Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

doi: 10.3791/58647 Published: January 7, 2019

Summary

Burada, trombosit potansiyelini kullanmak son derece hassas nitrik oksit sensör kan olarak adrese bir iletişim kuralı mevcut. Nitrik oksit jeneratörler ilk trombosit hazırlık ve nitrit ve deoxygenated kırmızı kan hücreleri kullanımını açıklar.

Abstract

Trombosit kan bileşenleri uygun kan pıhtılaşması için sorumlu vardır. Onların işlevi son derece çeşitli yolları tarafından düzenlenir. En güçlü vazoaktif ajanlar, nitrik oksit (NO), biri de trombosit toplama güçlü bir inhibitörü olarak hareket edebilir. Doğrudan hiçbir algılama kan yok half-life milisaniyelik aralığı için sınırlar boş hücre hemoglobin ile onun yüksek reaktivite nedeniyle çok zor olduğunu. Şu anda, müdahaleler sadece tahmin edilir sonra herhangi bir değişiklik, nitrit ve nitrat (nitrat-nitrit-Hayır metabolik yolu üyeleri) ölçülen değişiklikleri dayalı. Ancak kesin, bu ölçümler vis bir vis gerçek doğal olarak yüksek temel nitrit nedeniyle herhangi bir değişiklik yorumlamak ve büyüklükte birkaç emir hiçbir kendisinin beklenen değişiklikler yüksek düzeylere nitrat oldukça zordur. Bu nedenle, bir Hayır doğrudan algılamak olanak sağlayacak doğrudan ve basit yöntem geliştirme gecikmiş olduğunu. Bu iletişim kuralı hiçbir sensör kan trombosit olarak son derece hassas bir potansiyel kullanımı giderir. HİÇBİR jeneratörler ilk trombosit zengin plazma (PRP) ve yıkanmış trombosit preparatları ve nitrit ve deoxygenated kırmızı kan hücreleri kullanımını açıklar. VASP fosforilasyon, serin 239 (P-VASPSer239) No var olup olmadığını belirlemek için kullanılır VASP protein yüksek trombosit ifade edilir ve bu hızla oluşturulduğunda fosforile da mevcuttur aslında doğrudan kan içinde yok olup olmadığını belirlemek için bu yolu kullanmak için eşsiz bir fırsat yol açar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trombosit kan pıhtılaşması için çok önemli megakaryocytes türetilen küçük hücreli disk şeklindeki oluşuyor. Pıhtılaşma cascade vasküler duvar yaralanma sonra yayımlanan çeşitli biyoaktif molekülleri (örneğin, kollajen veya ADP) tarafından başlatılır. Kan pıhtılaşma işlemi, nitrik oksit (NO) tarafından çeşitli effectors arasında değiştirilebilir. Hayır, doğal memeli hücreleri tarafından üretilen, çok yönlü fizyolojik sinyalleri biridir. Bir güçlü vazodilatör, nörotransmitter ve birçok işlevleri bir kaç isim için bağışıklık modülatör olarak davranır. Kan dolaşımında, Hayır da pıhtılaşması kan trombosit toplama engelleyerek ölçüde düzenleyecek yardımcı olur. No kan olasılıkla kaynaklarından biridir nitrit, No bir habercisi hizmet etmek için gösterilen bir inorganik iyon Kırmızı kan hücreleri (RBCs) ile tepki, nitrit Hayır olarak azalır ve deoxyHb methemoglobin (metHb)1' e okside. Hayır RBCs yayımlanan vazoaktif ve vasorelaxation2neden olur. Bu nitrit azaltma yolu bir başka hiçbir üretimi, ile birlikte hareket eden ve klasik üretimi yol hipoksik koşulları, endotelyal nitrik oksit sentaz tarafından tamamlayan yoludur.

Trombosit kendilerini nitrit NO azaltmak mümkün değildir ama onun hazır bulunma için çok hassas. Sağlam trombosit içinde nanomolar içinde Hayır cGMP aralığını artırır (EC50 = 10 nM) ve fosforilasyon VASP (EC50 0,5 = nM)3. Bu nedenle, trombosit mükemmel bir sensör nitrit azaltma RBCs ve hiçbir yayın kana olarak sunabilir. Trombosit aktivasyon - aggregometry ve Tromboelastografi (TEG) gibi ölçüde doğrudan ölçebilirsiniz birkaç yöntem vardır4,5. Ancak, bu yöntem pahalı özel araçları ve malzeme oldukça büyük miktarda gerektirir. Aynı zamanda mümkün olan olayları izlemek aşağı akım, Hayır sonra RBCs, platelet yüzey protein ifadesindeki –6P-selektin gibi değişiklikleri kullanarak üzerinden serbest bırakılır. Hayır da trombosit7cGMP miktarını artırmak için bilinir. Daha önce biz hiçbir yayın içine kan deoxygenated RBC8tarafından nitrit azaltma sonra izlemek için cGMP kullanılır. Bu çok hassas bir yöntem olduğunu kanıtladı; Ancak, cGMP kısa ömürlü bir moleküldür ve geniş iş onun algılama içerir. Başka bir olasılık, sunulan protokolünde açıklanan vazodilatör uyarılmış Fosfo (VASP) fosforilasyon kullanır-Hayır kan içinde var olup olmadığını belirlemek için protein. VASP bir substrat-sGC/cGMP yolu9NO ile etkileşim üzerine fosforile protein kinaz G etkinleştirme var. Algılanabilir VASP fosforilasyon oluşur çok düşük Hayır konsantrasyonları, trombosit kanda herhangi bir varlığı çok hassas bir dedektör yapabiliriz. VASP yüksek trombosit ifade edilir, ancak diğer kan hücreleri seçerek trombosit10içeren olayları takip etmek sağlayan değil.

Bu iletişim kuralının temel amacı ayrıntılı yöntemi tam kan trombosit ile etkileşimi VASP fosforilasyon11,12izleyerek kullanarak hiçbir sürümde tespiti için tarif etmektir. Açıklanan yöntemi düşük erken teşhis yok konsantrasyonları - teorik olarak mevcut iletişim kuralı standart Western blot ulaşılabilir teknikleri çoğu laboratuvar kullanımı nedeniyle cGMP belirlenmesi daha duyarlı kılan nanomolar aralığında sağlar Ayarlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Not: Kan örnekleri NIH Kan Bankası'ndan elde (IRB onaylı protokolü: 99-CC-0168).

1. kan örnek hazırlama

Not: Trombosit aktivasyon önlemek için yavaş yavaş kan alıp birkaç kez tüp ters çevirme tarafından sitrat ile karışımı yavaşça.

  1. Trombosit açısından zengin plazma (PRP) hazırlık
    1. 30 – 50 mL kan bir 20 G veya daha büyük çaplı iğne kullanarak çizmek ve 1:9 oranı veya asit sitrat Dekstroz (ACD) (85 mM TRISODYUM sitrat, 66.6 mM sitrik asit, 111 mM glikoz, pH 4.5) 1:6 oranında sodyum sitrat (% 3.8) içeren bir tüp içine ekleyin.
    2. Aliquot 5 mL taze toplanan tam kan boş 15 mL konik tüpler içine de. Tam kan, 120 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
    3. Dikkatle trombosit (trombosit açısından zengin plazma, PRP) içeren süpernatant üst kısımlarından bir plastik transfer pipet ile toplamak.
      Not: 1.1.3. adımdaki PRP deneylerde kullanılmaya hazır durumda olan veya daha fazla işlem için hazırlamak için trombosit yıkanmış. Santrifüjü (adım 1.1.2) kırmızı kan hücreleri ve beyaz hücreler içerir ve daha fazla olabilir elde edilen yumuşak Pelet yıkanmış kırmızı kan hücreleri (RBC) elde etmek için saf — adım 1.3. görmek Deneme kan çizdikten sonra içinde 2 h bitmiş olması gerekir. PRP (süpernatant) toplarken, PRP/RBC arabirim üzerinde birikmiş buffy kat içeren lökosit topluluğu kaçının.
  2. Yıkanmış trombosit hazırlık (isteğe bağlı)
    1. Santrifüj PRP 400 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de toplanan. Süpernatant atın ve trombosit granül koruyun.
    2. Yavaşça granül 400 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de 5 mL CGS tampon (120 mM NaCl, 12.9 mM TRISODYUM sitrat ve 30 mM glikoz, pH 6,5) ve santrifüj de ekleyerek yıkayın.
    3. Trombosit granül değiştirilmiş Tyrode arabellek (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glikoz pH 7,4) 3 mL ile resuspend.
    4. Trombosit seyreltik (1: 100 — örnek olarak, trombosit 990 µL Rees-Ecker çözüm içinde 10 µL) Rees Ecker çözüm ve hemasitometre olarak say.
    5. Trombosit 3 x 108 hücre/ml yoğunluğu Tyrode arabelleği ekleyerek ayarlayın.
    6. Trombosit süspansiyon için 1 h 37 ° C'de deneme başlamadan önce kuluçkaya.
      Not: Yıkanmış trombosit için 5-8 h 37 ° C'de sabit
  3. Yıkanmış kırmızı kan hücreleri (RBC) hazırlanması
    1. Toplandıktan sonra adım 1.1.3 2500 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de elde yumuşak Pelet santrifüj kapasitesi.
    2. Süpernatant atın ve 2500 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de RBC Pelet PBS 5 mL aralıklarla tarafından ile yıkayın. Bu adım için 3 kez tekrarlayın.
    3. PBS atın ve yıkanmış RBCs daha fazla deneyler için kullanın.

2. deoxygenation

  1. 1 mL PRP karışımı ekleyin (1.1.4 adımda hazırlanan. veya 1.2.4.) ve (adım 1. 3'hazır.) RBCs, kauçuk tıpa ile kapalı bir polipropilen şişe içine istenilen hematokrit. Örneğin, % 20 hematokrit RBCs 200 µL PRP 800 µL için ekleyin.
    Not: Hematocrits % 0 önerilir % 40. Trombosit cam yüzey için uygun bir cam şişe veya balon kullanmayın.
  2. Helyum gaz tankı için kapalı şişe içine bağlı iğne takın ve gaz çıkış 26 G iğne (Şekil 1) ekleyerek olursunuz.
  3. Yavaş yavaş, oda sıcaklığında şişe girdap.
    Not: O gaz kalibre edilir kabarcık izin vermez. Yavaş gaz akışı Bu yordam için tercih edilir ve aşırı hızlı o gaz akışı için artan hemoliz yol açar. Son derece deneysel Kur geometri üzerinde bağlı olarak deneme tarafından belirlenecek en verimli gaz akışı gerekir.
  4. Düzenli olarak bir eş oksimetre kullanarak kısmi oksijen basıncı (pO2) ölçerek deoxygenation süreci izler.
    Not: Bizim ellerimizde 10 dk deoxygenation azalır pO2 için nitrit azaltma tarafından RBCs. deoxygenation devam gerekli olan 25 mmHg daha fazla 10 mmHg pO2 azaltmak yaptı; Ancak, bu artan hemoliz ve boş hücre hemoglobin (Şekil 2) artışlara yol açtı.

3. kırmızı kan hücresi nitrit azaltma

  1. PBS (pH 7,4) 1 mL NaNO2 500 mM hisse senedi çözümü nitrit yapmak 0.0345 g içine ekleyin. 500 mM NaNO2 250 µM NaNO2 (25 x) tarafından seri seyreltme PBS (pH 7,4) oranında seyreltin.
  2. Bir microsyringe kullanarak, nitrit (40 µL) septum son toplam 1 ml örnek 10 µM konsantrasyonları elde etmek için PRP ve RBCs deoxygenated örneği içine enjekte et.
    Not: Bu deneyde kullanılan nitrit son konsantrasyonları 10 µM var.
  3. Örnek 37 ° C'de 10 dakika veya daha uzun kuluçkaya.
    Not: Farklı tür deneyler için maksimal nitrit azaltılması için gerekli nitrit ile RBC kuluçka tam süresini ayarlayın.
  4. Tıpa ve pipet 1 mL örnek bir microcentrifuge tüpüne kaldırın.
  5. Vasıl 200 x g oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.
  6. 300 µL trombosit süspansiyon üst bölümünden süpernatant pipet ve bir 1:9 oranı ACD (pH 6,5) ile karıştırın. RBC Pelet atmak.
  7. Trombosit süspansiyon vasıl 500 x g için oda sıcaklığında 4 dk santrifüj kapasitesi.
  8. Buz gibi lizis arabelleği (150 mM NaCl, 50 mM Tris, %0,5 NP-40, pH 7,4) 80 µL eklemek proteaz inhibitörü içeren kokteyl III (1:500) trombosit unsurlardandır.

4. Batı VASP kurutma

  1. Her örnek protein 2 ayrı % 10 SDS-sayfa jeller için yük 15 µg.
    Not: B-mercaptoethanol içerir, sert sıyırma arabellek P-VASPSer239 ve VASP antikorları membran kaldıramazsınız; Bu nedenle, P-VASP Ser239 ve VASP ayrı ayrı çalıştırılması gerekir.
  2. Jelleri 120 V 1,30 h ve transferi nitroselüloz membran için çalıştırın.
  3. Blok non-spesifik bağlama %5 yağsız Kuru süt ile.
  4. Gecede 4 ° C'de için P-VASPSer239 (1:500), VASP (1:1, 000) ve GAPDH (1:1, 000) ile membran kuluçkaya
  5. 45 dakika oda sıcaklığında membran ile horseradish peroksidaz (HRP) ikincil antikor kuluçkaya.
  6. Membran Imager makine ile açığa ve ImageJ kullanarak bant yoğunluğunu ölçmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PO2 değerleri arasında 50-80 mmHg venöz kan örnekleri var. Deoxygenation helyum tarafından hızla pO2 10 en az artan deoxygenation zaman biraz daha fazla düşüşler pO2içinde 25 mmHg olarak azalır. Ancak, deoxygenation artan zaman da boş hücre hemoglobin (görsel olarak plazma giderek kırmızı rengi Şekil 2 ' de görülen ortak oksimetre tarafından belirlenen) önemli ölçüde yüksek düzeyde yol açar (Şekil 2A-B). Artan hemoliz deoxygenation olmadan karıştırma hemoliz (Şekil 2C) teşvik değil çünkü karıştırma ile ilişkili değildir.

Biz RBCs huzurunda lysed örnekleri P-VASPSer239 ve Western blot (Şekil 3) tespit VASP azalır bulundu. Bu nedenle, biz ilk trombosit ve RBCs P-VASPSer239 trombosit içinde algılamak için Batı lekesi çalıştırmadan önce ayırın.

VASP fosforilasyon etkilemeden trombosit dışarı RBCs ayırmak için yeterli zaman olduğunu göstermek için kısa ömürlü bir donör kullandık. PROLI NONOate (1,8 yarı ömrü ile donör s 37 C pH 7,4), hızla P-VASPSer239 trombosit arttı (10 içinde s, kuluçka). P-VASPSer239 PROLI NONOate tarafından indüklenen için 10 dk sonra PRP (Şekil 4) ile kuluçka algılanır.

Nitrit P-VASPSer239 deoxygenated RBCs (pO2 25 mmHg) varlığında trombosit artırır. Nitrat redüktaz aktivitesini deoxygenated RBCs hematokrit üzerinde bağlıdır ve maksimum etkisi % 20 hematokrit (Şekil 5) görülmektedir.

Figure 1
Şekil 1: Deoxygenation odası. PRP ve RBCs karışımı bir lastik septum ile kapalı bir plastik şişe içine eklenir. Kapalı şişe bir iğne kullanarak helyum (He) hattına bağlanmıştır. Oksijen gaz çıkış hizmet veren bir küçük şırınga iğne (26 G) tarafından aktarılmadan.

Figure 2
Resim 2: Kısmi oksijen basıncı (pO2) ve boş hücre hemoglobin deoxygenation sonra. (A)PRP ve RBCs örnekleri deoxygenated örnekleri 3, 5, 10, 15, 30 ve 50 dk. pO2 ölçülen için kan gaz Çözümleyicisi tarafından (n = 3). Hata çubukları (Bile) karıştırılır PRP + RBCs örneklerinin süpernatant SEM temsilcisi resimleri vardır ya da helyum (C) olmadan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: temsilcisi VASP Western blot bantlarında örnekleri çeşitli hematokrit hazırlanan PRP/RBCs. RBCs olduklarını da sözlerine ekledi PRP 1, 5, 10, 15, 20, %40 hematokrit. PRP + RBCs karışımları 500 x g 5 min için de centrifuged ve lizis arabellek ile lysed.

