroppar kräver mer tid än syrebrist av full preparatet på den önska hematokrit och längre exponering för han gas leder till ökade nivåer av cellfria hemoglobin. Även om cellfria hemoglobin kan tvättas ur syrefattigt röda blodkroppar, måste den fosfat buffert koksaltlösning eller andra buffertar som tvättvatten vara noggrant syrefattigt hindra syre kontaminering under centrifugeringen. För att förkorta förberedelseprocessen och undvika onödiga syre kontaminering, varje PRP + röda blodkropparna prov utarbetades på den önska hematokrit först och sedan syrefattigt före tillsats av nitrit.

För att kvantifiera P-VASPSer239 genom Western blot, måste röda blodkropparna avgränsas av trombocyter. VASP uttrycks i röda blodkropparna13, men nivåerna är obetydlig jämfört med hemoglobin och mycket lägre än i trombocyter. Eftersom total proteinkoncentration används för inläsning av kontrollerna i de Western blotting, stör förekomsten av röda blodkroppar i lysate prover P-VASP och VASP mätning av Western blotting. På grund av en långsam Defosforylering av fosfatas enzymer i trombocyter14, P-VASP upprätthålls i 10 min (figur 4) och därför är det möjligt att separera röda blodkropparna genom centrifugering före insamling trombocytantal cell lysates.

De EG50 för VASP fosforylering är nästan en storleksordning lägre än EG50 för den topp cGMP ökar, 0,5 nM och 9 nM, respektive3, vilket gör VASP fosforylering en av de mest känsliga metoder för att upptäcka förekomsten av låga mängder NO. VASP fosforylering kurvan svar Nej är dock klockformade; en fosforylering minskning observeras efter en topp på 3-30 nM nr3. Detta ickelinjära svar på den ökade koncentrationer utan gör VASP olämpligt för rigorösa ingen kvantifiering.

Eftersom trombocyter i PRP har en kort livslängd, måste analysen göras i färska trombocyter inom 2 h efter rita blod. Inkonsekvensen i pO2 nivåer efter syrebrist kan hittas eftersom syrebrist av prover är beroende av flödet av helium och andelen snurra flaskan. Tiden för syrebrist måste därför bestämmas genom rättegången. För mätning av P-VASP av Western blotting, antikropp valet är kritisk, och man behöver använda en direkt ingen givare som positiv kontroll för att kontrollera specificitet. Utöver Nej, P-VASPSer239 i trombocyter kan vara fosforyleras av hämning av phosphodiesterease enzymer och aktivering av proteinkinas en väg.

Mätning av P-VASPSer239 har några fördelar framför cGMP assay. cGMP i trombocyter har en mycket kort halveringstid (mindre än 10 s) och mätning av cGMP kräver tillägg av fosfodiesteras hämmare3. CGMP mätning använder också, en ganska dyr ELISA-teknik. VASP helt enkelt kan mätas genom en intern Western blot-protokollet och därför är mer lättillgängliga.

Ökad P-VASPSer239 i trombocyter användes framgångsrikt som en sensor för ingen generation av inhalerade nitrit i vivo6. Därför visade vi att det är möjligt att använda P-VASPSer239 i trombocyter som markör för ingen generation in vitro- och in vivo i blodet och eventuellt i olika andra situationer. De ovanligt låga EG50 gör denna metod en utmärkt kandidat för att påvisa förekomsten av mycket låga koncentrationer utan i blod. Detta protokoll ger därför en möjlighet att studera ingen generation i blod på olika fysiologiska stimuli, såsom under blod koagulationskaskaden, ökad ren stress eller ökad inflammation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr Alan Schechter är listad som en meduppfinnare på flera patent utfärdas till den National Institutes of Health för användning av nitrit salter för behandling av hjärt-kärlsjukdomar. Han får royalties baserat på NIH licensiering av dessa patent för klinisk utveckling men ingen annan ersättning.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av NIH intramurala bidrag till Dr Alan N. Schechter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9, (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9, (3), e92435 (2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93, (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7, (1), e30380 (2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273, (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120, (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13, (3), e0193747 (2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370, (3), 184-188 (1995).
Trombocyt-baserad detektion av kväveoxid i blodet genom att mäta VASP fosforylering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter