Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تعريب كوروليس موقعا في الدماغ الماوس

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/58652
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 4, 1
1Department of Physiology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University, 3Department of Molecular and Medical Genetics, OHSU, 4X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

كوروليس موقعا من مجموعة صغيرة من الخلايا العصبية المعنية في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإعداد الماوس الدماغ أقسام لدراسات للبروتينات والمعادن في هذه النواة.

Abstract

كوروليس موضع (LC) هو محور رئيسي لإفراز إنتاج الخلايا العصبية التي تعدل عددا من الوظائف الفسيولوجية. تشوهات هيكلية أو وظيفية من LC تؤثر على عدة مناطق المخ بما في ذلك اللحاء، والحصين، والمخيخ، وقد تسهم في الاكتئاب والاضطراب الثنائي القطب، والقلق، وكذلك مرض باركنسون ومرض الزهايمر. غالباً ما تكون هذه الاضطرابات المرتبطة بانتهاك معدنية، بل يفهم دور المعادن في LC جزئيا فقط. الدراسات الفنية والسمات من LC ضرورية لفهم أفضل للأمراض البشرية ومساهمة من المعادن. الفئران نموذج تجريبي مستخدمة على نطاق واسع، ولكن الماوس LC الصغيرة (~0.3 مم) ومن الصعب تحديد لغير خبراء. هنا، يمكننا وصف بروتوكول المستندة إلى إيمونوهيستوتشيميستري خطوة بخطوة لتعريب LC في الدماغ الماوس. وتستخدم الدوبامين-β-hydroxylase (هذا)، وبدلاً من ذلك، تيروزين hydroxylase (TH)، كلا الإنزيمات عالية المعرب عنها في قانون العمل، كعلامات المناعي في شرائح المخ. يمكن استخدام الأقسام المتاخمة للمقاطع التي تحتوي على LC لمزيد من التحليل، بما في ذلك علم الأنسجة للدراسات المورفولوجية واختبار التمثيل الغذائي، فضلا عن تصوير المعادن بالأشعة السينية fluorescence مجهرية (إكسفم).

Introduction

كويروليوس موضع (LC) منطقة هامة في الدماغ وموقع رئيسي ل إنتاج إفراز (شمال شرق)1. قانون العمل يرسل الإسقاطات في جميع أنحاء الدماغ2 للقشرة وفي قرن آمون و المخيخ3 وينظم العمليات الفسيولوجية الرئيسية، بما في ذلك إيقاع سيركاديان4،5، الانتباه والذاكرة6، نشدد على7،8من العمليات الإدراكية والعاطفة9،10. اختلال وظيفي LC متورط في الاضطرابات العصبية والنفسية العصبية11، بما في ذلك باركنسون مرض12،،من1314، مرض الزهايمر14، الاكتئاب15 ،،من1617والهوس الاكتئابي18،19، والقلق20،21،،من2223، 24-ونظرا لهذه الأدوار، تحليل LC أمر حاسم لدراسة وظيفتها والخلل الوظيفي.

الفئران تستخدم على نطاق واسع لدراسات العمليات الفسيولوجية وباثوفيسيولوجيك. نظراً لصغر حجمها، قد الماوس LC متوسط قطرها ~ 300 ميكرومتر، مما يؤدي إلى صعوبة في تحديد موقع الهيكل. خلال تقطيع المخ، يمكن بسهولة تضيع قانون العمل في أقسام الاكليلية أو السهمي. الدراسات المتاحة التي تصف تحديد LC في الحيوانات لا توفر بروتوكول خطوة بخطوة أن اتباع غير خبير1،25. وهكذا يصف لنا لتقديم الإرشاد لتوطين LC، بروتوكول التي طورناها لتحديد موقع هذه المنطقة في الدماغ الماوس للعديد من التطبيقات (الشكل 1، الشكل 2، الشكل 3). ويسري البروتوكول بكشف الدماغ التي تسيطر عليها بعناية تمزيقها والمناعي هذا26،27، أو بدلاً من ذلك ال24، كلا الإنزيمات عالي التخصيب في ش28. حالما يقع LC إيمونوهيستوتشيميستري، يمكن استخدام شرائح المخ المجاورة لإجراء مزيد من الدراسات، بما في ذلك التحليلات المورفولوجية والايض، فضلا عن دراسات التصوير المعادن عن طريق الأشعة الفلورية مجهرية (إكسفم)29. يصف لنا إكسفم كمثال في هذا البروتوكول (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأقر دراسات الحيوانات "رعاية الحيوان جامعة جونز هوبكنز"، واستخدام (ACUC) البروتوكول رقم M017M385.

1. تشريح الدماغ

  1. لشل، تخدير الفئران من تطبيق إيسوفلوراني 3%.
    1. نقع القطن كرة مع قطرات إيسوفلوراني ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي 15 مل. مكان الآنف الحيوان في الأنبوب والسماح يستنشق في إيسوفلوراني. البحث عن عمق التخدير بعدم الاستجابة رشة تو.
  2. ضع الحيوان على ظهرها وشل أنها بتعلق الحدود القصوى إلى أسفل بدبوس تي أثناء وبعد الوصول إلى البطن.
  3. قطع الحيوان مع المقص الجراحي بجعل قصاصة من جلد البطن وقطع طريق الجلد في منطقة الصدر. دبوس الجلد باستمرار باستخدام دبابيس T. ثم كسر الغشاء البريتوني حتى الصدر. كشف القلب بتكسير تجويف الصدر وقطع الحجاب الحاجز.
  4. قطع الاذين الأيمن للسماح للدم بالتدفق من الحيوان. إدراج حقنه 10 مل بإبرة قياس 25 في البطين الأيسر ونتخلل مع 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
    ملاحظة: يسمح هذا الحل للتدفق من خلال الدوران الجهازي والخروج عن طريق الاذين الأيمن.
  5. إزالة حقنه 10 مل وإدراج إبرة 25-قياس المرفقة للمحاقن 60 مل. نتخلل عن طريق البطين الأيسر مع 50 مل من الجليد الباردة 4% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين).
    1. إعداد الجليد الباردة حل منهاج العمل 4% بتمييع الحل منهاج العمل 10% في ح2س وتقشعر لها اﻷبدان 4% PFA الحل النهائي في 4 درجات مئوية.
  6. عزل رئيس الماوس وإزالة الدماغ من الجمجمة.
    1. قطع الجلد من الرقبة ومن ثم قطع نحو العينين لفضح الجمجمة. الكراك الجمجمة من الرقبة إلى الآنف، ومن ثم من مقلة العين واحدة إلى أخرى. قشر الجمجمة خارجاً والمكوس في الدماغ كله.
  7. احتضان الدماغ في 4% PFA عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية.
  8. نقل الدماغ مع الملقط في أنبوب 50 مل مخروطية مليئة 25 مل محلول السكروز 30%. يبقيه في 4 درجات مئوية عن 48-72 ح حتى الدماغ المصارف إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  9. قص الدماغ مع تقطيع اللحم والمخ ماوس الكبار coronal المصفوفة عن طريق midbrain (الخلفي ~ 3 مم من بريجما). يحتفظ بالمقطع الدماغ المتضمن في الدماغ.
    ملاحظة: سيؤدي هذا في قسمين الدماغ – واحد أكثر تحتوي على قشرة (الأمامي للقص) وواحدة تحتوي على المخيخ/جذع الدماغ (الخلفي القطع). استخدم المقطع جذع الدماغ للخطوات التالية.
  10. تضمين المقطع جذع الدماغ مع سطح قطع توضع على الجزء السفلي من العفن التضمين، محاطة بدرجة الحرارة المثلى قطع مجمع (أكتوبر)؛ تحريك الدماغ المضمنة لثلاجة-80 درجة مئوية وتجميد لمالا يقل عن 12 ح – حتى استخدامها مرة أخرى.
  11. قطع في كريوستات: مكان تضمين القالب يحتوي على الدماغ في أكتوبر في كريوستات؛ احتضان أنه في كريوستات لعدة ساعات لضبط درجة حرارة كتلة الدماغ كريوستات.
  12. قشر بعيداً العفن التضمين لفضح أكتوبر كتلة تحتوي على الدماغ.
  13. استخدام شفرات الحلاقة لإزالة فائض أكتوبر من على سطح أرض الكتلة دون لمس الدماغ.
  14. تحميل كتلة أكتوبر على تشاك كريوستات، تعريض سطح قطع من الدماغ نحو الأمام.
  15. ضبط قطع سطح الدماغ حيث أنه هو التوجه بالتوازي مع رازوربلاديس كريوستات.
  16. تقليم الدماغ تبدأ في لب، قطع 100 ميكرومتر المقاطع روسترالي.
  17. تقليم روسترالي حتى قطع المخيخ وجذع الدماغ كشريحة واحدة مستمرة. البدء في جمع شرائح في 50 ميكرون سمك.
    ملاحظة: كأحد الديكورات روسترالي من لب، سيتم قطع جذع الدماغ والمخيخ كقسمين منفصلين. في المقاطع روسترال، ستندمج جذع الدماغ والمخيخ في نهاية المطاف على الصعيد البطينال 4. وبمجرد الحواف الجانبية البطينال 4 بشكل جيد، ثم سوف يخرج المخيخ وجذع الدماغ كشريحة واحدة مستمرة.
    1. جمع شريحة الدماغ أكتوبر محاطة بالملقط ووضعه في بئر صفيحة 24-بئر مليئة ببرنامج تلفزيوني (الشكل 2a). وسيكون قانون العمل أبرز عندما يلتقي بعضها البعض المخيخ ووالاكيميه أقل شأنا في ~-5.52 مم الخلفي من بريجما (الشكل 1b).
      ملاحظة: الجزء الأمامي أكثر من LC سوف تختفي بمجرد المخيخ وقد كان مقطوع تماما ولم يعد يحيط والاكيميه أقل شأنا في ~-5.34 الخلفي مم من بريجما (الشكل 1 ج).

2-إيمونوهيستوتشيميستري β-Hydroxylase الدوبامين أو Hydroxylase التيروزين (الشكل 2)

  1. 1 يوم
    1. تغسل شرائح مختارة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    2. بيرميبيليزي على ح 24 في 0.5% فوسفات مخزنة المالحة مع المنظفات الصناعية (ببسد) في 4 درجات مئوية.
      1. تمييع ميليلتر 125 من المنظفات في 25 مل من برنامج تلفزيوني.
  2. 2 يوم
    1. تغسل شرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في 0.5% ببسد.
    2. إضافة جسم الأولية أو مكافحة هذا ال المناهضة ح 18 في إضعاف 1: 500 في 0.5% ببسد عند 4 درجة مئوية.
  3. 3 يوم
    1. تغسل شرائح ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في 0.5% ببسد.
    2. إضافة جسم الثانوي المطلوب (488 حمار المضادة أرنب الفلورية الخضراء) في إضعاف 1: 1000 في 0.5% ببسد ح 16.
    3. التفاف لوحة جيدا 24 في الألومنيوم والمكان في 4 درجات مئوية.
    4. تغسل شرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في 0.5% ببسد.
    5. المياه والصرف الصحي لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    6. نقل الشرائح بواسطة فرشاة قلم رصاص في وعاء الماء.
    7. جبل شرائح عائمة في المياه على الشرائح مشحونة.
    8. أقسام ساترة مع تصاعد هاردسيت وسائل الإعلام (بدون DAPI).
    9. الجاف لأقسام الدماغ المحملة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    10. شرائح المخ الصورة في مجهر [كنفوكل] أو الفلورسنت مع الإعدادات للكشف عن إشارة من الطول الموجي فلوروفوري جسم الثانوية المناسبة.
    11. ضبط المجهر إلى المستوى البؤري لشريحة الدماغ وتأخذ صورة واحدة في 10 X التكبير.
    12. لتحديد موقع منطقة LC ممكنة في شريحة الدماغ، استخدم البطينال 4 للتوجيه؛ يقع المخيخ أعلاه البطين، توجد بونس والدماغ أقل من30.
    13. لتحديد موقع قانون العمل، التركيز على الحواف الجانبية البطينال 4؛ قانون العمل تنبع من حواف البطينال 4 والنقاط نحو بونس/منطقة جذع الدماغ (الشكل 2، ج 2).
    14. وبعد التصوير والتعريب من قانون العمل في بعض شرائح المخ، تخزين الشرائح التي تحتوي على شرائح المخ عند 4 درجة مئوية.

3-الكشف عن قانون العمل في شرائح المخ

  1. لتحديد موقع المقطع الدماغ الذي يحتوي على قانون العمل، شريحة الدماغ الماوس كما هو موضح أعلاه وجمع المقاطع في برنامج تلفزيوني شغل 24 الأطباق جيدا، كما هو مبين في الشكل 2 ألف.
    1. ضع مقطع واحد من الدماغ الواحدة وكذلك للسماح للتعريب السليم لقانون العمل.
  2. جمع ما مجموعة 48 شرائح الدماغ التي سيتم إيمونوستينيد في المخ.
    ملاحظة: جميع الآبار من أطباق اثنين هو موضح في الشكل 2 ألف تحتوي على شرائح الدماغ من الحيوان واحدة.
  3. إيمونوستاين كل الشريحة الثالثة إلى الخامسة لهذا، أو ث. ويفضل إجراء إيمونوهيستوتشيميستري من تلك الشرائح المخ المجاورة لتلك التي هي جزيئي أخرى (عن طريق الأشعة الفلورية مجهرية، إكسفم).
    ملاحظة: يسمح هذا الإجراء للتعريب الدقيق لقانون العمل في شرائح الفحص النهائي (الشكل 2a؛ المسمى بالأرقام بين الآبار).
  4. ضبط عدد شرائح الدماغ التي إيمونوستينيد اعتماداً على التطبيق، مثلاً، ما إذا كانت تتطلب المكان المحدد للمركز وحافة من قانون العمل، أو مجرد تقريب.
  5. وعقب إيمونوهيستوتشيميستري، الكشف عن شرائح المخ التي تتضمن LC عبر نمط مميزة للتعبير في كلا الجانبين البطينال 4 (الشكل 2، ج 2). تكبير الإشارة هذا في LC شرائح متتالية الدماغ هو مبين في الشكل 2d، 2e؛ الصورة المكبرة من قانون العمل الذي هو الملون ليبين ال الشكل 2 واو-
  6. استخدام الأقسام المتاخمة لتلك LC تحتوي على إجراء مزيد من الدراسات-في هذه الحالة إكسفم لقياس مستويات المعادن (الشكل 3).
  7. لإجراء إكسفم، جمع شرائح رقيقة الدماغ الاكليلية ميكرومتر (اعتماداً على إعداد) 10-30 على رقيقة البوليمرية التي يمكن تركيبة على أصحاب العينة وتصويرها في السنكروتروني.
  8. تخزين شرائح الدماغ التي تعد رقيقة البوليمرية إكسفم في درجة حرارة الغرفة وأداء إكسفم.

4-المعادن التصوير في LC عبر إكسفم

  1. شريحة الدماغ الماوس المثال كما هو موضح أعلاه، تحدد LC، وقياس مستويات المعادن عن طريق إكسفم من هذه الشرائح المخ الذي يحتوي على قانون العمل.
  2. صورة توزيعات عنصري على بيمليني 2-معرف-ه في "مصدر فوتون متقدمة" (مختبر أرغون الوطني، إيل أرجون).
  3. تسجيل بيانات 'على الطاير' كما هو موضح سابقا31.
  4. تحديد تركيزات عنصري في شرائح المخ الذي يحتوي على قانون العمل استخدام ال32،خرائط البرنامج33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تغييرات في التوازن المعادن (مثل النحاس والحديد والزنك و Mn) غالباً ما يلاحظ في اضطرابات عصبية، بما في ذلك التغييرات في34،LC35. وبالتالي، تحديد مستويات المعادن في الدماغ ضروري لفهم آليات المرض. أقسام الدماغ التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكول وصف يمكن استخدامها لقياس مستويات النحاس والمعادن الأخرى في قانون العمل ومقارنتها بالمستويات في المناطق خارج قانون العمل. (الشكل 3). في المثال الخاص بنا، شريحة الدماغ التي تم قطع طريق LC، الفوسفات، البوتاسيوم، وتم قياس الكلوريد والنحاس. تم رفع النحاس فقط على وجه التحديد في قانون العمل. يمكن أيضا إجراء أعلى التصوير XFM القرار (لا يظهر هنا) للكشف عن سوبسيلولار توزيع مستويات المعادن. كذلك تشمل التطبيقات الممكنة لهذا البروتوكول الكشف عن الوفرة والتوزيع داخل الخلايا من هذا (الشكل 2b، 2d، 2e) وال (الشكل 2 ج، 2f) وغيرها من البروتينات التي أعرب عنها في قانون العمل فردياً أو في شارك تلطيخ فحوصات، دراسات مورفولوجية LC وكثافة الخلايا العصبية.

Figure 1
رقم 1: توطين LC في الدماغ الماوس. () مما يدل على منطقة الدماغ التي سوف تكون مقطوع لترجمة قانون العمل التخطيطي. (ب) استناداً إلى الدماغ أوضح وفرانكلين أطلس30، LC ستكون أبرز عندما يجتمع والاكيميه المخيخ ودونية الآخر (مم-5.520 الخلفي من بريجما). وتوضح الصورة اليسرى مقطع الاكليلية قطع طريق LC، بينما يوضح الصورة الصحيحة تعريب LC على الحواف الجانبية البطينال 4 عن طريق تلطيخ نسل. جزء (ج) الأمامي أكثر من LC سوف تختفي بمجرد المخيخ وقد كان مقطوع تماما ولم يعد يحيط والاكيميه السفلي (الخلفي مم-5.340 من بريجما). وتبين نسل تلطيخ على الصورة الصحيحة فقط موجودة بشكل هامشي في هذه الشريحة الاكليلية LC. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الكشف عن LC بالمخ إيمونوستينينج شرائح لهذا أو ث. () الدماغ ماوس واحدة كان مقطوع إلى 50 ميكرومتر شرائح حول جذع الدماغ والتي جمعت في 24 اثنين من الأطباق جيدا. تم تحميل كل 5th إلى شريحة الدماغ التي جمعتال 8 على الفيلم غطت ساترة للتصوير عبر XFM. تتم تسمية هذه الشرائح مع أرقام زرقاء بين الآبار. المتاخمة شرائح عائمة في برنامج تلفزيوني تم إيمونوستينيد لهذا لكشف LC (المسمى مع الصليب الأحمر في الآبار). دوائر خضراء دلالة إيجابية شرائح لإشارة هذا، وهكذا تحتوي على LC. (ب) الدماغ الاكليلية شريحة تتضمن LC كان إيمونوستينيد مع هذا وتصويرها في مجهر [كنفوكل]. الصورة تظهر إشارة قوية في قانون العمل (باللون الأخضر). (ج) الاكليلية شريحة تحتوي على LC إيمونوستينيد ل hydroxylase التيروزين (TH) وتصويرها على مجهر فلوري. صورة تظهر إشارة قوية ل LC اليمين واليسار على حد سواء. (د) شرائح إيمونوستينيد لهذا، وتتضمن شرائح 7 (على اليسار) و 9 (على اليمين) LC. واختيرت الأقسام المتاخمة لتحليل إكسفم. (ﻫ) 10 شريحة كما أظهرت LC. في هذا القسم، قطعت LC الأيسر من خلال مركزها بينما تم القبض على حق LC في الحافة الأمامية معظم به. (و) قسم تتضمن LC إيمونوستينيد لل وتصويرها في مجهر [كنفوكل]. تظهر الصورة ال معربا عن الخلايا العصبية في قانون العمل المسمى باللون الأخضر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مستويات تصوير معدن في قانون العمل- دماغ الفأر عمرها 12 أسبوع الذكور مع بالضربة قاضية للناقل Cu ATP7B معزولة وإعداد كما هو موضح في هذا البروتوكول. أخذت شرائح الملطخة بعدم المتاخمة للمقاطع التي تحتوي على LC وتم قياس مستويات المعادن عن طريق إكسفم. على وجه التحديد زادت مستويات cu في LC (المسمى بالأسهم الصفراء) مقارنة بمنطقة الدماغ المحيطة بها، بينما الآخر عناصر (ك، ف، و Cl) لم تتغير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توجيه بشكل صحيح العينة خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. لأن نقوم باستخدام الميزات التشريحية السطحية الظهرية للدماغ لتحديد موقع LC (الحدود بين المخيخ وأدنى والاكيميه)، من المهم أن تكون محاذاة المقاطع بشكل صحيح. وهذا يتطلب الرعاية في وضع الدماغ بشكل صحيح في مصفوفة تقطيع المخ الماوس. ونحن نوصي قطع الأنسجة أكثر ~ 500 ميكرومتر الأمامي والخلفي ل LC لتجنب فقدان النواة. الخطأ الأكثر شيوعاً هو قطع المقاطع القليلة جداً التي ينتج عنها تماما في عداد المفقودين LC. وهكذا، واحدة للمرة الأولى بعد هذا البروتوكول، نوصي بقطع المقاطع أكثر من اللازم. دراسة متأنية للصور أطلس الدماغ قبل تلوين مفيد جداً. تغيير مظهر جذع الدماغ ملحوظ كل ميكرون مئات قليلة، ومع بعض الخبرة، فمن الممكن أن نعرف ما أقسام يستحق تلطيخ ببساطة بمظهر العيانية.

أثناء عملية إضفاء الطابع المحلي على قانون العمل، قد تكون هناك اختلافات في الإشارة اعتماداً جيدا كيف كان موجها الدماغ خلال تمزيقها. عند قطع من خلال مركز قانون العمل، الإشارة مشرق ويغطي مساحة أكبر بالمقارنة مع الحافة من قانون العمل، التي سوف تظهر كإشارة على مساحة أصغر من ذلك بكثير. في الحالة أن الشرائح الاكليلية تكون طفيفة إمالة، قانون العمل جانب واحد البطينال 4 قد يكون واضحا وواحد على الجانب الآخر قد تكون مرئية في شريحة مجاورة فقط. وهكذا، لا يمكن دائماً يتوقع المرء المظهر من كلتا المنطقتين LC في أقصى شدتها ضمن شريحة واحدة من الدماغ. ويمكن تجنب هذه القطع الأثرية بقطع المخ بالضبط الاكليلية في مصفوفة تقطيع المخ الماوس والتضمين بعناية في الدماغ في العفن التضمين تكعيبي مع أكتوبر.

إيمونوستينينج، على الأقل مع جسم hydroxylase التيروزين المضادة، متسامح جداً، وفي تجربتنا، يعمل على الفروع يصل إلى 100 ميكرومتر في سمك. وقد وجدنا أن عرقلة الحل ليس ضروريا لتلطيخ إشارة إلى الضوضاء عالية من LC، خفض التكلفة وتقليل مقدار الوقت اللازم لتحديد موقع LC. في تجربتنا، البروتوكول المصبوغة يمكن الإسراع – أن كان ذلك مع انخفاض الجودة و penetrance تلطيخ – بتخفيض بيرميبيليزيشن إلى ح 2، وجسم الأولية ح 8، وجسم الثانوية حاء 2 بالإضافة إلى ذلك، إذا كان أحد مهتم ببساطة في تحديد مكان LC ( مثلاً، للتحقق من صحة حقن فيروس/الراسم)، يمكن قطع أجزاء من دماغ ثابتة على فيبرتوم في 100 ميكرومتر سمك.

واحد الحد من هذا البروتوكول أنه، حسب التصميم، يتطلب يوثانيزينج الحيوان وإزالة الدماغ. ولذلك، ليس من المفيد للتعريب في الحية (مثلاً، التسجيلات الكهربية). قيد آخر هو أن هذا البروتوكول يتطلب التثبيت منهاج عمل بيجين الذي قد يغير الدولة الأصلية للأنسجة. وتشمل هذه التعديلات محتوى عنصري مثل النحاس والكالسيوم، والحديد والزنك36. ويمكن اختبار تغيير توزيع المعادن الناتجة عن تثبيت منهاج العمل الفعلي في عينة واحدة التي يمكن تشغيلها بالتوازي مع عينة غير ثابت. مقارنة لتوزيع المعادن بين هذه العينات اثنين سيشكل دليلاً على تأثير تثبيت منهاج العمل على توزيع هذا المعدن الذي الاهتمام بدراسة بعض. إذا كان يجب تجنب التثبيت منهاج عمل بيجين، يمكن تمديد المبدأ العام المتعلق بهذا البروتوكول (تحديد LC إيمونوستينينج واستخدام المقاطع المتجاورة للتجارب المتابعة) للأجزاء المجمدة دون التثبيت.

ونلاحظ أن هذا البروتوكول إلى حد كبير تحسين الأساليب القائمة لحل هذه المشكلة. الجدة موجود في تكييف النهج السابق لتحديد موقع نواة صغيرة جداً، ولم يرد عليها بسهولة. ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول يمكن تعديلها بسهولة والموسعة على أساس الحاجة (مثلاً، استخدام الحيوانات المحورة وراثيا معربا عن فلوروفوريس في قانون العمل لتجنب إيمونوستينينج).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء.

Acknowledgments

ونحن نشكر أبيغيل موتشينديتسي للحفاظ على مستعمرة الماوس. استخدام مصدر فوتون متقدمة في "مختبر أرغون الوطني" تدعمها وزارة الطاقة الأمريكية، مكتب العلوم، "مكتب للطاقة العلوم الأساسية"، تحت رقم العقد: دي-AC02-06CH11357. ونحن نشكر أولغا أنتيبوفا والدكتور ستيفان فوغت لدعم المستخدم والمساعدة في "المصدر فوتون متقدمة". تم تمويل هذا العمل من 2R01GM101502 منح "المعهد الوطني للصحة" إلى SL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult mouse brain slicer matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey) Thermo Fisher Scientific A-21206
Charged glass slides Genesee 29-107
Confocal microscope Zeiss LSM 800
Cryostat Microm GmbH HM 505E
Cryostat cutting blades Thermo Fisher Scientific MX35
Scissors Mini, 9.5cm Antech Diagnostcs 503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit) B. Eipper -
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit) Cell Signaling 8586
Falcon tubes, 50ml USA Scientific 339652
Forane (isofluorane) Baxter NDC 1019-360-60
Forceps Micro Adson Antech Diagnostcs 501245
Hardset mounting media EM sciences 17984-24
Microscope Pascal LSM 5
Multi-well plates, 24 wells Thermo Fisher Scientific 930186
Optimal cutting temperature compound (OCT) VWR/ tissue tech 102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% Fisher Scientific SF98-4
Peel-A-Way disposable embedding molds Polysciences Inc. 18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS) Life Tech 14190250
Razor blades Amazon ASIN: B000CMFJZ2
Spatulas Antech Diagnostcs 14374
T pins Office Depot 344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition Amazon ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD) Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit) EMD Millipore AB152
Ultralene thin film for XRF SPEX Sample Prep 3525
Wide-field fluorescent microscope Zeiss Axio Zoom.V16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
  2. Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways. Neurology. 25, 223-233 (1975).
  3. Olson, L., Fuxe, K. On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation. Brain research. 28, 165-171 (1971).
  4. Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation. Peptides. , 50-61 (2018).
  5. Semba, J., Toru, M., Mataga, N. Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat. Sleep. 7, 211-218 (1984).
  6. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537, 357-362 (2016).
  7. Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus. Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).
  8. Sara, S. J., Segal, M. Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition. Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).
  9. Markevich, V. A., Voronin, L. L. Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures]. Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).
  10. File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour. Brain research. 169, 411-420 (1979).
  11. Pamphlett, R. Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders. Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).
  12. Wang, J., et al. Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson's disease and its phenotypes. European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).
  13. Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson's disease model. Experimental neurology. , 172-180 (2017).
  14. Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).
  15. Chandley, M. J., et al. Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder. Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).
  16. Bernard, R., et al. Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression. Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).
  17. Gos, T., et al. Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients. European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).
  18. Bielau, H., et al. Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder. Brain research. 1459, 91-99 (2012).
  19. Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder. Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).
  20. Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats. Neuroscience. 373, 7-19 (2018).
  21. Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats. eLife. 6, (2017).
  22. McCall, J. G., et al. CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety. Neuron. 87, 605-620 (2015).
  23. Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons. The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).
  24. Simone, J., et al. Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).
  25. Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nature. 13, 1526-1533 (2010).
  26. Fan, Y., et al. Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions. Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).
  27. Xiao, T., et al. Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system. Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).
  28. Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus. Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).
  29. Ralle, M., et al. Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).
  30. Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Franklin, K. B. J. , Boston, Amsterdam. (2013).
  31. Bonnemaison, M. L., et al. Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules. Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).
  32. Nietzold, T., et al. Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).
  33. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets. J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).
  34. Davies, K. M., et al. Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease. Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).
  35. Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical science. 130, London, England. 565-574 (2016).
  36. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).

Tags

علم الأعصاب، 145 قضية، الدماغ، كوروليس موضع، المعادن، immunohistochemistry، الأشعة السينية fluorescence مجهرية، وإفراز، النحاس، هذا، TH، ATP7A، ATP7B

Erratum

Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 04/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Evan Maxey was updated from:

Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

to:

X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

تعريب كوروليس موقعا في الدماغ الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M.,… More

Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M., Washington-Hughes, C., Muchenditsi, A., Maxey, E., Lutsenko, S. Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (145), e58652, doi:10.3791/58652 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter