Summary
该协议描述了一种微注射方法, 我们已经标准化并使用了几年, 直接向蚊子和家蝇的血淋巴输送特定数量的核酸。该协议可将注射死亡率降至最低, 并允许对繁殖力进行剂量相关测量。
Abstract
合成 dsrna, 用于诱导 rna 干扰, 可能有剂量依赖性表型效应。这些影响很难定义是否使用非定量方法交付 dsrna。准确交付已知数量的核酸或其他化学品对于测量所测试化合物的效力和能够在化合物之间进行可靠的比较至关重要。
在这里, 我们提供了一个可重复的, 定量的微注射协议, 以确保准确的特定剂量的 dsrna, 降低通常由注射伤害引起的死亡率。这些修改包括添加罗丹明 b, 一个分级注射针, 和从伊索和柯林斯借用的改进的恢复方法。这种方法允许计算剂量反应, 并促进化合物之间的比较。这种方法的版本已成功地用于三属蚊子和家蝇, 以评估由于核糖体 rna 转录体的基因沉默而导致的繁殖力下降。
该方案提供了减少小昆虫微注射的几个挑战的策略。机械交付 dsrna, 同时进行目视验证, 确定有效的交付地点, 并纳入注射后恢复期, 确保准确的剂量和较低的伤害死亡率。该方案还描述了一种用于均匀测定对繁殖力影响的产卵生物测定。
Introduction
向成虫提供小型生物分子, 如核酸, 已被证明在库蚊和科都具有挑战性。据报道, 口服 dsrna 会产生不育 (当针对完全在成人睾丸中表达的基因时) 和死亡率 (当针对 snf7 和类固醇受体共活物时) 在幼虫埃及伊蚊 1,2.在家蝇3的目标时, 也观察到了死亡率. 然而, 这种表型效应并没有在食糖4、5 中喂养 dsrna 给成年的埃及埃及人吃完之后产生。
微注射在引入病原体或核酸时被用来规避中肠, 从而诱导全身反应5、6、7、8、9、10.存在多种微注射技术, 涉及的设备从需要视觉测量注射量的内部设备到微处理器控制的喷射器, 可实现低至 2.3 nl 的自动卷输送5,9,10,11. rna 干扰 (rnai) 触发点针对核糖体 mrna, 破坏不同类型的节肢动物的卵巢发育, 如牛微加子、埃及伊蚊和库蚊,房子飞的家蝇5,9,12,13。在这些研究中, 监测产卵的破坏对于确定接种剂的有效性至关重要, 因为表型可能表现为后代的终止或减少。这是一种多代致命表型, 在许多非传统的生物控制方法中发挥着关键和预期的效果, 如沃尔巴奇感染的男性介绍 (性不相容) 和 rnai 诱导的不育5 ,9,14。跟踪死亡率和繁殖力对于高度特定的生物 (自然发生的病原体和/或天然衍生物)的特征和发展是必要的15。
该协议介绍了针对成年蚊子和家蝇的详细微注射技术;一个在文献中往往没有很好描述的过程。此外, 还描述了用于充分评估 dsrna 对成人地平酮的影响的产卵生物测定方法。这些协议是专门为埃及伊蚊和家蝇开发的, 但可以为其他物种修改。
Protocol
1. 昆虫准备
- 在4°c 下冷却蚊子数小时或在4°c 下暴露在二氧化碳中2分钟, 然后在注射前在4°c 下保持。在注射前 4°c 2\ u20120123 小时的冷麻醉苍蝇。如果产卵是反应变量, 确保蚊子和苍蝇交配。
注: 蚊虫麻醉方法取决于物种和菌株,例如, 库蚊从冷麻醉中恢复的速度要比埃及伊蚊快得多, 因此 co2 击倒是可取的。 - 在冰上, 小心地放置蚊子或苍蝇, 方法是用柔软的钳子将它们放在显微镜幻灯片上, 它们的腹部暴露在大约0.5 厘米的距离。标准滑梯可容纳两排6种蚊子, 或6-7 只家蝇。在滑块的左侧或右端留出 1-1. 5 厘米的空间, 以帮助处理滑梯。
- 将上演的昆虫在4°c 的大型培养皿中保持滑落, 直到准备注射。
注: 在培养皿盖上钻一个洞, 将有助于防止昆虫在封盖时受到空气置换的干扰。在固定在盘子底部的几块玻璃毛细血管上放置滑梯, 将方便地从培养皿中取出。
2. 昆虫注射
- 准备 dsrna, 如 edstep等人描述的那样.5和 Sanscrainte等人9. 如果不含污染物, 则可使用分光光度计测量260nm 的吸收率, 并计算以μg/ml 为a 260x 稀释因子 x40 的 rna 浓度。
- 在冷台上或浅层冰桶上设置解剖显微镜和微喷射器, 对冷麻醉蚊子和苍蝇进行注射 (见步骤1.1–1.3 和图 1)。
- 将玻璃毛细血管拉到带针头的细头 (设置: 加热器 = 15个单位, 电磁阀 = 4 a)。
注: 有关制造商的详细信息, 请参阅材料表。 - 按照制造商的指示, 将毛细管针放入微喷射器中, 用一对钳子夹紧, 使针尖断裂, 从而产生尖尖。
注: 建议的蚊虫开针尺寸为 ~ 150μm, 家蝇开针量 ~ 250μm。 - 为所需的输送量设置微喷射器。半月板运动从 ~ 50 nl 的 aliquots 是很容易观察到的, 建议蚊子微注射。如果可用, 请启用快速注射设置。用补充和排出无核酸酶水3次来冲洗针头。
- 准备注射溶液的浓度, 如 100\ u201150 nl 将提供所需的剂量的蚊子和 500 nl 将提供所需的剂量的家蝇。
注: 建议的初始剂量: 每只蚊子1微克, 每只家蝇 5μg5,9。 - 对于蚊子, 在最终浓度为3.0μg/ml 的溶液中加入罗丹明 b (以帮助可视化)。
注: 染料在腹部/胸部交叉口的腹侧表面几乎清晰的角质层注射后, 其粉红色将清晰可见。 - 移液器3-4μl 溶液注入干净的表面 (如一块石蜡膜), 并在不吸任何空气的情况下吸引到玻璃针中。反复按下注射按钮, 直到液体开始从针头上取下, 用精致的任务刮水器轻轻擦拭液滴。
注: 虽然某些型号的微喷射器需要回填注射器, 但材料表中提到的注射器不需要回填。 - 使用超细点标记, 从液体半月板到针柄绘制相列标记 ~ 1 毫米。这将有助于可视化半月板运动, 并确保溶液在注射过程中进入蚊子体内。
- 将蚊子或苍蝇的滑行 (在第 1.2-1.3 步中准备) 设置在冰冷的桌子或冰上的针头下 (图 1)。确保显微镜中的视野足够宽, 可以看到针头中的溶液半月板。
- 对于蚊子, 将针头与中间三分之一的中半侧对齐 (图 2a), 在用放在另一侧的钳子将蚊子与针头对齐时, 用针头轻轻刺穿角质层。微喷射器千分尺。
- 对于家蝇, 将针头与介素 (图 2b) 对齐, 并在将苍蝇支撑在针头上的同时, 用针尖轻轻刺穿角质层。
- 轻轻将针头滑入蚊子或苍蝇体内, 直到尖端穿过中线。
注: 插入针头太浅通常会导致注入的液体从昆虫中发出珠子 (参见步骤 2.15)。 - 在观察针头中液体半月板的运动时, 按下注射按钮, 直到注射所需的液体量。对于蚊子, 如果设置为 50.6 nl aliquots, 按2x 为 ~ 100 nl 或3倍为 ~ 150 nl。对于家蝇, 按下注射按钮, 直到注射了 ~ 500 nl (即,用 69 nl aliquots 按 7x 483 nl)。
- 如果半月板不动, 在观察半月板运动的同时, 慢慢地将蚊子滑倒或从针头上飞下来。如果注入的溶液的一部分在拔针时从角质层中发出珠子, 或者半月板不能移动, 则丢弃昆虫, 因为这种注射不成功。
- 转移成功地注射蚊子在小组10-15 或家庭苍蝇在5小组清除3.5 盎司举行杯。盖上薄纱或网状物, 在室温下回收。
- 蚊子和苍蝇恢复后 (1-2小时), 将每个拿着的杯子倒置在一个浸有10% 蔗糖溶液的棉球上。
注: 将杯子倒置在蔗糖棉上, 通过提供更容易获得糖餐10, 有助于生存。 - 在注射溶液之间冲洗针头, 步骤2.5。注射完成后, 将用过的针头丢弃在适当的锐器容器中。
3.埃及伊蚊死亡率和产卵生物测定
- 注射后三天内, 继续向蚊子提供 1 0% 的蔗糖, 并记录明显死亡蚊子的数量。
- 用新鲜血液 (即埃及伊蚊牛) 填充≤12英寸人工膜 (如胶原蛋白香肠外壳), 并在热水浴中加热至60°c。
