Summary
これは、肝臓から組織外細胞小胞(EV)を分離するためのプロトコルです。このプロトコルは、コラゲナーゼ灌流を含む2段階のプロセスを記述し、その後、肝臓組織EVを分離するための差動超遠心分離を行う。
Abstract
細胞外小胞(EV)は、多くの異なる細胞型から放出され、すべてではないにしても、ほとんどの体液で検出することができる。EVは、RNAやタンパク質などの生理活性分子を細胞間でシャトルすることで、細胞間のコミュニケーションに参加できます。EVの研究のほとんどは、細胞培養モデルや体液から分離されたEVで行われています。生理過程への貢献と疾患の変化を研究するために、組織からEVを分離することに関心が高まっている。組織からの十分な収率を持つEVの分離は、細胞損傷なしで組織解離の必要性のために技術的に困難です。この方法は、マウス肝組織からのEVの単離のための手順を説明する。この方法は、その中でコラーゲナーゼ消化から始まり、その後に差動超遠心分離を開始する2段階のプロセスを含む。コラゲナーゼを用いた組織灌流は、得られたEVの収率の増加による肝組織の機械的切断または均質化に対する利点を提供する。この2段階のプロセスを使用してEVを肝臓から分離することは、組織EVの研究に役立ちます。
Introduction
細胞外小胞(EV)は、体内の多くの異なるタイプの細胞から放出される膜結合小胞である。EVには、RNA、DNA、タンパク質を含む分子の貨物が含まれています。ある細胞から別のセルへのEVによるこの貨物の移動は、組織内の細胞が相互に通信する1つのメカニズムとして仮定される1.通常の健康および疾患におけるEVの貨物または役割に関する情報の大半は、培養中の細胞から得られたか、循環または他の体液2から収集されたEVに関する研究から導き出された。生体内での生理的役割を理解するためには、EVのすべての集団を捕捉し、細胞の損傷や汚染を避ける組織EVの分離には、堅牢な方法が必要である3。ここに記載される方法の全体的な目標は、組織EVをマウス肝臓から分離することである。
肝臓のほとんどの細胞型はEVを生産することが示されており、EVベースのシグナリングの研究は、肝疾患の基礎知識と理解を進めています。しかし、組織内の異なる細胞タイプからのEVの組み合わせの影響は部分的にしか理解されていません。肝臓組織からのEVの分離は、組織内のEVのその他の貢献を理解するために必要である。本明細書に記載されるアプローチは、組織の解離を増強し、細胞損傷を最小限に抑えるための2段階の灌流に基づいている。続いて、EVは解離された肝組織から単離される。肝細胞の単離のための2段階灌流を用いたアプローチは、1950年代初頭から4.肝細胞単離のためのこれらの方法は、改変され、継続的に改善され、現在、培養中の肝細胞の単離、細胞懸濁液中、および組織5、6、7からの標準的なアプローチである。最初のステップでは、肝臓は、カルシウムフリーバッファー、ハンクのバランス塩溶液(HBSS)との非循環灌流に供される。第2のステップでは、肝臓は、脱モソマル細胞間接合のさらなる分離のために細胞外マトリックスを溶解するためにコラゲナーゼを注入する。コラーゲン溶解に最適な治療時間は7~10分です。治療期間が短いと、不完全な溶解を引き起こし、肝臓の細胞接触を保持しますが、長い期間は肝臓の損傷や門脈の破壊を引き起こす可能性があります。その後、EVは差動遠心分離を使用して分離され、細胞や細胞の破片を除去します。これは、さらなる下流の分析や研究に使用することができる高収率でのEVコレクションをもたらします。
Protocol
動物を含むすべての研究は、メイヨークリニック機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。
1. ベンチの準備
- 水風呂を準備し、37 °Cに設定します。その他の必要な機器とセットアップを図1に示します。
- 100mgのコラゲナーゼ型IVを測定し、水浴中のHBSSの100 mLを含む125mLフラスコ(40°C)に加えます。フラスコの液体を旋回してコラゲナセが溶解していることを確認し、フラスコが水浴中に完全に沈んでいることを確認します。効率を上げるために、コラゲナーゼが瞬時に溶解しているように見えても、少なくとも30分間溶解できるようにします。
- 40°Cの水浴にHBSSの50 mLを含む125 mLフラスコを水没します。これは、初期フラッシュに使用されます。
- 70%のエタノールでハサミや鉗子などのすべての機器の表面をスプレーします。いくつかのきれいな綿棒を準備します。
- ポンプを通して70%エタノールを動かしてポンプのチューブをすすいで、流水で2回すすいで残留エタノールを取り除きます。
- ラボベンチに吸収性ベンチパッドを置き、ハードボックス容器を上に置きます。これは、マウス灌流中に余分な液体を含むために必要になります。ポリスチレンフォームパッドをアルミホイルで包み、容器の中に入れます。
- ベンチの近くに無菌10cmの培養皿を置きます。これは、灌流が完了した後、消化された肝臓を保持するために使用されます.
