Summary
Bu iletişim kuralı biz standart ve birkaç yıl boyunca belirli miktarda nükleik asitler, sivrisinekler ve evi sinekler hemolymph doğrudan teslim etmek için kullanılan bir mikroenjeksiyon metodoloji açıklar. Bu iletişim kuralı en az enjeksiyon mortalite sonuçları ve ilişkili doz ölçümleri verimlilik sağlar.
Abstract
Sentetik dsRNAs, RNA müdahale, ikna etmek için kullanılan doz bağımlı fenotipik etkileri olabilir. Bu etkilerin dsRNAs nicel olmayan bir yöntem kullanılarak sunulur tanımlamak zordur. Nükleik asit veya diğer kimyasallar bilinen miktarlarda doğru teslimat bileşikler arasında güvenilir karşılaştırma izin veren ve test edilen bileşiğin etkinliğini ölçmek için önemlidir.
Burada genellikle enjeksiyon yaralanma tarafından indüklenen ölümlerinin azaltılması doğru dsRNA, belirli dozlarda teslimini sağlar bir tekrarlanabilir, nicel mikroenjeksiyon protokol sağlamak. Bu değişiklikler rodamine B, mezun olunan enjeksiyon iğne ilavesi içerir ve bir Gelişmiş kurtarma yöntemi Isoe ve Collins ödünç aldım. Bu yöntem doz yanıt hesaplanması sağlar ve bileşikler arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırır. Bu yöntem sürümleri başarıyla üzerinde sivrisinek hem de evi sinekler yaşayan 3 cinsi ribozomal RNA transkript gen susturmak kaynaklanan verimlilik azaltılması değerlendirmek için kullanılmaktadır.
Bu iletişim kuralı küçük böcek mikroenjeksiyon birçok zorlukları azaltmak için stratejiler sağlar. Görsel doğrulama tarafından eşlik dsRNAs birlikte, mekanik teslim, kimlik'dır etkili yerleşimlerin bir enjeksiyon sonrası iyileşme döneminde dahil olun ve doğru dozaj ve düşük yaralanma mortalite. Bu iletişim kuralı da doğurganlık efektleri tek tip tayini için bir oviposition bioassay açıklar.
Introduction
Nükleik asitler gibi küçük biomolecules yetişkin dipterans için teslim hem Culicidae hem de Muscidae zor olduğu ispatlanmıştır. Oral dsRNAs alımını (sadece genler hedefleme ifade yetişkin testis içinde zaman) kısırlık ve larva Aedes aegypti(SNF7 ve steroid reseptör coactivator hedeflerken) mortalite üretmek için rapor1,2 . Ölüm Ayrıca gözlenen HSP70 larva sinek domesticahedeflerken3. Tür fenotipik etkiler, ancak, Yetişkin Ae. aegypti şeker yemek4,5dsRNA besleme sonra neden olmuş değil.
Mikroenjeksiyon patojenler veya nükleik asitler, böylece bir sistemik yanıt5,6,7,8,9,10 inducing sokarken midgut aşmak için kullanılan . Birçok mikroenjeksiyon tekniği var, otomatik ses teslimi için 2,3 düşük izin mikroişlemci kontrollü enjektörleri enjeksiyon birime görsel ölçüm gerektirir içi üretilen için aygıtlar arasında değişen donanımları içeren nL 5 , 9 , 10 , 11. ribozomal mRNA'ların, hedef RNA müdahale (RNAi) Tetikleyiciler bozabilir eklembacaklılar Rhipicephalus microplus, sığır kene birbirinden çok farklı sivrisinekler Aedes aegypti ve Culex pipiens, yumurtalık geliştirme ve ev sinek sinek domestica5,9,12,13. Bu çalışmalarda oviposition bozulma izleme fenotip fesih veya Döl azalma olarak tezahür gibi inoculant etkinliğini belirlemek için gerekliydi. Bu gibi Wolbachia -geleneksel olmayan biyolojik yöntemlerin çoğu kritik ve istenen yürürlükte erkek giriş (cinsel uyumsuzluk) enfekte ve kısırlık5 RNAi indüklenen multigenerational öldürücü fenotip şeklidir ,9,14. Mortalite ve verimlilik izleme, karakterize ve çok özel biorationals (doğal olarak meydana gelen patojenler ve/veya doğal türevleri)15gelişimi için gereklidir.
Bu iletişim kuralı yetişkin sivrisinek ve evi sinekler için detaylı mikroenjeksiyon teknikleri sunar; Literatürde de anlatılan kez değil bir süreç. Ayrıca, yeterince yetişkin dipterans dsRNA etkileri değerlendirmek için oviposition bioassay yöntemleri açıklanmıştır. Bu protokoller Aedes aegypti ve sinek domestica için özel olarak geliştirilen ancak diğer türler için değiştirilebilir.
Protocol
1. böcek hazırlık
- Sivrisinekler onları birkaç saat veya 2 dk maruz CO2 4 ° C'de ürpertici ve enjeksiyon önce 4 ° C'de tutma tarafından anestezi. Soğuk anestezi 4 ° C 2\u20123 enjeksiyonu öncesinde s, sinekler. Sivrisinek ve sinekler şeklindeki oviposition bir yanıt değişken ise emin olun.
Not: Türler ve zorlanma sivrisinek anesthetization yöntemi bağlıdır, Örneğin, Culex kurtarmak Aedes aegypti daha soğuk anesthetization dan çok daha hızlı ve bu nedenle CO2 nakavt tercih edilir. - Buz üzerinde dikkatle mikroskop slaytlar ~0.5 cm üzerinde ayrı sahne sivrisinek veya sinekler onları ventrally yatıyordu için yumuşak forseps kullanarak maruz. Standart slayt 6 sivrisinekler her iki satır tutabilir veya 6-7 ev uçar. Slayt sivrisinek veya slayt işleme yardımcı olmak için sinekler açık sol veya sağ ucunda 1-1.5 cm boşluk bırakın.
- Enjeksiyon için hazır kadar büyük Petri yemeklerinde 4 ° C'de slaytlar hazırlanmış böceklerin tutun.
Not: Petri kabına kapak delik delme, böcekler tarafından hava deplasman kapatma zaman rahatsız üzerinden engellenmesine yardımcı olur. Bir çift çanak dibine güvenli cam kapiller slaytları yerleştirme Petri kabına kaldırılması kolay olmayacaktır.
2. böcek enjeksiyon
- DsRNA Estep vd tarafından açıklandığı şekilde hazırlayın 5 ve Sanscrainte vd. 9. kirletici ücretsiz, dsRNA 260 nm ve olarak260 × seyreltme faktörü × 40 μg/ml hesaplamak RNA konsantrasyon absorbans ölçmek için bir spektrofotometre kullanarak sayısal eğer.
- Mikroskop ve microinjector bir sakin tablo veya sığ buz kovası üzerinden dissekan kadar soğuk anestezi sivrisinek ve sinekler (adım 1.1-1.3 ve Şekil 1bakınız) enjeksiyonları gerçekleştirmek için ayarlanmış.
- İğne çektirme ile iyi bir ipucu için cam kılcal çekin (ayarları: ısıtıcı 15 adet = solenoid = 4 A).
Not: Tablo malzemeleri üretici Ayrıntılar için bkz. - Kapiller iğne başı olarak üreticinin yönergeleri ve ara iğne ucu microinjector forseps bir sivri üretmek için bir çift ile pinching tarafından yerleştirin.
Not: Sivrisinek için ~ 150 µm ve ~ 250 µm Mooche için önerilen iğne açılış boyutları vardır. - Microinjector istenen teslimat birim için ayarlayın. ~ 50 nL aliquots hareketinden menisküs kolayca gözlemlenebilir ve sivrisinek microinjections için tavsiye. Varsa, Hızlı enjeksiyon ayarları etkinleştirin. İğne doldurma ve 3 kez nükleaz ücretsiz su kovma durulayın.
- Böyle 100\u2012150 nL sivrisinekler için istenilen doz ve 500 nL sağlayacaktır sağlamak bir konsantrasyon, enjeksiyon dozu evi sinekler için istenen çözümleri hazırlamak.
Not: ilk doz önerisi: 1 µg her sivrisinek için ve her sinek5,95 µg. - İsteğe bağlı olarak sivrisinekler için 3,0 µg/mL nihai bir konsantrasyon Solutions'da rodamine B (görselleştirme yardım etmek için) ekleyin.
Not: Boya sızdırma yoluyla karın/göğüs kesişme noktalarında ventral yüzeyinde neredeyse açık kütikül sonra pembe rengini tarafından açıkça görünür. - 3-4 µL üzerine temiz bir yüzey (örneğin parafin film parçası) enjekte ve herhangi bir hava emme olmadan cam iğne çekmek için çözüm pipette. İğneden dağıtmak ve yavaşça damlacıkları ile hassas görev silecek Sil sıvı başlayana kadar ekleme düğmesini art arda basın.
Not: microinjectors bazı modelleri dolgu şırınga gerektirirken, enjektör Malzemeleri tablo başvurulan değil. - Bir ultra-ince noktası işaretçisi kullanarak karma işareti ~ 1 mm ayrı sıvı menisküs iğne şaftlı başlayarak çizin. Bu menisküs hareket görselleştirme yardım edecek ve çözüm sivrisinek enjeksiyon sırasında girdi sağlamak.
- Sivrisinek veya (adımları 1.2-1.3 hazırlanırken) sinekler slayt iğne altında sakin tablo veya buz (Şekil 1) ayarlayın. Emin olun bu tarla-in görüş mikroskop içinde çözüm menisküs iğne içinde görmek yeterince geniş.
- Sivrisinekler için iğne orta 1 / 3'mesokatepisternum (Şekil 2A) ile hizalayın ve forseps ile sivrisinek iğne karşı canlandırıcı karşı tarafta yerleştirilmiş iken, yavaşça İğne ucu kullanarak ile kütikül ponksiyon microinjector mikrometre.
- Evi sinekler için iğne mesopleuron (Şekil 2B) ile hizalayın ve sinek iğne karşı canlandırıcı iken, yavaşça kütikül iğne ucu delik.
- Yavaşça iğneyi sivrisinek kaydırın veya ucu orta hat geçene kadar vücut sinek.
Not: sık sık iğne çok sığ ekleme dışında böcek enjekte sıvı boncuk sonuçlanır (bkz. Adım 2.15). - Kadar sıvı istenilen miktarda enjekte iğne sıvı menisküs hareketi için izlerken, ekleme düğmesi düşürmek. Sivrisinekler için Eğer 50,6 nL aliquots ayarla, 2 X 100 ~ tuşuna basın nL veya 3 X için ~ 150 nL. Evi sinekler için ekleme düğmesi düşürmek ~ nL enjekte 500 kadar (Yani, 69 nL aliquots ile basın 7 X 483 için nL).
- Menisküs taşımaz, yavaş yavaş sivrisinek slayt veya iğne menisküs hareketi için izlerken sinek. Enjekte çözüm boncuk iğne kaldırma veya menisküs taşımak başarısız olursa üzerine kütikül dışında bir kısmını almayı iptal ederseniz böcek olarak bu enjeksiyon başarısız oldu.
- 10-15 grupları halinde başarıyla enjekte sivrisinek veya grupları 3,5 su bardağı tutan oz temizlemek için 5 sinekli ev aktarın. Kapaklı tül veya örgü ve oda sıcaklığında kurtarmak.
- Sivrisinek ve sinekler (1-2 h) elde ettiler sonra her holding Kupası % 10 sükroz çözüm ile ıslatılmış bir pamuk topağı üzerinde tersine çevirin.
Not: Bir şeker yemek10kolay erişim sağlayarak hayatta kalma sükroz pamuk AIDS üstüne fincan inversiyon. - Durulama iğne adım 2.5 enjeksiyon çözüm arasında olduğu gibi. Ne zaman enjekte bitmiş, atma iğneler bir uygun "Sharps" kap içinde kullanılır.
3. aedes aegypti mortalite ve oviposition bioassay
- Enjeksiyon sonra üç gün boyunca sivrisinek ile % 10 sukroz ve gözle görülür ölü sivrisinek sayısını kaydetmek devam edin.
- ≤12-inç Yapay membran (örneğin kollajen sosis kasa) taze kan (Yani, Aedes aegyptiiçin sığır) ve 60 ° c sıcak su banyosu içinde ısı ile doldurun.
- Kısaca bir kağıt havlu üzerinde haddeleme tarafından membran kuru ve 3,5 su bardağı net holding oz tül büyük harfler arasında yatıyordu. Beslenme geliştirmek için bir phagostimulant olarak veya tanıtıcı tarafından ısıtılan kan sosis kasa yüzeyinde insan tenler bırakmak temiz çıplak elleriyle Isıtma sonra kan ile 1 mM ATP spike.
- Kan, besleme sonra % 10 sükroz holding bardak üstüne ile batırılmış pamuk değiştirin ve sivrisinekler ~ 24 h için oviposition bardak aktarmadan önce dinlenmek izin.
- Yapı oviposition su bardağı doldurarak 3,5 oz bioassay bardak ~ 30 mL deiyonize H2O ve tohum çimlenme kağıt yerleştirme ile temizleyin (~ 4 cm genişliğinde ve 5 cm uzun dikey olarak çalışan sırtlar ile) alt Kupası ve karşı tarafı (Şekil 3A) . Kapaklı tül veya örgü ve küçük yarık (~ 1 cm) tül veya örgü cap altında kesti.
- 24 saat sonrası kan besleme küçük yarık (~ 1 cm) holding Kupası tül kap kesmek ve sadece başarıyla beslenen tek tek kadın transfer — görünür kan bolus karın ile — oviposition bardak (1 dişi/oviposition su bardağı) içine yumuşak ağız aspirasyon tarafından. Bir % 10 sükroz doymuş pamuk topu ile oviposition şapkalı küçük kesim kapatın.
- Bardak ~ 27 ° c sivrisinekler tam günlük mortalite izleme sırasında Hayır sağlamak 5\u20127 gün boyunca tutun. Yumurta bir diseksiyon kapsamı altında saymak.
4. sinek domestica mortalite ve oviposition bioassay
- Enjeksiyon sonra üç gün boyunca devam sinekler % 10 sükroz ile sağlamak ve gözle görülür ölü sinekler kaydedin.
- Üç gün sonra enjeksiyon, kısaca tüm sinekler bardak alt kısmında hareketsiz olana CO2 holding bardak dağıtımı Polietilen boru yerleştirerek sinekler anestezi.
- Transfer bir 4 L plastik kavanoz açılış (10 cm, Şekil 3B) kapsayan bir jarse kol ile oluşan bir temiz kafes uçuyor. Sinekli su ve toz sukroz, karışımı toz süt ve kurutulmuş yumurta sarısı bir 8 sağlar: dört gündür 8:1 oranı (cilt tarafından) kaydediliyor ve kaldırılıyor ölü sinekler her gün.
- Kuru malzemeyi pelleted % 25 hayvan ağırlığa göre yem ile % 75 buğday kepeği karıştırılarak taze sineği larva yetiştirme ortamı için hazır olun. (Bir damla su bile dışarı sıkılmış olabilir kadar) %62 nem ulaşmak için su ekleyin.
- Yukarıdaki taze larva medya 1:1 karışımı bir 2.5 cm çapında topu hazırlamak ve "kullanılan" sinek larva Orta (Orta içinde sinekler pupated daha önce). Topu siyah pamuk bez bir meydanda şal, aracılığıyla orta sıvı sızıntıları kadar hafifçe sıkmak, sonra bez topu çevresinde yer tutmak için lastik bantlar kullanın.
- Topu bir 60 mL kap koyun ve 5 h (Şekil 3B) için sinek kafeste yerleştirin.
- Yumurta oviposition ayırmamaktır durulayın ve yumurta kumaş kıvrım altından kaldırılır emin olun. Yumurta kümeleri bozabilir ve transfer damlalıklı bir mezun 20 mL santrifüj tüpü için aktarmak için salla.
- Yumurta yerleşmek ve kapatılan yumurta mezun tüp hacmi Not kadar bekleyin. Birimin ilâ 20 kapatılan yumurta hacmi X getirmek için yeterli su ekleyin. Su artı yumurta hacmi kaydedin.
- Manyetik heyecan çubuğuna veya güçlü karıştırma ile su ve yumurta süspansiyon karıştırma sırasında 1 mL damlalıklı bahşiş kullanma (ile kesilmiş ipucu son) 0.5 mL su ve yumurta süspansiyon üzerine çizgiler bir dizi önceden ıslatılmış siyah bez parçası dağıtmak için. Yumurta diseksiyon mikroskop altında saymak.
- 4,9 iki kez daha tekrarlayın. Sayar biri ciddi bir aykırı ise (tarafından diğer iki sayılarıyani farklıdır > % 35), dördüncü sayımı yapmak ve aykırı göz ardı.
- Yumurta örnek başına ortalama sayısını hesaplamak ve bu değer yumurta/mL süspansiyon sayısını elde etmek için 2 ile çarpın. 4.8. adımdaki yumurta süspansiyon hacmen alınan yumurta/mL değeri çarpın. Bu yumurta koydu toplam sayısı için tahmindir.
Representative Results
Sivrisinek dsRNA mikroenjeksiyon
Bu mikroenjeksiyon yöntemi bizim laboratuvarda gen ekspresyonu, ölüm ve oviposition yanıt 80'den fazla dsRNA Tetikleyiciler için birkaç sivrisinek cins (Aedes, anofel, Culex) arasında değerlendirmek için kullanılmıştır. Kadın Ae. aegypti (ORL1952) koloni zorlanma ribozomal transkript RPS6 ve RPL26 (Estep ve ark. bkz: türetilmiş dsRNA 1 µg ile enjekte 5 dsRNA üretim yöntemleri ve sıralı veri) gösterdi önemli göreli ifade (RE) birden çok oviposition genelinde azalma döngüleri ile kontrol dsGFP enjekte sivrisinekler karşılaştırıldığında. Aedes aegypti 2nd gonotrophic döngüsü ölçülen RE RPS6 ifade önemli azalma gösterdi (P < 0,05) içinde bir öğrenci t-testi aynı grubu (Şekil 4)5 dsGFP kontrolünü arasında tarafından belirlenen dsRPS6 enjekte sivrisinek .
Verimlilik burada açıklanan oviposition bioassay kullanarak bireysel kadın değerlendirildi. 3 gün sonra sonrası enjeksiyon, sivrisinekler beslenen, bireysel oviposition kaplara transfer ve tamamlanması koymak için izin kan vardı. İlk gonotrophic döngüsü için Ortalama debriyaj boyutları azaltılacağını her iki dsRPS6 Ae. aegypti tedavi için (n = 102 kadın, 1.3 ± 0,8 (ortalama ± SE) yumurta) ve tedavi dsRPL26 (n = 86 kadın, 4.0 ± 1.1 yumurta) dsGFP enjeksiyonu için karşılaştırıldığında (n = 79 kadın, 49.3 ± 3.5 yumurta, Şekil 5A). İkinci bir gonotrophic döngü sonra debriyaj değerlendirmesi de önemli ölçüde azaltılmış oviposition her iki tedavi dsRNA Grup, ancak daha düşük etkisi boyutu gösterdi. Ae. aegypti Grup boyutları değişken olduğunu ve böylece anlamına gelir ayrılık Dunn'ın testi5tarafından gerçekleştirildi. Yirmi dört saat ölüm oldu normalde % 3 veya daha az.
Bir açık doz etkisi ne zaman 50'ye 1 µg üzerinden dsRPS6 enjekte gözlendi ng kadın Ae. aegyptive debriyaj boyutta çeşitli önemli ölçüde zaman 25 ng/erkek dsRPS6 doz (5B rakam) hariç hepsi 1 µg/erkek dsGFP enjekte denetimlere göre.
DsRNA evde mikroenjeksiyon uçar
Koloni sinek domestica (ORL normal) ile RPS6 ve RPL26 tutanaklar9ev anında karşı tasarlanmış dsRNA yapıları, 5 µg enjekte. Ae. aegyptiiçinde gözlemlediği gibi hem belirli transkript ifade (RPS6 ve RPL26) önemli azalma ve debriyaj boyutunda düşüş (Şekil 4 ve Şekil 5A) gözlenmiştir. İçinde yeniden önemli azalma öğrenci t-testi aynı grup dsGFP kontrolünü arasında tarafından kararlı (P < 0,05) ve Holm-Sidak testi önemi farklı M. domestica için debriyaj boyutları arasında belirlemek için kullanılan tedavi grupları. Sinekler beslenen dsGFP Tyndale-Biscoe ölçek9tarihinde puanlarına normal vitellogenin ifade varken yumurtalık diseksiyonlarının azaltılmış oogenesis dsRPS6 ve dsRPL26 tedavilerde gösterdi.
Şekil 1: microvolumes yetişkin sivrisinek ve evi sinekler için teslim etmek için Mikroenjeksiyon Kur. Enjeksiyonları mikroskop slaytlarda sakin bir masa üzerinde sahnelenen soğuk anestezi böcekler üzerinde gerçekleşir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Ae. aegypti ve M. domesticamikroenjeksiyon siteleri. (A) yetişkin Ae. aegypti Orta üçte biri mesokatepisternum enjekte. (B) yetişkin M. domestica mesopleuron enjekte. Oklar enjeksiyon siteleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Oviposition bioassay Kur. (A) Ae. aegypti oviposition tahlil tül ve % 10 sükroz batırılmış pamuk ile şapkalı bir oviposition substrat olarak tohum çimlenme kağıt ile su bardağı. (B) yetişkin kadın M. domestica bir oviposition tahlil kapsayıcısında ile gıda (A), (B) ve larva medya (C) su. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 4: RPS6 Ae. aegypti ve species-specific dsRNAs ile enjekte M. domestica göreli ifadesidir. Aedes aegypti ve M. domestica ile her iki kontrol dsRNA (dsGFP), sırasıyla 1 ve 5 µg enjekte veya dsRNA RPS6 veya RPL26 karşı her böcek gelen transkript tasarlanmış. Önemli azalma (P < 0,05) RPS6 sivrisinekler ve dsRPS6 ile ve enjekte sinekler dsRPL26 (yıldız işareti tarafından gösterilen) enjekte sinekler tarafından ifade gözlendi. Hata çubukları temsil ortalama ± SE ve sütun temel numaradan muayene bireylerin sayısını gösterir. Bu rakam Estep ve ark. değiştirildi 5 ve Sanscrainte vd. 9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Ortalama debriyaj boyutunu Ae. aegypti ve species-specific dsRNAs ile enjekte M. domestica . (A) yumurta ifadesi önemli ölçüde azaltılmış (P < 0,05) Ae. aegypti ve M. domestica ya denetiminin sırasıyla 1 ve 5 µg enjeksiyon sonra dsRNA (dsGFP) veya dsRNA tasarlanmış her böcek gelen RPS6 veya RPL26 transkript karşı. Yıldız aynı grup içinde bulunan dsGFP denetiminden önemli farklılıklar gösterir. Hata çubukları temsil ortalama ± SE ve sütun temel numaradan muayene bireylerin sayısını gösterir. Bu rakam Estep ve ark. değiştirildi 5 ve Sanscrainte vd. 9. (B) doz eğrisini 1000 ng/kadın için gelen 50 ng/kadın dsRPS6 enjekte Ae. aegypti verimlilik enjekte dsGFP tabur ile karşılaştırıldığında önemli indirimler gösterir (50, 100 ve 1000 ng/erkek). Hata çubukları 36-81 bireysel organizmaların doz başına ortalama ± % 95 CI temsil. Puan harflerle temsil eden gruplar arasında anlamlı bir fark (P < 0,05) ANOVA tarafından tanımlanan. Bu rakam Estep ve ark. değiştirildi 5. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Mikroenjeksiyon dsRNA veya diğer biorationals (Yani, pestisitler, virüsler, microsporidia) teslim edilmesini sağlamak için değerli laboratuvarı bir tekniktir. Birçok laboratuar mikroenjeksiyon yaparlarken, enjekte tutara tam olarak kez nerede teslim edilen birim doğrudan ölçülen11değil iletim sistemi teknik sınırlamaları nedeniyle belirsizdir. Teslim edilen birim ve konsantrasyon EC50 veya IC50 gibi standart toksikolojik önlemler hesaplamasına izin kritik parametreleri veya en az etkili tanımlamak için5,16dozlarda. Burada besleme tarafından teslim her zaman istenen parçacıklara sistemik maruz yol açmaz ve midgut geçiş gerçek doz belirsiz5yetişkin böcekler, RNAi kullanarak fonksiyonel çalışmalar önem kazanır.
Mikroenjeksiyon yordam başlangıçta zor olabilir iken, hızlı ilerleme hızı ve teslimat doğruluk içinde uygulama ve sabır ile elde edilir. Enjeksiyon yordamı mastering zaman yatırım olsa da, başarılı bir kez tekrarlanabilir sonuçlar ve yaralanma mortalite yordamı üretir < % 3. Yeterlilik 300 sivrisinek izin enjeksiyon artırır veya günlük sinekler gibi başarılı enjeksiyon oranı artacak.
Mikroenjeksiyon zorlukların kullanılan iğne nedeniyle çoğu. Uygun kapiller iğne kesme noktası ve uç açısı belirleme yordamı zorlu bir yönüdür ve belirli bir tür için en etkili açılış boyutunu belirlemek için bazı deneme ve hata gerektirir. İnce iğne sivrisinek mikroenjeksiyon (~ 150 µm) için en yararlı hızlı uçar ise tersine, inşaat üstünde uçar (~ 250 µm) daha küçük sivrisinek geniş yaralanma hasara neden açılış büyük iğne içine enjekte hacmin daha büyük teslim etmek için çok küçük ve kabul edilemez enjeksiyon ölüm. Künt bir ucu ile kırık bir iğne genellikle doku hasarı ve artan ölüm olmadan kütikül yoluyla almak zordur. Yani sık sık değiştirilmesi gerekiyorsa çekti birkaç iğne için yararlı böcek ölçekler veya doku parçaları iğneler bir deney boyunca yapışmasına neden olabilir. Biz zor bir iğne yerine yerine sıkışan veya faul iğne temizlemek için deneyin için zaman harcamak daha kolay olduğunu bulduk.
Böylece başarısız enjeksiyonları-ebilmek var olmak çıkarmak (bkz. Adım 2,14-2.15) böcek girerek enjeksiyon çözüm gözlem çok önemlidir. Enjeksiyon çözümleri için rodamine B ek soğuk sahnelenen böcekler uygun dozaj almak ve (bkz. Adım 2.7) pratik yaparken özellikle yararlıdır emin olmak için net görüntü sağlar.
Burada sunulan enjeksiyon ve oviposition bioassay yöntemleri başarıyla gen neden olmuş yetişkin Ae. aegypti ve dsRNAs kullanarak species-specific karşı ribozomal tasarlarken M. domestica devirme ve ölçülebilir fenotipik etkileri Transkript (Şekil 4 ve Şekil 5A). Ayrıca, yeteneği bu yöntemin doğru kişilere microvolumes sunmak için az miktarda malzeme için oluşturulacak doz yanıt eğrileri sağlar (gibi düşük 50 ng; Şekil 5B). Bu Çift Eleme gibi yöntemleri için özellikle yararlı olur veya bu moleküller büyük miktarda üreten dsRNAs, maliyet engelleyici olabilir.
Bu yöntem biyolojik ajanlar (virüs, bakteri, microsporidia) veya kimyasal böcek ilaçları, iğne ile kontrol ettikten sonra herhangi bir teslimat arabellekleri zararsız enjekte etmek için değiştirilebilir. Teslimat birim konsantre boyutunu üreten böcek tarafından sınırlı çözümleri test açısından önemlidir.
Yeterince dsRNA etkinliğini değerlendirmek için öldürücü fenotipleri sadece döl içinde tezahür oviposition izlemek gereklidir. Burada sunulan kadın Ae. aegypti ayrı ayrı blooding sonra holding bireysel debriyaj boyutu belirlenmesi için izin verir ve daha fazla aynı bireyler üzerinde test yapılabilir oviposition (Yani, gen ifade çalışmaları, aşağı üreme çıkış gen ekspresyonu gibi diğer tedbirler ile ilişkilendirmek için ek gonotrophic döngüleri, doku belirli devirme). M. domestica genellikle Hayır Grup yanıt olarak, izole gravid sinekler bırakmaya teşvik çok emek yoğun ve çok sayıda bireyler17için pratik değil gibidir. Bu nedenle, ortalama debriyaj boyutunu belirlemek için bir yöntem sunulur.
Burada sunulan mikroenjeksiyon yöntemi sivrisinek ve evi sinekler için tutarlı sistemik iletir. Ölüm ve biyoanalizler izleme oviposition ile birleştiğinde, bu çok yönlü araçları küçük RNA molekülleri, biyolojik ajanlar ve geleneksel tarım ilaçları transkripsiyon ve fenotipik etkilerini değerlendirmek için oral teslimat uygun olmadığı kullanılabilir.
Disclosures
Çalışanlarınızdan veya yüklenicilerinizden ABD Tarım Bakanlığı veya Savunma Bakanlığı tüm yazarlar vardır. Bu el yazması resmi görev süresince üretilen ve kamusal alanda yasa gereğidir. Görüşler yazarlar görüşü temsil eden ve bir resmi konumunu veya ciro ABD hükümeti tarafından temsil etmemektedir. Ticari bir ürün söz kullanmak için bir tavsiye değil.
Acknowledgments
Hanayo Arimoto (ABD Deniz Kuvvetleri) yazarlar teşekkür, Dana Johnson, Lucy Li ve Roxie beyaz (USDA-ARS) için veri toplama ve analizi ile yardımcı olur. Biz Ayrıca Drs. Pia Olafson (USDA-ARS) ve Ke Wu (University of Florida) el yazması ve Niklaus Hostettler (University of Florida) kritik İnceleme için mikroskop görüntüleri filme için teşekkür ederiz. Finansman USDA tarafından deniz kuvvetleri ve deniz piyadeleri genel sağlık merkezi ve konuşlandırılmış savaş savaşçılar koruma programı WII - 141 C projesi sağlandı. Fon tasarım veya çalışma yönünü veya el yazması gelişimi herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