Figure 4
Şekil 4: P-VASPSer239 ve PRP VASP temsilcisi Western blot bantları donör PROLI NONOate maruz kaldıktan sonra. PROLI NONOate (10 M) PRP eklendi ve 10 ve 30 s ve 1, 2, 5, 10, 20 ve 40 dk 37 ° C'de inkübe.

Figure 5
Şekil 5: VASPSer239 fosforilasyon pO2 ve hematokrit düzeyleri üzerinde bağlıdır. (A)PRP + RBCs (% 20 hematokrit) iki farklı pO2 düzeylere deoxygenated 40 ve 25 mmHg. P-VASPSer239 ve VASP deoxygenated örnekleri 10 M nitrit 37 c 10 dk. (B) ile kuluçka sonra ölçülen nitrit (10 M) 0, 10, 20 ve % 40 hematokrit eklendi deoxygenated PRP + RBCs (pO2 25 mmHg =). Kat arttı (P-VASPSer239) denetime (nitrit olmadan PRP + RBCs) her hematokrit değeri göre hesaplanır. Hata çubukları SEM = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trombosit kolayca etkinleştirilir beri trombosit içeren işlenmesi nazik örnekleri gereklidir. Hızlı pipetting ve güçlü sallayarak kaçınılmalıdır. Trombosit inhibitörleri gibi prostacyclin (PGI2) trombosit aktivasyon önlemek için kullanılabilir; Ancak, bu bazı sinyal yolları içinde trombosit etkileyebilir. Trombosit granül kursları, ACD trombosit süspansiyonlar ekleyebilir ve düşük hızlı Santrifüjü kullanabilirsiniz.

Taze hazırlanmış trombositlerin PRP yayılan, en fazla 2 saat sınırlı bir ömrü var. Yüksek tekrarlanabilirlik elde etmek için tüm deneyler sadece taze trombosit ve 2 saat içinde kan toplandıktan sonra yapılmalıdır. Sunulan veri trombosit yıkanmış trombosit daha fizyolojik olarak kabul edilir PRP ile elde edilmiştir. Her ne kadar ömrü ve saflık için yıkanmış trombosit artırmak, yıkanmış trombosit hazırlanması sırasında yinelenen Santrifüjü kendi kendiliğinden harekete geçirmek yol açabilir ve bu trombosit preparatları tutarsız kalitesine neden. PRP daha hızlı bir yöntemdir ve daha fazla işleme trombosit etkinleştirmek beri yıkanmış trombosit tercih edilir. Plazma kan pıhtılaşma faktörleri girişim deneysel Kur'a engelleyebilir zaman ancak, belirli durumlarda, trombosit yıkama bu sorunları önlemek için çözümü temsil eder.

Oksijen kirlenme deoxygenated örneklerinde bu tahlil için en önemli kritik adımdır. RBCs havuza alınmış ve olması için PRP eklenmeden önce deoxygenated. Ancak, deoxygenated RBCs aktarma oksijen bulaşma riskini artırır. Buna ek olarak, deoxygenation konsantre RBCs, istenilen hematokrit, tam hazırlık deoxygenation daha fazla zaman gerektirir ve o gaz için daha uzun pozlama için boş hücre hemoglobin düzeyinin yol açar. Ne kadar boş hücre hemoglobin-ebilmek var olmak yıkamak dışarı deoxygenated RBCs, fosfat tampon serum veya yıkamak için kullanılan diğer arabellekleri Santrifüjü sırasında oksijen kontaminasyonu önlemek için dikkatli bir şekilde deoxygenated olması gerekir. Hazırlık süreci kısaltmak ve gereksiz oksijen kirlenmesini önlemek için her PRP + RBCs örnek istenilen hematokrit ilk hazırlanan ve nitrit toplamadan önce sonra deoxygenated.