- あらかじめ無菌培養皿にコラゲナーゼ培地(ステップ1.2)を10mL注ぎます。
- 翼付き採血セットを使用して、23ゲージをポンプチューブの自由端に接続します(蝶カニューレから翼を切り取ることで、より良い取り扱いにつながります)。採血のカニューレの先端が満たされるまで渡します。
2. 動物の準備
- イソファルランを使用して麻酔を開始する前に、十分な量の供給ガスが手順の間利用可能であることを確認してください。1-2 Lで誘導室への酸素(O2)供給をオンにし、流量計を使用して2〜4%の間でイソファランをオンにします。
- 誘導室にマウスを入れ、上部のドアを閉じます。マウスがリカンベントになるまで監視します。
注:チャンバー内のガスは、マウスを数分間麻酔状態に保ちます。 - アルミホイルで包まれたポリスチレンフォームパッドの上にマウスを置きます。誘導室からノセコーンへの流れを切り替えます。麻酔が十分であることを確認してください。マウスが反応し始めた場合は、完全に麻酔が整うまで、鼻コーンで軽く拘束します。
- 手順中に呼吸と刺激に対する応答を監視することにより、麻酔を確保します。適切な麻酔を確保するために、必要に応じてレートフローメーターを調整します。足は麻酔下のピンチテストに反応しなでなければならない。追加の詳細は、動物の世話のための実験室ガイドから得られるかもしれません。
- マウスの 4 本の四肢すべてをテープまたはピン留めします。
- 70%のエタノールをスプレーし、ガーゼとアルコールパッドで拭き取ることによって、腹部の上に皮膚をきれいにします。この手順は、マウスファーからの汚染を避けるために重要です。
- 生殖不能のはさみを使用して、前部から骨盤の骨まで皮膚を広く開いたカットを行います。内臓を切らないのは注意が必要です。綿の先端のアプリケーターを使用して、入門静脈(PV)と劣った静脈カバ(IVC)を静かに露出させ、動物の左側に腸を置き換えます。
3. カネレーションと灌流(0.5時間)
- 湾曲した鉗子を使用して、ポータル静脈の下に糸を置き、結び目をゆるく結び、カナンテーション後にしっかりとチンチングを準備します。
- カニューレ(採血セットから23G)を合字の下5~10mmのポータル静脈に挿入します。最初のポータルブランチを過ぎてカニューレを挿入しないでください。カニューレはストッパーの結び目を使用して糸で固定または固定することができる。
- 低流量(1-2 mL/min)でHBSSに注入するポンプを開始します。カンヌレーションが成功することが確認されると、肝臓はブランチを開始します。
- IVCをカットして圧力を和らげ、肝臓内の過剰な流体を排出できるようにします。これは、カニューレが移動しないように、他の手で演算子を使用して行うのが最適です。
- ゆっくりと流量を8 mL/minに増加させ、次の5分にわたって肝臓を通してHBSSの全体の50 mL容積を使用して灌流を完了する。
- HBSSが不足し始める直前に、培地を含むコラゲナーゼ(ステップ1.2)をビーカーに変更します。気泡が存在しないことを確認し、媒体を変更するときに肝臓に流れ込まないようにしてください。
- 鉗子で締め金で止めることで、5秒間隔でIVCに過渡圧力を加えます。これは、肝臓が膨らみ、組織の消化と解離(7-8分)を助ける原因となります。消化が進むにつれて、肝臓は膨らみ、白くなる。肝臓は、元のサイズの約2倍に均一に膨れ上がることができます。
- ポンプをオフにし、消化が完了したらカニューレを取り除きます。肝臓の消化の完了は、マウスのサイズと肝臓の状態に依存します。綿の先端のアプリケーターを使用して肝臓を穏やかに調べている場合、肝臓のへこみが観察されます。
- 胆嚢を肝臓から取り除き、引き裂かないように注意してください。洗ったはさみと鉗子を使って、マウスから肝臓をリン酸緩衝生理食(PBS)を含む無菌10cm培養皿に抽出し、表面洗浄を行います。肝臓をコラーゲナーゼ培地を含む無菌10cm培養皿に慎重に移す(ステップ1.8から)。これは、マウスの血液と胆汁からの汚染を避けるための重要なステップです。
- 肝臓から細胞を穏やかに振りながら、2つのきれいな鉗子で肝臓をつかんで引き裂きます。この場合、メディアは曇ります。すべての肝細胞は、結合組織と血管組織を残して、離れて振ることができます。
- 肝臓の未消化部分が振り落とされるまで、3 mL注射器を使用して細胞溶液を何度もトリチュレートします。70 μmのナイロン細胞ストレーナーを備えた50 mL円錐管に注ぎ、未消化結合組織を濾過します。残りの細胞を収集し、50 mL円錐形のチューブを埋めるためにHBSSで皿を洗います。
- 50 mLの円錐形チューブを50×gで50×10分間、4°Cで10分間静かに遠心分離します。
- 上清を新しい50 mL円錐管に移します。
4. EVの分離(5時間)
- 上清を300xgで遠心分離し、4°Cで10分間使用します。 上清を新しい50 mL円錐形チューブに移します。
- 上清を2000xgで20分間4°Cで遠心分離し、細胞の破片や凝集体を除去します。
- 上清を丸底管に移し、上清を10,000 x gで4°Cで70分間遠心分離します。
- 上清を回収し、4°Cで70分間100,000 x gでポリカーボネート超遠心管と遠心分離機に入れます。
- その後、PBSで再中断することによって洗浄される超遠心管にペレットを収集します。上清をさらに100,000 x gで遠心分離し、4°Cで70分間使用します。
- 細胞ナノベシクルからなる最終ペレットは、実験に直接使用したり、1000μLのPBSで再懸濁したり、-80°Cで保存することができます。
5. 分離の質と収率の評価
- ナノ粒子トラッキング解析または計測器メーカーのプロトコルに従って抵抗パルス検出を行うサイズ分布と濃度を評価します。
- 特定の実験ニーズに基づいて、ショ糖勾配またはクッションの添加、免疫親和性技術、またはサイズ排除クロマトグラフィーなどの様々なアプローチによって、特定の小胞集団のさらなる分離および精製を行う。
Representative Results
これらの絶縁に必要な装置は標準的な実験室装置から成り、これは比較的簡単で、費用効果が大きいアプローチをする。単離は、12〜30週齢の雄および雌のBalb/cまたはFVBマウスから行われた。マウスを保持するトレイは、灌流中に余分な液体を収集するハードウォール容器内にアルミ箔が並んでいます。HBSSまたはコラゲナーゼ含有培地を含むフラスコは、使用する準備ができて水浴(40°C)に沈められます。2つの生殖不能の10 cm培養皿が使用される。1つはPBSによる表面洗浄に必要であり、もう1つは結合組織成分からの肝細胞分離のために必要である。
この方法では、肝臓は、劣った静脈カバからのカンヌレーションを優先してポータル静脈を介して非連続的な方法で浸透される。代替および一般的に使用される灌流アプローチは、劣った静脈カバをカナレートし、排水のためのポータル静脈を切断することによって逆行灌流を実行することです。しかし、ポータル静脈のカニテーションはアクセスしやすく、ポータル静脈が肝臓8に直接供給するので、肝臓への短い距離を伴う。カナンテーションの挿入ポイントの選択は、最適な成功のために重要です(図2)。カニューレは胃と膵静脈の枝を越えて配置されますが、最初のポータルブランチ(右および左肝門静脈)を越えられません。ポータル静脈内の最適な挿入位置が特定されると、湾曲した鉗子を使用して、ポータル静脈の下に糸を配置し、緩い結び目を結び付けます。カニューレの針は、針が落ちるのを止めるためにストッパー結び目を使用して糸で固定されています。
図3は、肝臓組織EV単離に対する差動遠心分離の全体的な処理スキームの概要を説明する。超遠心分離は細胞、破片および他の不純物を取除く。最初の4つの遠心分離ステップ(50 x g、300 x g、2,000 x g、10,000 x g)は、それぞれ肝細胞、無傷の他の細胞、死んだ細胞、または細胞破片を除去するように設計されています。(図4Aおよび4B)。 これらのステップの後、超遠心分離は再び100,000 x gでペレットを収集するために行われる(図4C)。ペレットをPBSで再停止させて洗浄し、100,000 x gで最終的な超遠心分離を行う。超遠心分離後のペレットは、条件付き培養培養培養機からのEVと比較して、この手順では絶対に目に見え、粘性があります。茶色の凝集体が見えなくなり、完全に溶解するまで、何度もピペッティングが必要です。最終的なペレットは1000 μLのPBS(図4D)で再懸濁される。超遠心分離は、不純物やその他の可溶性汚染物質をプラズマから除去し、機能的な実験結果に影響を与える可能性があります。遠心分離は4°Cで行われる。
マウス肝臓から、この方法は、ナノ粒子追跡分析(NTA)によって決定されるmL当たり平均3.46 x 1012粒子で1.74から4.00 x 1012の範囲の組織EV濃度を得る(図5)。単離された肝組織EVの平均サイズは157.7nmで、モードサイズは144.5nm、EVサイズはNTAで100~600nmです。EVの収量は、肝重量や増温または超遠心分離ステップ内の損失などの要因に依存します。
図 1:ベンチの準備。材料とその位置は次のとおりです: (A) ポンプ, (B) HBSSと水吸引ポートを含む125 mLフラスコ, (C) イソムラン蒸気器に接続されたノーズコーン, (D) 針で接続するポンプの水排気ポート, (E) トレイ内部にアルミニウム箔が並ぶ硬い壁容器、および(F)コラゲナーゼ培地をあらかじめ注ぐ10cm培養皿。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:カネレーション部位。マウス腹部の解剖学が示されている。曲面鉗子を使用して、糸はポータル静脈(PV)の下に置かれ、緩い結び目は結ばれている。挿入位置は肝臓の近くにあり、合字の下5〜10mmであるが、最初のポータルブランチ(左右肝ポータル静脈)を超えていない。カニューレはストッパーの結び目が付いている糸を使用して固定されるか、または締め付けされる。この結び目は、カニューレが脱落した場合のPV位置のマーカーとして機能します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 遠心分離ステップの概略図。目標は、不要なセルやその他のコンポーネントを除去し、EVを分離することです。最初の4つの遠心分離ステップは、差動遠心分離を使用して肝細胞および他の細胞、死んだ細胞、または細胞破片を除去するように設計されている。これらのステップの後、EVのペレットを収集するために100,000 x gで超遠心分離を行います。ペレットをPBSで再停止させて洗浄し、100,000 x gで最終的な超遠心分離を行う。すべての遠心分離ステップは4 °Cで行われる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 差動遠心分離。(A)50xgで10分間遠心分離した後、肝細胞を含むペレットが観察される。(B) 丸底チューブを10,000 x gで70分間遠心分離に使用し、細胞の破片を除去します。(C) ポリカーボネート超遠心管は、100,000 x gで70分間遠心分離に使用されます。ペレットは1つの管で集められ、PBSと再中断することによって洗浄される。(D)最終ペレットは、PBSの1000μLで再懸濁される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5:代表的な結果。肝組織EVの大きさおよび濃度は、ナノ粒子追跡分析(NTA)によって決定することができる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、ポータル静脈を介した2段階の灌流プロセスを用いた肝組織EVの単離に最適で再現可能な方法を説明し、その後に差動超遠心分離を行う。手順の重要なステップは、カニューレの配置、コラゲナーゼ濃度および消化時間、培地の流速、消化後の組織の取り扱い、および古典的な差動超遠心分離を含む。
細胞分離は、コラゲナーゼIV型を用いて消化後の結合組織成分からの分離によって達成される。灌流に使用されるコラゲナーゼの濃度は、0.1から5 mg/mLの範囲です。組織消化のためのコラゲナーゼの有効性にかなりのバッチ間変動がある可能性があります。0.5~5mg/mLのコラゲナーゼ濃度を試験したが、使用した濃度は得られたEVの歩留まりに大きな影響を与えなかった。コラゲナーゼの高濃度を使用すると、肝臓のより急速な腫脹と白化をもたらす.目標は、過度の汚染や損傷なしに満足のいく細胞解離を得ることである。これらの単離に使用されるコラゲナゼの最適な濃度は、8 mL/minの流量で7-8分間パーフ融合された1-2 mg/mLです。長すぎる灌流手順は、肝臓内の薄い結合組織を破壊するリスクを高めるだけでなく、ポータル静脈からの針の不離や静脈との空気トラップなどの技術的なリスクを増加させる。
このプロトコルの最も挑戦的な側面は、ポータル静脈のカナンレーションです。これは、特に18〜25gのサイズの範囲のマウスで、実行するのが難しい場合があります。コラゲナーゼ灌流の技術は、もともとラットで使用するために開発され、その後、多数の変更と調整後にマウスで使用するために採用されました。23Gの血液採取セットを用いてのカニュレーションは、小さな発光直径の血管にカテーテルを配置するよりも簡単です。ストッパーの結び目で糸を使用してカニューレを固定することは、脱落を避けるために推奨され、結び目はまた、カニューレが容器から外れた場合に備えて、ポータル静脈の位置のマーカーとして機能します。
下流分析では、細胞からの汚染を最小限に抑える必要があります。消化後の組織の取り扱いにはいくつかの重要な考慮事項があります。まず、血液汚染を避けるために肝臓を抽出すると鉗子とはさみを変えます。第二に、胆嚢が胆汁からの裂け目や望ましくない汚染を避けるために、肝臓から慎重に除去することが重要です。第三に、肝臓がマウスから取り除かれると、肝臓はPBSを使用して非常に穏やかに洗浄され、任意の血液を除去する。細胞による汚染を最小限に抑えるには、得られたEVの歩留まりの低下よりも優先度が高い。
超遠心分離は、EV8、9、10、11の分離および精製に最も一般的に使用される方法です。このアプローチは、肝細胞や胆管炎などのほとんどの無レンチャイマル細胞を除去し、クッファー細胞、正弦波内皮細胞、およびステラ細胞などの非無真葉細胞を除去し、さらに、細胞破片、細胞凝集、および死細胞も差動遠心分離によって除去されます。さらなる特定集団の精製および単離は、任意の非小胞性タンパク質凝集体またはリポタンパク質を除去するためにサイズ排除クロマトグラフィーによって行うことができる。
このプロトコルの限界は、一部の小胞が噴発体で除去される可能性を考えると、すべての組織小胞を捕捉しない可能性があることである。グローバル評価が必要な場合は、噴酸剤の回収と、噴酸内の小胞の単離を考慮する必要があります。さらなる制限は、細胞損傷の可能性です。過度の細胞死の潜在的な影響を監視するために、細胞の生存率を監視し、組織EV単離のための品質パラメータ内に組み込むことができます。結論として、この手順は、ポータル静脈を介して2段階の灌流技術を使用して最適化されたワークフローを説明し、その後、高収率でマウス肝臓から肝臓組織EVを得るための差動超遠心分離を行う。これらの組織EVは、生体分子組成の特性解析や、生理的または病態生理学的役割、または疾患マーカーとしての潜在的な応用を特徴付けることを目的とする他の研究などの下流分析に適しています。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、国立がん研究所助成金CA-217833からの資金援助によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Fisher scientific | FB500125 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Fisher scientific | FB500125 | |
| Curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Masking tape | Home supply store | ||
| Aluminum foil | Home supply store | ||
| Styrofoam pad | Home supply store | ||
| Absorbent Bench Underpad | Scientific inc. | B1623 | |
| Masterflex L/S Digital Miniflex Pump | Cole-parmer | ZX-07525-20 | |
| Water bath | Thermo Electron Precision | 2837 | |
| Blood collection sets | Becton Dickinson | 367292 | |
| Petri dish, clear lid 100x15 | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Falcon 70mm Nylon Cell Strainers | Fisher scientific | 352350 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Cotton Tipped Applicators | Moore medical | 69622 | |
| 25mL Serological Pipet | Falcon | 357525 | |
| Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser | BioSurplus | 203-2751 | |
| O2 gas | |||
| Isoflurane | |||
| Levo Plus Motorized Pipette Filler | Scilogex | 74020002 | |
| Centrifuge 5804R | Sigma-aldrich | 22628048 | |
| Beckman Coulter Optima L-100 XP | Beckman | 969347 | |
| Beckman Coulter Avanti JXN-26 | Beckman | B34182 | |
| 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman | 337922 | |
| JA-25.50Fixed-Angle Rotor | Beckman | 363055 | |
| Nalgene Round-bottom tube | Thermo Scientific | 3118-0028 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly | Beckman | 355618 | |
| Reagents | |||
| HyClone Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free | Fisher scientific | SH30588.01 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Fisher scientific | 17104019 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher scientific | SH30256.01 |
References
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