- 在纸巾上滚动, 将膜简单地擦干, 并躺在3.5 盎司透明的盛放杯的薄纱帽上。为了加强喂养, 在加热后, 用 1 mm atp 将血液作为兴奋剂, 或用干净的赤手空拳处理温暖的血液香肠, 将人体挥发物留在套管表面。
- 喂奶后, 将棉球更换为固定杯上10% 的蔗糖, 并让蚊子休息约 24小时, 然后转移到产卵杯。
- 通过填充约30毫升去离子化 h2o 的透明3.5 盎司生物测定杯, 并在杯底和侧面放置一张种子萌发纸 (约4厘米宽, 长5厘米, 脊垂直运行), 从而构建产卵杯 (图 3 a).盖上薄纱或网状物, 在薄纱或网帽上切一个小缝隙 (~ 1 厘米)。
- 在24小时后喂养时, 在托杯的薄纱帽中切开一个小缝隙 (~ 1 厘米), 并将仅在腹部用可见血丸的单个雌性进行移植, 将其吸进产卵杯 (1个女性卵泡杯)。用10% 的蔗糖饱和棉球密封产卵帽的小伤口。
- 将杯子保持在 ~ 27°c 5\ u20127天, 以允许蚊子完全排卵, 同时跟踪每日死亡率。在解剖范围内计算鸡蛋数。
4.家蝇死亡率和产卵生物测定
- 注射后三天, 继续为苍蝇提供 1 0% 的蔗糖, 并记录明显死亡苍蝇的数量。
- 注射三天后, 麻醉苍蝇, 通过短暂放置聚乙烯管分配二氧化碳在举行的杯子, 直到所有苍蝇在杯底一动不动。
- 将苍蝇转移到一个干净的笼子里, 这个笼子由一个4升的塑料罐组成, 开口上有一个 stockinette 套筒 (10 厘米,图 3 b)。以8:8:1 的比例 (按体积) 为苍蝇提供水和粒状蔗糖、奶粉和蛋黄干的混合物, 为期四天, 每天记录和清除死苍蝇。
- 将75% 的小麦麸皮与25% 的粒状牲畜饲料按重量混合, 为新鲜苍蝇幼虫养殖培养基准备干原料。加水达到62% 的水分 (直到一滴水几乎无法挤出)。
- 从上述新鲜幼虫培养基和 "使用的" 苍蝇培养基 (苍蝇以前在其中成虫的培养基) 的1:1 混合物中制备直径2.5 厘米的球。将球包裹在一块方形的黑色棉布中, 轻轻挤压, 直到介质液体渗出, 然后用橡皮筋将布固定在球周围的位置。
- 将球放入60毫升杯中, 并将其放入飞笼中 5小时 (图 3b)。
- 将卵从产卵球上冲洗掉, 并确保将鸡蛋从布内的褶皱下取出。摇蛋, 以扰乱集群, 并将它们转移到一个毕业的20毫升离心管与转移管。
- 等到鸡蛋沉淀下来, 并注意到在刻度管中的沉淀鸡蛋的体积。加入足够的水, 使体积达到20x 的沉淀蛋的体积。记录水加鸡蛋的总量。
- 将水和鸡蛋悬浮液与磁搅拌棒或剧烈搅拌混合时, 使用1毫升的移液尖端 (尖端的末端被切断) 将0.5 毫升的水和鸡蛋悬浮液分配到一系列的预湿黑布上。在解剖显微镜下数一数鸡蛋。
- 重复步骤4.9 两次。如果其中一个计数是严重的异常值 (即, 与其他两个计数不同的 gt;35%), 则进行第四个计数并忽略异常值。
- 计算每个样本的平均卵数, 并将此值乘以 2, 以获得悬浮液的鸡蛋数量。将从步骤4.8 中的卵子悬浮量获得的 eggss/ml 值相乘。这是对产蛋总数的估计。
Representative Results
蚊虫体内 dsrna 的微注射
这种微注射方法已在我们的实验室中用于评估基因表达, 死亡率和产卵反应超过 80 dsrna 触发器跨越几个蚊子属 (伊蚊, 按蚊,库蚊)。注射女性从埃及人的群体菌株 (orl1952) 与1微克的 dsrna 从核糖体转录 rps6 和 rpl26 (参见 etstep等人).5对于 dsrna 的生产方法和序列数据) 显示, 与注射对照 dsgfp 的蚊子相比, 多个排卵周期的相对表达 (re) 显著下降。埃及伊蚊在第2性腺养周期后测量的 re 显示, 注射 dsrps6 的蚊子的 rps6 表达显著减少 (p & lt; 0.05), 这是由同一组 dsRPS6 控制之间的学生 t 检验确定的 (图 4)5.
利用这里描述的产卵生物测定法, 对个别雌性进行了繁殖力评估。注射后 3天, 蚊子被送血, 转移到单独的排卵容器中, 并允许躺到完成。与 dsRPS6 注射相比, dsrps6 处理过的埃及人 (n = 102个雌性, 1.3±0.8 (平均±se) 卵和 dsRPS6 处理过的第一个促性腺激素周期的平均离合器尺寸都显著减小 (n = 79)雌性, 49.3±3.5个卵,图 5a)。第二次淋病周期后的离合器评估也显示, 两个 dsrna 治疗组的排卵率都显著降低, 但效果大小有所减少。埃及埃及爱伊蚊的组大小是可变的, 因此意味着分离是由 dunn 的测试5进行的。24小时死亡率通常为3% 或更低。
在女性埃及中, 注射 dsrps6 从1微克到 50 ng 时观察到了明显的剂量效应, 与除 25 ng/女性 dsRPS6 剂量外的所有对照组相比, 离合器的大小差异显著.
家蝇 dsrna 的微注射
家蝇 (orl 正常) 被注射了5微克的 dsrna 结构设计对房子苍蝇 rps6 和 rpl26 转录 9.正如在埃及埃及的观察所观察到的那样, 观察到具体的转录表达 (rps6 和 rpl26) 显著减少, 离合器尺寸缩小 (图 4 和图 5a)。同一组 dsgfp 对照间的 t-测试 (p & lt; 0.05) 测定了 re 的显著降低, 并采用 holm-sidak 试验确定了不同家蝇治疗组离合器尺寸之间的意义。卵巢解剖显示 dsrps6 和 dsRPS6 处理中的渗出减少, 而 dsRPS6 喂养的苍蝇在 tyndal-biscoe 尺度9上的额定维豆生成素沉积水平正常。
图 1: 微注射装置, 用于向成年蚊子和家蝇提供微容量.注射是在显微镜幻灯片上的冷滑表上进行的冷麻醉昆虫。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:埃及埃及和家蝇的微注射部位。(a)在中端三分之一的中端注射埃及埃及人。(b) 家蝇成人被注射在城市中。箭头表示注射部位。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 排卵物生物测定装置。(a) 埃及埃及排卵试验杯, 种子萌发纸作为产卵底物, 盖上薄纱和10% 蔗糖浸渍棉。(b)成年女性家蝇在产卵试验容器中, 有食物 (a)、水 (b) 和幼虫培养基 (c)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: rps6 在注射物种特异性 dsrna 中的相对表达。注射埃及伊蚊和家蝇分别注射1和5μg 的对照每种昆虫的 rps6 或 rpl26 转录物设计的对照 dsrna (dsgfp) 或 dsrna。在注射 dsrps6 的蚊子和苍蝇中, 以及在注射 dsRPS6 (用星号表示) 的苍蝇中观察到 rps6 表达的显著减少 (p & lt; 0.05)。误差线表示平均值±se, 列基的数字表示被检查的人数。这一数字已从 edstep等人处修改。5和 Sanscrainte等人9.请点击此处查看此图的较大版本.
图 5:注射特异性 dsrna的埃及和家蝇的平均离合器尺寸。(a)在分别注射控制 dsrna (dsgfp) 或 dsrna 后, 根据每种昆虫的 rps6 或 rpl26 转录体分别注射1和5μg 后, 埃及和家蝇的蛋沉积显著减少 (p & lt; 0.05)。星号显示与同一组 dsgfp 控制有显著差异。误差线表示平均值±se, 列基的数字表示被检查的人数。这一数字已从 edstep等人处修改。5和 Sanscrainte等人9. (b) 注射dsrps6 的埃及埃及人的剂量曲线从 50 ng/女性到 1000 ng/女性显示, 与注射 dsRPS6 的群体 (50、100和 1000 ng/女性) 相比, 繁殖力显著下降。误差柱表示每剂量36-81 个个体生物的平均值±95% ci。字母点表示组之间的显著差异 (p & lt; 0.05), 由方差分析识别。这一数字已从 edstep等人处修改。5.请点击此处查看此图的较大版本.
Discussion
微注射是一种有价值的实验室技术, 可确保 dsrna 或其他生物 (即农药、病毒、小孢子虫) 的输送。虽然许多实验室进行微注射, 但由于交付系统的技术限制, 在交付量没有直接测量的情况下, 注射的确切数量往往不清楚。交付的体积和浓度是关键参数, 可以计算标准的毒理学措施, 如 ec50 或 ic50, 或定义最低有效剂量5,16。这一点在成年昆虫中使用 rnai 的功能研究中尤其重要, 在这种情况下, 通过喂养进行分娩并不总是导致系统接触所需的颗粒, 而穿过中肠的实际剂量尚不清楚5。
虽然微注射过程最初具有挑战性, 但通过实践和耐心, 可以快速提高速度和交付精度。掌握注射过程本身是一个时间投资, 但一旦完成, 该程序产生重复的结果和伤害死亡率的 lt;3%。成功注射的比例会随着熟练程度的提高而增加, 每天可以注射300只蚊子或苍蝇。
微注射的许多挑战都是由于使用了针头。确定合适的毛细管针断点和尖端角度是一个具有挑战性的方面的程序, 需要一些试验和错误, 以确定最有效的开放大小的给定物种。最适合蚊虫微注射的细针 (~ 150μm) 太小, 无法快速将较大的注射量注入苍蝇, 而较大的针头 (~ 250μm) 对较小的蚊子造成广泛的伤害和不可接受的注射死亡率。用钝尖断的针通常很难通过角质层而不造成组织损伤和死亡率的增加。昆虫鳞片或组织片可以堵塞针在实验过程中, 所以它往往是有益的, 拉几个针, 如果需要更换。我们发现, 更换困难的针头比花时间试图清除卡住或弄脏的针头更容易。
观察进入昆虫的注射溶液是至关重要的, 以便可以去除不成功的注射 (见步骤 2.14-2.14)。罗丹明 b 添加到注射溶液提供了一个清晰的视觉, 以确保冷阶段昆虫收到适当的剂量, 并特别有帮助, 而练习 (见步骤 2.7)。
本文介绍的注射和产卵生物测定方法成功地诱导了成年家家艾叶和家蝇在针对特异性核糖体设计的 dsrna 时的基因敲除和可测量表型效应(图 4和图 5a)。此外, 这种方法能够准确地将微体积传递给个人, 从而能够生成少量材料 (低至50纳克;图 5b)。这对于筛选 sirna 或 dsrna 等方法尤其有用, 因为生产大量这些分子的成本可能过高。
在确保任何输送缓冲液通过注射无害后, 可以对这种方法进行改进, 以注射生物制剂 (病毒、细菌、小孢子虫) 或化学农药。由于交付量受到昆虫大小的限制, 生产集中的检测解决方案非常重要。
为了充分评估 dsrna 的功效, 有必要跟踪卵动定位, 因为致命的表型可能只表现在后代。正如这里所介绍的, 在血液之后分别持有女性埃及埃及埃及人,可以对相同的个体进行单独离合器尺寸的测定和进一步的测试, 可以在产卵下游进行 (即基因表达研究,额外的淋病周期, 组织特异性击倒), 以关联生殖输出与其他措施, 如基因表达。由于家蝇一般在群体反应中排卵, 煽动孤立的妊娠苍蝇躺下是非常劳动密集型的, 对大量的个人来说是不现实的。因此, 提出了一种确定平均离合器尺寸的方法。
这里介绍的微注射方法为蚊子和家蝇提供了一致的全身传递。再加上死亡率和产卵跟踪生物检测, 这些多功能工具可用于评估小 rna 分子、生物制剂和传统杀虫剂的转录和表型效应, 因为口服杀虫剂是不可行的。
Disclosures
所有作者都是美国农业部或国防部的雇员或承包商。这份手稿是在执行公务过程中制作的, 是公开领域的法律规定的。所表达的观点代表了作者的意见, 并不代表美国政府的官方立场或认可。提及商业产品并不是建议使用。
Acknowledgments
作者感谢 hanayo aremto (美国海军)、dana johnson、lucy li 和 roxie white (usda-ars) 在数据采集和分析方面提供的帮助。我们还感谢 pia olafson 博士 (usda-ars) 和 ke wu (佛罗里达大学) 对手稿进行了严格审查, 并感谢 niklaus hostetler (佛罗里达大学) 拍摄了显微镜镜头。美国农业部、海军和海军陆战队公共卫生中心的 wi-141c 项目以及部署的战争战斗机保护方案提供了资金。资助者在手稿的设计或研究发展方向方面没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