P-VASPSer239 tarafından Western blot ölçmek için RBCs trombosit dışında ayrılması gerekir. VASP RBCs13' te ifade edilir, ancak düzeyleri için hemoglobin karşılaştırıldığında öðe1 ve çok daha düşük trombosit içinde. Toplam protein konsantrasyonu Batı lekesi denetimlerde yüklemek için kullanıldığından, lysate örnekleri RBCs varlığında VASP ölçüm ile P-VASP Western blot tarafından etkilemektedir. Nedeniyle dephosphorylation fosfataz enzim trombosit14tarafından yavaş bir hızla, P-VASP kadar 10 dakikadır (Şekil 4) aynı ve bu nedenle trombosit hücre lysates toplama önce Santrifüjü tarafından RBCs ayırmak mümkündür.

Tepe cGMP artırmak için 0,5 VASP fosforilasyon EC50 neredeyse bir büyüklük EC50 ' den daha düşük olduğunu nM ve 9 nM, sırasıyla VASP fosforilasyon olup olmadığını belirlemek için en hassas yöntemlerden birini yapan3, No düşük miktarda Ancak, Çan şeklinde yanıt Hayır olarak VASP fosforilasyon eğrisi; fosforilasyon azalma yok33-30 nm'de peaking sonra görülmektedir. Bu doğrusal olmayan yanıt-e doğru Hayır konsantrasyonları artan VASP için uygun olmayan sıkı yapar hiçbir miktar.

Trombositlerin PRP içinde kısa bir yaşam süresi olduğundan, tahlil kan çizdikten sonra 2 saat içinde taze trombosit yapılmalıdır. Örnekleri deoxygenation helyum gazı debisi ve şişe dönen oranı bağlıdır beri pO2 düzeyleri deoxygenation sonra tutarsızlık bulunabilir. Bu nedenle, deneme tarafından belirlenecek deoxygenation için zamana ihtiyacı var. P-VASP ölçüm tarafından Batı lekesi için antikor seçim çok önemlidir ve bir doğrudan donör özgüllüğü kontrol etmek için olumlu bir denetim olarak kullanmak gerekiyor. Hayır, P-VASPSer239 trombosit yanı sıra phosphodiesterease enzim inhibisyonu ve protein kinaz bir yol aktivasyonu tarafından fosforile.

P-VASPSer239 ölçümü cGMP tahlil üzerinde bazı avantajları vardır. cGMP trombosit içinde olan bir çok kısa yarılanma ömrü (az 10 s) ve cGMP ölçümü fosfodiesteraz inhibitörü3eklenmesi gerektirir. Ayrıca, cGMP ölçüm oldukça pahalı bir ELISA tekniğini kullanır. VASP sadece bir in-house Western blot protokolü ile ölçülebilir ve bu nedenle kullanıma hazır.

Trombosit artan P-VASPSer239 şekilde bir sensör hiçbir oluşturma için inhale nitrit vivo6tarafından kullanıldı. Bu nedenle, hiçbir oluşturma tüp bebek ve içinde vivo kan ve muhtemelen diğer çeşitli durumlarda bir işaretleyici olarak trombositlerin içinde P-VASPSer239 kullanmak mümkün olduğunu gösterdi. Olağandışı düşük EC50 bu yöntem çok düşük varlığı hiçbir konsantrasyonu kanda tespit için mükemmel bir aday yapar. Bu nedenle, bu iletişim kuralı hiçbir oluşturma, çeşitli fizyolojik uyaranlar, kan gibi sırasında kan pıhtılaşması cascade, çalışma için bir olasılık sırf stres arttı veya iltihap artış sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Alan Schechter Ulusal Sağlık Enstitüleri kalp-damar hastalıklarının tedavisi için nitrat tuzları kullanımı için verilen birkaç patent üzerinde ortak bir mucit olarak listelenir. Bu patentler için klinik geliştirme ama diğer tazminat NIH lisans dayalı telif alır.

Acknowledgments

Bu eser NIH intramural hibe Dr Alan N. Schechter tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9, (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9, (3), e92435 (2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93, (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7, (1), e30380 (2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273, (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120, (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13, (3), e0193747 (2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370, (3), 184-188 (1995).
Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter