Summary
Vi beskriver etableringen af en murine model for Parkinsons sygdom ved hjælp af MPTP og adfærdsmæssige vurderinger ved hjælp af cylinder og open field test til at måle motorik. Vi derefter bruge L-DOPA som et eksempel til at vise, hvordan at anvende denne model i studiet af PD narkotika.
Abstract
Parkinsons sygdom (PD) er en fælles neurodegenerative lidelse sygdom, forårsager fænomenet med rysten, stivhed, langsomme bevægelse og demens. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) kan føre til nogle Parkinsons-lignende symptomer ved at ødelægge dopaminerge neuroner i substantia nigra af hjernen. Det har således været brugt at etablere PD modeller i forskellige dyreforsøg. Her, mus modtage MPTP injektioner (20 mg/kg/dag) i syv dage og de adfærdsmæssige test er udført på den ottende dag. Denne model er tilpasset effektivt i studiet af PD. De adfærdsmæssige test her omfatter cylinder test og open field test. Cylinder eksperiment bruges til at opdage dyrenes evne til at løfte deres forreste ben når de sættes ind i et andet miljø. PD modelmus vise overordnede — musen buer ryggen — antallet af paw liftings fald. Denne test er nem at udføre. Friland-test bruges til at registrere mængden af tid, musene bruger på at køre, walking og resterende immobile. Vi analyserer dyrenes bevægelser på åben mark ved hjælp af software og hente data. Endelig, vi brug L-DOPA, en af mest anvendte almindeligt PD narkotika, som et eksempel til at vise, hvordan at anvende denne model til studiet af PD narkotika. Vores resultater viser, at MPTP neurotoksicitet inducerer motor underskud, hvilket kan afbødes af L-DOPA.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD), en af de mest almindelige sygdomme blandt ældre individer, er en langsigtet neurodegenerative lidelse1. Patienter vise altid fænomenet med rysten, stivhed, langsomme bevægelse og demens, der forværres over tid2. Andre symptomer, herunder sensorisk, er søvn og følelsesmæssige problemer også almindeligt observeret2. Årsagen til PD er stadig uklart, men det menes, at inddrage både genetiske og miljømæssige faktorer, som inducerer tab af dopaminerge neuroner i substantia nigra3, og udvikling af Lewy organer og Lewy neurites i forskellige regioner af den hjernen4.
Blandt undersøgelserne af PD, er 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)5 tilpasset bredt i at genskabe nogle PD symptomer i eksperimentelle modeller. I 1984, først fandt Langston et al. , at injektioner af MPTP i egern aber resulterede i parkinsonisme6. Selvom MPTP gnaver model ikke vise tilstedeværelsen af Lewy organer, som er biomarkør for PD, forårsager MPTP Parkinsons-lignende symptomer ved at ødelægge dopaminerge neuroner i substantia nigra af hjernen7. Sammenlignet med andre stof model for PD som dem fremkaldt af 6-hydroxydopamine (6-OHDA)8 og 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP +)9, injektion af MPTP er let at udføre og MPTP model tager mindre tid. Mus modtage MPTP injektioner (20-30 mg/kg/dag) for syv dage, og de adfærdsmæssige test udføres på den ottende dag10.
Open field test11 blev først udviklet af Calvin S. Hall, en amerikansk12. I forskellige undersøgelser, er forskellige former for adfærd testet. I forskning, som fokuserer på Parkinsons sygdomme, adfærd som locomotion aktiviteter og hastighed af bevægelse er testet for at se om dyrets evne til at bevæge sig rundt er berørt. Sammenlignet med andre metoder, der anvendes til at teste oprettelse af PD dyr, open field test er nemme at udføre, fordi det nødvendige udstyr er enkel, og prototyping og data analyse software (fx, MATLAB, Excel) kan bruges til at let indsamle og graf den data. Variationskoefficienten er også relativt små13, hvilket betyder, at resultatet af open field test er pålidelige. En anden fordel i forhold til andre metoder er, at de adfærd, der er inkluderet i dette eksperiment er let at skelne; mus kan være enten kører, går eller står stille. Normalt kan open field test bruges på gnavere, når forskeren skal evaluere fagets mobilitet.
Cylinder test kaldes også test af asymmetriske brug af forbens. Når denne test blev først udviklet, blev det brugt til at teste den asymmetriske brug af rottens forbens14. Her bruger vi denne test til at analysere dyrets evne til at strække ud og bruge begge sine forbens for at udforske nye omgivelser. Når substantia nigra og corpus striatum er beskadiget af MPTP i hjernen, dyret har tendens til at bue ryggen og bliver mindre tilbøjelige til at strække ud og udforske det ukendte miljø. Denne test er let at udføre og kan give et foreløbigt resultat. Denne test har dog stor indre variation, så det er generelt bruges med sammen med andre adfærd eksperimenter.
Tage L-DOPA, som er også kendt som levodopa eller L-3,4-dihydroxyphenylalanine, er en fælles måde at behandle Parkinsons sygdom, da en af årsagerne til PD er fald på dopamin i den. L-DOPA er forstadiet til dopamin. Men i modsætning til dopamin, det kan krydse blod - hjerne barrieren, hvilket betyder at det vil være mere effektiv til at øge koncentrationen af dopamin i hjernen-området. Efter den krydser blod - hjerne barrieren, er L-DOPA omdannet til dopamin af L-amino syre decarboxylase15.
Her beskriver vi måling og analyse af motorik i MPTP-induceret-PD modelmus ved hjælp af en cylinder test14 og en modificeret open field test. Vi forvalter L-DOPA som et eksempel til at vise, hvordan at anvende denne model i studiet af PD narkotika. Vores resultater viser, at MPTP inducerer motor underskud, der kan mildnes af L-DOPA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført efter de internationale, nationale og institutionelle regler overvejer dyreforsøg. Undersøgelse-protokollen blev godkendt af Dyreetik Udvalget af Nankai Universitet.
1. MPTP og L-DOPA administration
Bemærk: Ti-uge-forhenværende BALB/c hunmus blev leveret af Institute of Zoology, kinesiske Academy of Sciences. Mus var opstaldet seks pr. bur under en 12t lys/mørke cyklus (lyser oven på 08:00-20:00), en konstant temperatur på 21-22 ° C og en relativ luftfugtighed på 55% ± 5%. Autoklaveres standardmus chow af den samme formulering og vand ad libitum blev givet til alle dyr.
- Efter en uge med akklimatisering, opdele dyrene i tre grupper af seks mus.
- Til gruppe 1, administrere intraperitoneal injektioner (Se trin 1,5) 250 µL/mus/dag af saltvand fra dag 1 til dag 7 og derefter udføre gastrisk administration (Se trin 1,6) 250 µL/mus af saltvand på dag 8.
- Til gruppe 2, administrere intraperitoneal injektioner af 20 mg/kg/dag af MPTP hver dag fra dag 1 til dag 7 og derefter udføre gastrisk administration af 250 µL/mus af saltvand på dag 8.
- Gruppe 3, administrere intraperitoneal injektioner af 20 mg/kg/dag af MPTP fra dag 1 til dag 7 og derefter udføre gastrisk administration af 5 mg/kg af L-DOPA på dag 8.
- Udføre intraperitoneal injektion som følger.
- Læg stoffet i en steril 1 mL sprøjte med en 26 G kanyle. Fjerne luft fra sprøjten.
- Harmoniske mus med sin mave vender opad. Holde hoved, hals og krop med musen i en lige linje samt med hovedet fast.
- Vinkel nålen at trænge bughinden. Skubbe nål for en ordentlig afstand, indtil der er lidt modstand, og derefter injicere medicinen. Trække ud nålen gnidningsløst.
- Udføre gastrisk administrationen som følger.
- Forberede medicinen i en steril 1 mL sprøjte med en oral-sonde nål. Fjerne luft fra sprøjten.
- Hold musen med sin mave vender opad. Holde hoved, hals og krop med musen i en lige linje med hovedet fast.
- Hold nålen parallelt med kroppen af musen, og indsætte det fra hjørnet af musens mund, at trykke på tungen og presser indad mod den øvre kæbe.
- Med lidt modstand, som viser nål går ind i spiserøret gnidningsløst, skub forsigtigt kanylen i en passende afstand. Før spidsen af nålen når den nederste del af brystet, injicere medicinen.
- Trække ud nålen gnidningsløst.
2. cylinder test
Bemærk: De adfærdsmæssige test blev udført på dag 8. L-DOPA blev sprøjtet til den tredje gruppe af mus 40 min før de adfærdsmæssige test. Hvis den adfærdsmæssige test ikke er gjort i samme rum, hvor dyrene er opstaldet, skal dyr blive akklimatiseret til det nye rum for 30-60 min inden testen.
- Udføre test 24 timer efter den sidste dosis af MPTP.
- Placer en gennemsigtig glas cylinder (højde = 19,5 cm, diameter = 15 cm, vægt ≥ 1 kg) på midten af en tabel. Surround cylinder på tre sider med sort pap til at reducere effekten af miljømæssige belysning. Forlade den ene side af cylinderen vender kameraet til videooptagelse.
Bemærk: Afstanden mellem pap og cylinder skal være omkring 4-8 cm. - Vedhæfte et kamera (> 1 million-pixel opløsning) på ~ 40-60 cm fra cylinder til at sikre, at den fulde cylinder er synlige.
Bemærk: Dette er også nær heller ikke for langt for at ikke forstyrre musen mens du optager video af dens bevægelse. - Placere en mus i cylinderen på en gang og begynde at filme på én gang. Stoppe optagelserne efter 3 min.
Bemærk: Under denne proces, forsøge at undgå støj eller lette ændringer i orden undgå at påvirke den mus adfærd. - Placer musen tilbage ind i hjem buret efter afprøvning.
- Rengøre cylinder med vand og derefter spray 70% v/v ethanol over den indre væg til at desinficere det og fjerne musen dufte. Tør cylinderen før en anden mus er placeret i.
- Afspille video med en hastighed på 0,5 x den almindelige hastighed og tælle antallet af pote elevatorer mod væggen i hvert mus.
Bemærk: Paw elevatorer opstår, når musen stikker op på sin hindlimbs, rejser både forbens over skulderhøjde og lander. En forelimb lift er ikke medregnet. Normalt, hæver en mus sin forbens for at røre ved cylinder vægge. Hvis musen hæver sin forbens over skulderhøjde flere gange kontinuerligt uden landing, skal det tælles kun som én gang.
3. open field test
- Udføre open field test 24 h efter MPTP dosering.
Bemærk: Det kan udføres på samme tid af cylinder test. - Forberede en gennemsigtig friland reaktion boks (45 cm L x 45 cm W x 25 cm H) med en træplade dækslet i bunden af en sort klud. Lave et kamera (> 1 million-pixel opløsning) over marken ved en højde på 1 m.
Bemærk: Farven på feltet åben boksen nederst skal være forskellig fra den testede mus farve at sikre farvekontrast i videoen. - Justere kameraet for at sikre at boksen åben reaktion er lige i midten af videoen.
- Sætte en test musen i boksen, og lad musen gør sig bekendt med miljøet for ca 1 min.
- Optag en 5 min video ved hjælp af kamera sluttet til computeren.
- Analysere video ved hjælp af softwareværktøjer (f.eks. MATLAB) for at få bevægelse trace figur, fordelingen af statisk (velocity < 1 cm/s), omvandrende (velocity 1-20 cm/s) og kører (velocity > 20 cm/s) tid, den samlede rejste distance, og den gennemsnitlige hastighed for hver testet mus.
Bemærk: Når du analyserer video, vi spore hele kroppen af musen. Den gennemsnitlige hastighed for en krop betyder, at den samlede længde af stien er omfattet, divideret med den forløbne tid. Derfor, hvis en mus ikke er i bevægelse, dens øjeblikkelige hastighed ville blive betragtet som nul. - Rydde op eventuelle afføring i boksen Åbn reaktion. Spray 70% ethanol på boksen og tørre det.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I cylinder test, blev faldet i stejler mod væggen observeret i mus (gruppe 2) behandlet med MPTP fra dag 1 til dag 7 og saltvand på dag 8 forhold til saltvand-behandlede mus (gruppe 1), mens en stigning på stejler blev observeret i mus (gruppe 3) behandlet med MP TP fra dag 1 til dag 7 og L-DOPA på dag 8 sammenlignet med mus (gruppe 2) behandlet med MPTP fra dag 1 til dag 7 og saltvand på dag 8 (figur 1).
Figur 2 viser de repræsentative spor og distribution af statisk tid, gang og kører tid fra de tre grupper af mus. (A) var mus behandlet med saltvand. I (B) mus behandlet med MPTP fra dag 1 til dag 7 og saltvand på dag 8. I (C) mus behandlet med MPTP fra dag 1 til dag 7 og L-DOPA på dag 8. Når en mus bevægede sig i feltet åben arena med hastighed < 1 cm/s, 1-20 cm/s, eller > 20 cm/s, det blev bedømt som statisk, gå eller løbe hhv. Mus behandlet med kun MPTP viste et lavere bevægelse hastighed, en kortere bevægelse afstand, statisk længere og en kortere køretid end saltvand-behandlede mus, som angivet motor underskuddet induceret af MPTP. Mus behandlet med både MPTP og L-DOPA viste en højere bevægelse hastighed, en længere bevægelse afstand, en kortere statisk tid og en længere køretid end mus behandlet med bare MPTP (figur 2, figur 3), som viste, at L-DOPA afbødet de MPTP-induceret motor underskud.
Figur 1: effekter af MPTP på motorisk præstation i cylinder test. Det viser en analyse af antallet af opdræt på 8 dagen. * repræsenterer p < 0,05, ** repræsenterer p < 0,01 for en en-vejs ANOVA test. Alle værdier repræsenterer gennemsnit ± SD (n = 6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: bevægelse sti af mus og fordeling af tid, at mus bo, gå og køre i løbet af 5 min i feltet åben test. (A) ubehandlede mus. (B) mus behandlet med MPTP. (C) PD modelmus reddet af L-DOPA. Køre: musen var bevæger sig med en hastighed på mere end 20 cm/s. gang: musen var bevæger sig i det åbne område og med en hastighed på 1-20 cm/s. statisk: musen var stationær (hastighed < 1 cm/s) i feltet åben (n = 6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: den motor underskud induceret af MPTP og den terapeutiske effekt af L-DOPA på motorisk præstation i open field test. (A) analyse af statisk, walking og køretid. (B) analyse af gennemsnitlige bevægelse afstand. (C) analyse af gennemsnitlige bevægelse hastighed. repræsenterer p < 0,001, *** repræsenterer p < 0,0001 for en en-vejs ANOVA test. Alle værdier repræsenterer gennemsnit ± SD (n = 6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af ødelæggelsen af dopaminerge neuroner i substantia nigra af hjernen forårsager MPTP Parkinsons-lignende symptomer i mus7. L-DOPA er den mest foretrukne stof for PD lige siden sin kliniske anvendelse, fordi det hjælper med at opretholde normale daglige aktiviteter i patienter med PD, med effektiv undertrykkelse af motor abnormiteter herunder akinesi og stivhed15. Mus behandlet med MPTP viste funktionshæmninger i de adfærdsmæssige tests som cylinder test og open field test, som kunne bruges til at studere MPTP model. Cylinder test og open field test er normalt bruges til at måle spontan handling. Her, har vi ændret disse to adfærdsmæssige test for at anvende dem i studiet af PD. Som vist i vores resultater, kan L-DOPA afbøde svækkelser i adfærd ved at forbedre dyrenes bevægelsesevner.
Normalt, udforske mus deres omgivelser når de holdt introduceret til et nyt miljø. Således, når det opbevares i en gennemsigtig cylinder, de udforsker i cylinderen ved at flytte og hæve deres organer for at røre ved cylinder vægge med deres forbens. Mus beruset med neurotoksiske stoffer såsom MPTP, reducere denne handling. Dette er det muligt at anvende cylinder testen i PD studiet. Paw elevatorer mængder angive forelimb brug for body støtte og bruges således til at evaluere effekten af nye kemiske enheder på motorisk præstation16. Cylinder test indeholder også en foranstaltning til forelimb motorik17 i mange neurodegenerative sygdomme med motoriske cortex læsioner, som Amyotrofisk lateral sklerose og spinocerebellar atrofi18.
Open field test er en eksperimentel test at assay generelle bevægeapparatet aktivitetsniveauer og vilje af gnavere i form af den tid, de opholder sig i midten af feltet. Måling af bevægelse sti, hastighed og tid mus bo, gang og kører henholdsvis i hele området, snarere end specifikke område i feltet åben kan evaluere motorik i PD19. Udnyttelse af simple og let tilgængelige kodning software (Se Tabel af materialer), vi kan hente og analysere data relateret til bevægeapparatet funktionen effektivt.
Cylinder test og open field test blev valgt til at måle spontan lokomotiv funktion i PD modelmus af følgende grunde. Musene behøver ikke at være uddannet inden de adfærdsmæssige test. Kun flere minutter er nødvendig for den reaktion, der sikrer effektivitet. Udgifter til det udstyr, der kræves for at udføre testene er lav. En væsentlig ulempe ved denne foranstaltning er imidlertid at dyrenes aktivitetsniveauer kan variere betydeligt på grund af miljøændringer og individuelle forskelle. For at reducere mængden af variation i resultatet data, bør udvises forsigtighed. For det første bør dyr af samme alder, køn og genetiske baggrund20,21,22 vurderes på samme tid. For det andet skal udstyr, cylinder og friland, rengøres før og efter afprøvning hver mus. Endelig holde miljøet roligt og uforstyrret under prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vores arbejde er finansieret af Tianjin Undergraduate træningsprogrammer for Innovation og Entrepreneurship (Grant nr. 63183004). Dette projekt blev indledt i staten nøglen laboratorium af lægemidler kemisk biologi på Nankai Universitet. Forfatterne erklærer, at der ingen interessekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Ruiboxing Company | RBX-64175 | |
| Camera | BASLER | acA645-100gm | |
| Cylinder test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Levodopa | Sigma-Aldrich | 72816 | |
| Matalb 2017a | Mathworks | N/A | |
| Mice | Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences | Balb/c | Adult female mice(10 weeks) |
| MPTP | Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai | S31504-500mg | |
| Open field test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Syringe | Solelybio | S-xsgwz-w | Irrigation |
| Syringe | Jiangxi Fenglin Medical Application Co. | hc3824 | Intraperitoneal injection |
References
- Dehay, B., Bourdenx, M., Gorry, P., Przedborski, S., Vila, M., Hunot, S., Singleton, A., Olanow, C. W., Merchant, K. M., Bezard, E. Targeting -synuclein for treatment of Parkinson's disease: mechanistic and therapeutic considerations. Lancet Neurology. 14, 855-866 (2015).
- Weintraub, D., Comella, C., Horn, L., S, Parkinson's disease - Part 1: Pathophysiology, symptoms, burden, diagnosis, and assessment. American Journal of Managed Care. 14, 40-48 (2008).
- Ismaiel, A. A., et al. Metformin, besides exhibiting strong in vivo anti-inflammatory properties, increases mptp-induced damage to the nigrostriatal dopaminergic system. Toxicology and Applied Pharmacology. , 19-30 (2016).
- Bayliss, J. A., et al. Ghrelin-AMPK signaling mediates the neuroprotective effects of calorie restriction in Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 36, 3049-3063 (2016).
- Olanow, C. W., Stern, M. B., Sethi, K. The scientific and clinical basis for the treatment of Parkinson disease. Neurology. 72 (21 Supplement 4), (2009).
- Chiba, K., Trevor, A., Castagnoli, N. Metabolism of the neurotoxic tertiary amine, MPTP, by brain monoamine oxidase. Biochemical & Biophysical Research Communications. 120 (2), 574-578 (1984).
- Bakay, R. A., et al. Biochemical and behavioral correction of MPTP parkinson-like syndrome by fetal cell transplantation. Annals of the New York Academy of Sciences. 495 (1), 623-638 (2010).
- Kelly, P. H., Seviour, P. W., Iversen, S. D. Amphetamine and apomorphine responses in the rat following 6-OHDA lesions of the nucleus accumbenssepti and corpus striatum. Brain Research. 94 (3), 507-522 (1975).
- Langston, J. W., Irwin, I., Langston, E. B., Forno, L. S. 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+): identification of a metabolite of MPTP, a toxin selective to the substantia nigra. Neuroscience Letters. 48 (1), 87-92 (1984).
- Katila, N., et al. Metformin lowers α-synuclein phosphorylation and upregulates neurotrophic factor in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 125, (2017).
- Goldberg, N. R. S., Haack, A. K., Lim, N. S., Janson, O. K., Meshul, C. K. Dopaminergic and behavioral correlates of progressive lesioning of the nigrostriatal pathway with MPTP. Neuroscience. 180, 256-271 (2011).
- Schwarting, R. K., Sedelis, M., Hofele, K., Auburger, G. W., Huston, J. P. Strain-dependent recovery of open-field behavior and striatal dopamine deficiency in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Neurotoxicity Research. 1 (1), 41 (1999).
- Shiguang, S., et al. The open field test as a method for ethology in Kunming mice: test-retest reliability. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science. 19 (12), 1093-1095 (2010).
- Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-Dragging: a Novel, Sensitive Analysis of the Mouse Cylinder Test. Journal of Visualized Experiments. (98), e52701 (2015).
- Cotzias, G. C., Van Woert, M. H., Schiffer, L. M. Aromatic amino acids and modification of Parkinsonism. New England Journal of Medicine. 282, 31-33 (1967).
- Cassady, J. C., Johnson, R. E. Cognitive test anxiety and academic performance. Contemporary Educational Psychology. 27 (2), 270-295 (2002).
- Rogalewski, A., et al. Semaphorin 6A improves functional recovery in conjunction with motor training after cerebral ischemia. Plos One. 5 (5), 0010737 (2010).
- Chen, W., Qiao, D., Liu, X., Shi, K. Treadmill exercise improves motor dysfunction and hyperactivity of the corticostriatal glutamatergic pathway in rats with 6-ohda-induced parkinson's disease. Neural Plasticity. 2017, 2583910 (2018).
- Colas-Zelin, D., et al. The imposition of, but not the propensity for, social subordination impairs exploratory behaviors and general cognitive abilities. Behavioural Brain Research. 232 (1), 294-305 (2012).
- Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
- Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. American Journal of Psychology. 83, 103-111 (1970).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and Locomotor Measurements Using an Open Field Activity Monitoring System for Skeletal Muscle Diseases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51785 (2014).
