Summary
Dit protocol beschrijft een microinjection methodologie die we hebben gestandaardiseerd en gebruikt jarenlang voor bepaalde hoeveelheden van nucleïnezuren rechtstreeks naar de Hemolymfe van muggen en huis vliegt. Dit protocol resulteert in minimale injectie sterfte en laat dosis gecorreleerd metingen van vruchtbaarheid.
Abstract
Synthetische dsRNAs, gebruikt voor het opwekken van RNA-interferentie, kunnen dosis afhankelijk fenotypische gevolgen hebben. Deze effecten zijn moeilijk te definiëren als de dsRNAs worden geleverd met een niet-kwantitatieve methode. Nauwkeurige levering van bekende hoeveelheden van nucleic zuren of andere chemicaliën is van cruciaal belang voor het meten van de doeltreffendheid van de stof wordt getest en aan betrouwbare vergelijking tussen verbindingen toestaan.
Hier bieden we een reproduceerbare, kwantitatieve microinjection-protocol dat zorgt voor een nauwkeurige levering van specifieke doses dsRNA, vermindering van de sterfte meestal geïnduceerd door injectie schade. Deze wijzigingen omvatten de toevoeging van Rhodamine B, een gegradueerde injectie naald, en een verbeterde herstelmethode geleend van Isoe en Collins. Deze methode stelt van de berekening van de dosis reacties en vergemakkelijkt vergelijkingen tussen verbindingen. Versies van deze methode zijn met succes gebruikt op drie geslachten van muggen, alsmede huis vliegt te beoordelen van de vermindering in de vruchtbaarheid als gevolg van gen tot zwijgen brengen van ribosomaal RNA afschriften.
Dit protocol biedt strategieën ter vermindering van de diverse uitdagingen van kleine insecten microinjection. Samen, mechanische levering van dsRNAs begeleid door visuele verificatie, identificatie van effectieve locaties voor levering, en opneming van een herstelperiode na injectie zorgen voor nauwkeurige dosering en lage letsel sterfte. Dit protocol beschrijft ook een bioassay oviposition voor uniforme bepaling van effecten op de vruchtbaarheid.
Introduction
Leveren van kleine biomoleculen, zoals nucleïnezuren, aan volwassen dipterans heeft bewezen in zowel Culicidae als Muscidae uitdaging. Orale opname van dsRNAs is gemeld tot steriliteit (als gericht op genen uitsluitend in de teelballen van volwassenen uitgedrukt) en mortaliteit (bij het uitstippelen van de SNF7 en de coactivator van een steroïde receptor) in larvale Aedes aegypti1,2 . Sterfte is ook waargenomen bij het uitstippelen van de HSP70 in larvale Musca domestica3. Dergelijke fenotypische effecten, echter hebben niet geleid tot na de voeding dsRNA aan volwassen Ae. aegypti in suiker maaltijden4,5.
Microinjection is gebruikt voor het omzeilen van de middendarm, bij de invoering van pathogenen of nucleic zuren, waardoor inducerende een systemische aanpak5,6,7,8,9,10 . Verschillende microinjection technieken bestaan, waarbij apparatuur variërend van in-house geproduceerde toestellen waarvoor visuele meting van geïnjecteerde volume aan microprocessor gestuurde injectoren die toestaan voor geautomatiseerde volume levering zo laag als 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA interferentie (RNAi) triggers targeting ribosomal mRNAs, verstoren ovariële ontwikkeling bij geleedpotigen zo divers als het vee teek Rhipicephalus microplus, de muggen Aedes aegypti en Culex pipiens, en het huis vliegen Musca domestica5,,9,,12,13. In deze studies was toezicht op de verstoring van de oviposition essentieel voor het bepalen van de effectiviteit van de inoculant zoals het fenotype zich als beëindiging of vermindering van de nakomelingen manifesteren kan. Dit is een vorm van intergenerationele dodelijke fenotype thats een kritische en gewenste effect in veel van de niet-traditionele biocontrol methoden zoals Wolbachia -besmet mannetjes inleiding (seksuele incompatibiliteit) en RNAi geïnduceerde steriliteit5 ,9,14. Het bijhouden van zowel de sterfte en de vruchtbaarheid is nodig voor de karakterisering en de ontwikkeling van zeer specifieke biorationals (natuurlijk voorkomende ziekteverwekkers en/of natuurlijke derivaten)15.
Dit protocol presenteert gedetailleerde microinjection technieken voor zowel volwassen muggen en vliegen in huis; een proces die vaak niet goed in de literatuur wordt beschreven. Daarnaast worden oviposition bioassay methodologieën voor het adequaat evalueren dsRNA effecten op volwassen dipterans beschreven. Deze protocollen zijn speciaal ontwikkeld voor Aedes aegypti en Musca domestica maar voor andere soorten kunnen worden gewijzigd.
Protocol
1. insect voorbereiding
- Anesthetize muggen door hen bij 4 ° C koeling gedurende enkele uren of door 2 min blootstelling aan CO2 en vervolgens houden bij 4 ° C vóór injecties. Koude anesthetize vliegen bij 4 ° C 2\u20123 h vóór injecties. Zorgen dat muggen en vliegen zijn gekruist als oviposition de variabele van een reactie.
Opmerking: De mug afstomping methode is afhankelijk van de soort en stam, bijvoorbeeld Culex herstellen sneller van koude afstomping dan Aedes aegypti en CO2 knockdown daarom beter. - Op het ijs, zorgvuldig fase muggen of vliegen met behulp van zachte pincet te leggen hen ventrally blootgesteld op Microscoop dia's ~0.5 cm uit elkaar. Standaard dia's kunnen bevatten twee rijen van elk 6 muggen of 6-7 huis vliegt. Laat een 1 – 1,5 cm ruimte aan het einde van het links of rechts van de dia duidelijk van muggen of vliegt naar steun dia behandeling.
- Houd slides van gefaseerde insecten bij 4 ° C in grote petrischalen tot klaar voor de injectie.
Opmerking: Boren van een gat door het deksel van de petrischaal zal helpen voorkomen dat insecten door lucht verplaatsing worden verstoord wanneer Plafonnering. Plaatsen van dia's op een paar glazen capillairen bevestigd aan de onderkant van de schotel zal verlichten afgehaald petrischaal.
2. insect injectie
- DsRNA bereiden zoals beschreven door Estep et al. 5 en Sanscrainte et al. 9. als vrij van verontreinigingen, dsRNA kan worden gekwantificeerd met behulp van een spectrofotometer voor het meten van de absorptie bij 260 nm en berekening RNA concentratie in μg/mL als een260 × verdunning factor × 40.
- Instellen ontrafeling van Microscoop en microinjector over een chill tabel of ondiepe ijsemmer voor het uitvoeren van injecties op de koude-verdoofd muggen en vliegen (zie stap 1.1-1.3 en Figuur 1).
- Trek glas haarvaten naar een fijne tip met de trekker van de naald (instellingen: kachel = 15 eenheden, solenoïde = 4 A).
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor details van de fabrikant. - Plaats de capillaire naald in een microinjector volgens de instructies van de fabrikant en de pauze naald tip door te knijpen met een paar pincet te produceren van een scherpe punt.
Opmerking: Voorgestelde naald opening maten zijn ~ 150 µm voor muggen en ~ 250 µm voor de huisvlieg. - Microinjector voor gewenste levering volume instellen Meniscus beweging van ~ 50 nL aliquots is gemakkelijk waarneembare en aanbevolen voor mosquito microinjections. Indien beschikbaar, snelle injectie instellingen inschakelen. Spoel de naald door te vullen en uitzetting nuclease-gratis water 3 keer.
- Oplossingen voor te bereiden voor injectie met een concentratie zodanig dat 100\u2012150 nL zorgt voor gewenste dosis voor muggen en 500 nL wil bieden dosis voor huis vliegt gewenste.
Opmerking: Voorgesteld initiële dosis: 1 µg voor elke mug en 5 µg voor elke huisvlieg5,9. - Toevoegen optioneel voor muggen, Rhodamine B (op steun in visualisatie) tot oplossingen op een eindconcentratie van 3.0 µg/mL.
Opmerking: De kleurstof worden duidelijk zichtbaar door de roze kleur na injectie door de nagenoeg helder cuticle op het ventrale oppervlak op het snijpunt van de buik/thorax. - Pipetteer 3 – 4 µL van oplossing te injecteren op een schoon oppervlak (zoals een stuk van paraffine film) en trekken in de naald glas zonder zuigen in de lucht. Druk de knop inject herhaaldelijk totdat de vloeistof begint te afzien van de naald en voorzichtig vegen druppels met een delicate taak wisser.
Opmerking: Hoewel sommige modellen van microinjectors backfilling de spuit vereisen, de injector waarnaar wordt verwezen in de Tabel van de materialen niet. - Met een ultra-fijne punt marker, tekent hekjes ~ 1 mm uit elkaar vanaf de vloeibare meniscus tot de schacht van de naald. Dit zal helpen bij het visualiseren van de meniscus beweging en zorg ervoor dat de oplossing de mosquito heeft ingevoerd tijdens de injectie.
- Stel de dia van muggen of vliegen (zoals opgesteld in stappen 1.2-1.3) onder de naald op de chill tabel of ijs (Figuur 1). Zorgen dat gezichtsveld in de Microscoop is breed genoeg om te zien de oplossing meniscus in de naald.
- Uitlijnen van de naald met de middelste eenderde van de mesokatepisternum (figuur 2A) voor muggen, en terwijl de mug tegen de naald met een tang verkwikkende aan de andere kant geplaatst, voorzichtig doorprikken van de cuticle bestaat met het gebruik van de tip van de naald de microinjector micrometer.
- Huis vliegt, uitlijnen van de naald met het mesopleuron (figuur 2B) en terwijl de vlieg tegen de naald verkwikkende, voorzichtig doorprikken de cuticle met het topje van de naald.
- Zachtjes glijd de naald in de mug of vlieg lichaam totdat de tip heeft doorgegeven via de middellijn.
Opmerking: Invoegen van de naald te ondiep vaak resulteert in het geïnjecteerde vloeistof beading uit het insect (zie stap 2.15). - Tijdens het kijken naar voor verkeer van de vloeibare meniscus in de naald, de invoeren-knop te drukken totdat de gewenste hoeveelheid vloeistof heeft ingespoten. Voor muggen, als ingesteld op 50.6 nL aliquots, druk 2 X op voor ~ 100 nL of 3 X voor ~ 150 nL. Voor huis vliegt, druk op de knop invoeren tot ~ 500 nL heeft ingespoten (dat wil zeggen, met 69 nL aliquots druk 7 X 483 nL).
- Als de meniscus niet beweegt, langzaam glijden de mug of de naald wegvliegen tijdens het kijken naar voor meniscus beweging. Als een gedeelte van de geïnjecteerde oplossing parels uit de epidermis bij naald verwijdering of indien de meniscus te verplaatsen, gooi het insect als was deze financiële injectie niet succesvol.
- Succesvol ingespoten muggen in groepen van 10-15 of huis vliegt in groepen van 5 tot en met 3.5 oz kopjes bedrijf duidelijk overbrengen. Bedek met Tule of verrekening en herstellen bij kamertemperatuur.
- Nadat muggen en vliegen hebben hersteld (1-2 h), omkeren elk kopje bedrijf over een katoenen bal doorweekt met 10% sacharoseoplossing.
Opmerking: De inversie van de cup op de top van de sucrose katoen aids in overleving door gemakkelijker toegang tot een suiker maaltijd10. - Spoel naald zoals in stap 2.5 tussen injectie oplossingen. Wanneer klaar injecteren, discard gebruikt naalden in een passende slijpsel container.
3. aedes aegypti sterfte- en oviposition bioassay
- Drie dagen na de injectie, blijven muggen voorzien van 10 gewichtspercenten sacharose en registreren het aantal zichtbaar dode muggen.
- Vul een ≤12-duim kunstmatige membraan (zoals collageen worst behuizing) met vers bloed (dat wil zeggen, runderen voor Aedes aegypti) en warmte tot 60 ° C in warm waterbad.
- Kort het membraan droog door te rollen op een papieren handdoek en lag in de Tule caps van de 3.5 oz cups duidelijk te houden. Ter verhoging van voeding, spike bloed met 1 mM ATP na verwarming als een phagostimulant of door de greep de verwarmde bloedworst met schone blote handen te laten van menselijke vluchtige stoffen op het oppervlak van de behuizing.
- Na bloed voeden, vervangen de katoenen bal doorweekt met 10 gewichtspercenten sacharose bovenop de kopjes bedrijf en laat muggen te rusten voor ~ 24 h vóór de overbrenging aan oviposition cups.
- Construct oviposition kopjes door te vullen duidelijk 3.5 oz bioassay kopjes met ~ 30 mL gedeïoniseerd H2O en het plaatsen van een stuk zaad kiemkracht papier (~ 4 cm breed en 5 cm lang met ribbels verticaal uitgevoerd) aan de onderkant van de cup en tegen de zijkant (figuur 3A) . Bedek met Tule of verrekening en een kleine gleuf (~ 1 cm) snijden in het GLB Tule of verrekening.
- Een kleine gleuf (~ 1 cm) in het GLB tulle van het bedrijf-cup op 24u na bloed voeden, gesneden en overdracht alleen individuele vrouwen die met succes gevoed — met een bolus zichtbaar bloed in buik — door zachte mond aspiratie in oviposition kopjes (1 kop van het vrouwtje/oviposition). Stop de kleine snede in de oviposition dop met een 10% sacharose verzadigde katoenen bal.
- Houd cups bij ~ 27 ° C om muggen te volledig oviposit terwijl het bijhouden van dagelijkse mortaliteit dagenlang 5\u20127. Aantal eieren onder een ontleden.
4. de sterfte en oviposition bioassay Musca domestica
- Drie dagen na de injectie, blijven de vliegen voorzien van 10 gewichtspercenten sacharose en registreren het aantal zichtbaar dode vliegen.
- Drie dagen na de injectie, anesthetize vliegen door kort het plaatsen van een polyethyleen buis verstrekking van CO2 over de kopjes bedrijf totdat alle vliegen roerloos aan onderkant van de cups zijn.
- Overdracht vliegt naar een schone kooi bestaat uit een 4 L plastic pot met een tricotsteek mouw die betrekking hebben op de opening (10 cm, figuur 3B). Vliegen met water en een mengsel van gekorrelde sacharose, melk in poedervorm, gedroogd eigeel in een 8:8:1 verhouding (volumeprocent) voor vier dagen, opname en het verwijderen van dode vliegt dagelijks.
- Bereid droge ingrediënten voor verse vliegen larvale steigerend medium door het mengen van 75% tarwezemelen met 25% Ingehuld veevoeder gewichtspercenten. Voeg water tot 62% vocht (tot een druppel water kan nauwelijks worden weggedrukt).
- Bereiden van een 2,5 cm diameter bal uit een mengsel van 1:1 van de bovenstaande vers larvale media en larvale medium "gebruikt" vliegen (medium waarin vliegen hebben eerder pupated). Wikkel de bal in een vierkant van zwarte katoenen doek, squeeze licht tot medium vloeistof sijpelt door, gebruik dan elastiekjes om het doek op zijn plaats rond de bal houden.
- Zet van de bal in een 60 mL beker en plaats deze in de vlieg kooi voor 5 h (figuur 3B).
- Spoel van eieren uit de bal oviposition en zorgen dat de eieren onder plooien in het weefsel worden verwijderd. Het schudden van eieren om te verstoren clusters en hen overbrengen in een centrifugebuis afgestudeerd 20 mL met een pipet overdracht.
- Wacht totdat de eieren regelen en noteer het volume van de vaste eieren in de geijkte buis. Voeg voldoende water om het volume maximaal 20 X het volume van de vaste eieren. Noteer de totale hoeveelheid water plus eieren.
- Tijdens het mixen de water en ei schorsing met een magnetische roer bar of krachtig roeren, gebruikt u een 1 mL pipet tip (met het einde van de tip afgesneden) af te zien van 0,5 mL van de ophanging van het water en ei op een stuk van vooraf bevochtigd zwarte doek in een reeks lijnen. Tellen de eieren onder een Microscoop ontleden.
- Herhaal stap 4.9 twee meer tijden. Als een van de graven een ernstige uitschieter is (dat wil zeggen, verschilt van de andere twee tellingen door > 35%), maken een vierde graaf en negeren de uitschieter.
- Het gemiddelde aantal eieren per monster berekenen en deze waarde vermenigvuldig met 2 te krijgen van het aantal eieren/mL van de schorsing. Vermenigvuldigt de waarde van de eieren/mL verkregen door het volume van de schorsing van de ei uit stap 4.8. Dit is de schatting voor het totale aantal eieren gelegd.
Representative Results
Microinjection van dsRNA in muggen
Deze methode van microinjection hanteert voor het evalueren van de expressie van genen, sterfte en oviposition antwoord voor meer dan 80 dsRNA triggers over verschillende geslachten van de mug (Aedes, Anopheles, Culex) in ons laboratorium. Injecteren van de vrouwen van de stam van de kolonie van Ae. aegypti (ORL1952) met 1 µg dsRNA afgeleid van de ribosomal transcripten, RPS6 en RPL26 (Zie Estep et al. 5 voor dsRNA productiemethoden en sequencedata) toonde significante vermindering in relatieve expressie (RE) over meerdere oviposition cycli in vergelijking met muggen geïnjecteerd met een controle-dsGFP. Aedes aegypti RE gemeten na de 2nd gonotrophic cyclus bleek aanzienlijke vermindering van de RPS6 expressie (P < 0.05) in muggen ingespoten met dsRPS6 zoals bepaald door een Student t-test tussen de controle van de dsGFP van dezelfde groep (Figuur 4)5 .
Vruchtbaarheid evalueerden van individuele koeien met behulp van de oviposition-bioassay beschreven hier. Na 3 dagen na injectie waren muggen bloed gevoed, overgedragen in individuele oviposition containers en toegestaan om te leggen tot voltooiing. Gemiddelde koppeling maten voor de eerste cyclus van de gonotrophic werden aanzienlijk verlaagd voor beide dsRPS6 behandeld Ae. aegypti (n = 102 vrouwtjes, 1,3 ± 0.8 (gemiddelde ± SE) eieren) en dsRPL26 behandeld (n = 86 vrouwtjes, 4,0 ± 1.1 eieren) in vergelijking met dsGFP injecties (n = 79 vrouwtjes, 49.3 ± 3,5 eieren, figuur 5A). Koppeling beoordeling na een tweede cyclus van de gonotrophic bleek ook sterk gereduceerde oviposition voor beide groepen dsRNA behandeld, maar met beperkte effect grootte. Groep grootte van Ae. aegypti waren variabele en dus middelen scheiding werd uitgevoerd door Dunns test5. Twintig-vier uur durende sterfte was normaal 3% of minder.
Een duidelijk dosis-effect werd waargenomen bij het injecteren van de dsRPS6 van 1 µg tot 50 ng in vrouwelijke Ae. aegyptien koppeling grootte variëren aanzienlijk in vergelijking met 1 µg/vrouwelijke dsGFP geïnjecteerd besturingselementen in alle, maar de 25 ng/vrouwelijke dsRPS6 dosis (figuur 5B).
Microinjection van dsRNA in huis vliegt
Kolonie Musca domestica (ORL normale) werden ingespoten met 5 µg dsRNA constructies ontworpen tegen het huis vliegen RPS6 en RPL26 afschriften9. Zoals werd opgemerkt in Ae. aegypti, werd significante vermindering van zowel specifieke transcript expressie (RPS6 en RPL26) en afname van de grootte van de koppeling waargenomen (Figuur 4 en figuur 5A). Significante vermindering in RE werd bepaald door de Student t-test tussen de controle van de dsGFP van dezelfde groep (P < 0,05) en de Holm-Sidak test werd gebruikt om te bepalen van betekenis tussen koppeling maten voor verschillende M. domestica behandelgroepen. Ovariële dissecties toonde verminderde ooegenese in dsRPS6 en dsRPL26 behandelingen, terwijl dsGFP gevoed vliegen had normale vitellogenin afzetting als scoort op de Tyndale-Biscoe schaal9.
Figuur 1: Microinjection setup voor het leveren van microvolumes aan volwassen muggen en huis vliegt. Injecties worden uitgevoerd op koude-verdoofd insecten opgevoerd op Microscoop dia's over een chill tabel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Microinjection sites voor Ae. aegypti en M. domestica. (A) volwassen Ae. aegypti worden geïnjecteerd in de middelste eenderde van de mesokatepisternum. (B) volwassen M. domestica worden geïnjecteerd in het mesopleuron. Pijlen geven aan sites van injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Oviposition bioassay setup. (A) Ae. aegypti oviposition assay kopjes met zaad kiemkracht papier als een oviposition substraat, afgetopt met Tule en 10% sacharose doordrenkte katoen. (B) volwassen vrouwelijke M. domestica in een container van oviposition assay met voedsel (A), water (B), en larvale media (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Relatieve expressie van RPS6 in Ae. aegypti en M. domestica ingespoten met soortspecifieke dsRNAs. Aedes aegypti en M. domestica waren geïnjecteerd met 1 en 5 µg respectievelijk ofwel controle dsRNA (dsGFP) of dsRNA ontworpen tegen RPS6 of RPL26 afschriften van elk insect. Significante vermindering (P < 0.05) van RPS6 expressie werd waargenomen in muggen en vliegen ingespoten met dsRPS6 en door vliegen ingespoten met dsRPL26 (aangegeven met een asterisk). Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SE en op basis van kolom nummer geeft aantal individuen onderzocht. Dit cijfer is gewijzigd van Estep et al. 5 en Sanscrainte et al. 9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Gemiddelde koppeling grootte van Ae. aegypti en M. domestica ingespoten met soortspecifieke dsRNAs. (A) ei-afzetting werd aanzienlijk teruggebracht (P < 0.05) in zowel Ae. aegypti en M. domestica na injectie van 1 en 5 µg respectievelijk van beide besturingselementen dsRNA (dsGFP) of dsRNA ontworpen tegen RPS6 of RPL26 afschriften van elk insect. Sterretjes geven belangrijke verschillen ten opzichte van de controle van de dsGFP van dezelfde groep. Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SE en op basis van kolom nummer geeft aantal individuen onderzocht. Dit cijfer is gewijzigd van Estep et al. 5 en Sanscrainte et al. 9. (B) dosis curve van Ae. aegypti ingespoten met dsRPS6 uit 50 ng/vrouwelijk tot 1000 ng/vrouw toont aanzienlijke vermindering in de vruchtbaarheid in vergelijking met dsGFP geïnjecteerd cohorten (50, 100 en 1000 ng/vrouw). Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± 95% CI uit 36-81 individuele organismen per dosis. Punten met letters vertegenwoordigen significant verschil tussen groepen (P < 0.05) aangeduid met ANOVA. Dit cijfer is gewijzigd van Estep et al. 5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Microinjection is een waardevolle laboratorium-techniek om levering van dsRNA of andere biorationals (d.w.z., pesticiden, virussen, microsporidia). Terwijl veel laboratoria microinjection voeren, is het exacte bedrag geïnjecteerd vaak onduidelijk als gevolg van technische beperkingen van het uitvoeringssysteem waar geleverde volume niet rechtstreeks gemeten11. Geleverde volume en concentratie zijn kritische parameters waarmee berekening van toxicologische standaardmaatregelen zoals EC50 of IC50 of om te definiëren van de minimaal effectieve doses5,16. Dit is vooral belangrijk in functionele studies met behulp van RNAi bij volwassen insecten, waarbij levering per voeding niet altijd leidt tot systemische blootstelling aan de gewenste deeltjes en de werkelijke dosis, overschrijding van de middendarm onduidelijk5.
Hoewel de procedure microinjection kan aanvankelijk uitdagende, worden snelle verbeteringen in snelheid en levering nauwkeurigheid bereikt met de praktijk en geduld. Mastering de injectie-procedure zelf is een tijdsinvestering, maar zodra verwezenlijkt, de procedure wordt geproduceerd herhaalbare resultaten en letsel sterfte van < 3%. De verhouding van succesvolle injecties zal toenemen als de vaardigheid toeneemt waardoor injectie van 300 muggen of vliegt per dag.
Veel van de uitdagingen van microinjection zijn te wijten aan de naald wordt gebruikt. Bepalen van de juiste capillaire naaldpunt break en tip hoek is een uitdagende aspect van de procedure en vereist wat trial and error om te bepalen van de meest effectieve grootte van de opening voor een bepaalde soort. De fijne naald nuttigst voor mosquito microinjection (~ 150 µm) is te klein voor het snel leveren van het grotere volume geïnjecteerd in vliegen terwijl daarentegen de grotere naald openen dat werkt op vliegen (~ 250 µm) uitgebreide schade schade aan de kleinere muggen veroorzaakt en onaanvaardbaar injectie mortaliteit. Een naald gebroken met een botte uiteinde is vaak moeilijk te krijgen door middel van de epidermis zonder weefselschade en verhoogde sterfte. Insect schalen of weefsel stukken kunnen verstoppen naalden in de loop van een experiment, dus het is vaak handig om verschillende naalden trok als vervanging nodig is. We hebben gevonden dat het is makkelijker om een moeilijke naald vervangen in plaats van tijd besteden aan het proberen om een vastgelopen of vieze naald.
Observeren van de injectie-oplossing invoeren van het insect is essentieel zodat mislukte injecties kunnen worden verwijderd (Zie stappen 2.14-2.15). Rhodamine B toevoeging aan injectie oplossingen biedt een duidelijk visueel om ervoor te zorgen dat de koude-geënsceneerde insecten ontvangen van de juiste dosering en is vooral handig tijdens het beoefenen van (zie stap 2.7).
De hier gepresenteerde injectie en oviposition bioassay-methoden hebben met succes geïnduceerde gene vechtpartij en meetbare fenotypische effecten in volwassen Ae. aegypti en M. domestica wanneer met behulp van dsRNAs tegen soortspecifieke ribosomal ontworpen afschriften (Figuur 4 en figuur 5A). Bovendien, het vermogen van deze methode om het microvolumes nauwkeurig te leveren aan particulieren voorziet van dosis respons-curven voor kleine hoeveelheden materiaal moet worden gegenereerd (zo laag als 50 ng; Figuur 5B). Dit is vooral handig voor methoden zoals het screenen van siRNAs of dsRNAs, als de productie van grote hoeveelheden van deze moleculen kunnen kosten-verbiedend.
Deze methode kan worden aangepast voor het injecteren van biologische agentia (virussen, bacteriën, microsporidia) of chemische bestrijdingsmiddelen, na ervoor te zorgen dat elke levering buffers onschadelijk door injectie. Als levering volume is beperkt door de grootte van het insect, produceren geconcentreerd is testen oplossingen van belang.
Om adequaat evalueren dsRNA werkzaamheid, is het noodzakelijk om bij te houden van oviposition, zoals dodelijke fenotypen moge alleen bij nageslacht. Zoals hier gepresenteerd, vrouwelijke Ae. aegypti apart te houden na het blooding voorziet in de bepaling van de maat van de individuele koppeling en verder testen op de dezelfde personen kunnen worden gedaan stroomafwaarts van oviposition (dat wil zeggen, gen expressie studies, extra gonotrophic cycli, weefsel specifieke knockdown) naar het voortplantingsresultaat correleren met andere maatregelen, zoals de genexpressie. M. domestica oviposit in het algemeen in een reactie van de groep, is aanzetten tot geïsoleerde gravid vliegen te leggen zeer arbeid intensief en niet praktisch voor grote aantallen personen17. Daarom wordt een methode om te bepalen van de grootte van de gemiddelde koppeling gepresenteerd.
De methode van de microinjection gepresenteerde biedt consistente systemische levering aan muggen en huis vliegt. Gekoppeld aan mortaliteit en oviposition voor het bijhouden van bioassays, kunnen deze veelzijdige tools worden gebruikt om te beoordelen van de transcriptionele en fenotypische effecten van kleine molecules van RNA, biologische agentia en traditionele pesticiden waar mondelinge levering is niet haalbaar.
Disclosures
Alle auteurs zijn werknemers of contractanten van het Amerikaanse ministerie van landbouw of het ministerie van defensie. Dit manuscript werd geproduceerd in de loop van hun officiële taken verrichten en is door de wet in het publieke domein. De standpunten vertegenwoordigen het advies van de auteurs en vertegenwoordigen niet een officiële standpunt of de bekrachtiging door de Amerikaanse overheid. Vermelding van een commercieel product is geen aanbeveling voor gebruik.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson en Lucy Li Roxie White (USDA-ARS) voor hulp bij data-acquisitie en analyse. Wij danken ook Drs. Pia Olafson (USDA-ARS) en Ke Wu (Universiteit van Florida) voor kritische evaluatie van het manuscript en Niklaus Hostettler (Universiteit van Florida) voor het filmen van de Microscoop beelden. Financiering werd verstrekt door de USDA, het project van de WII - 141C van de Marine en Marine Corps Public Health Center en het ingezet oorlog strijders beschermingsprogramma. De financiers had geen rol in het ontwerp of de richting van de studie of de ontwikkeling van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
