Summary
MPTP と運動機能を測定するシリンダーとオープン フィールド テストを使用して行動のアセスメントを用いたパーキンソン病のマウスモデルの確立について述べる。一例として L-DOPA を使用して、PD 薬の研究ではこのモデルを適用する方法を示します。
Abstract
パーキンソン病 (PD) は、揺れ、剛性、運動と認知症の遅さの現象を引き起こしている一般的な神経変性障害疾患です。1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) は脳の黒質のドーパミン作動性ニューロンを破壊することによっていくつかのパーキンソン病のような症状を引き起こします。それは、様々 な動物実験で PD モデルを確立するために使用されています。ここでは、マウスは、MPTP 注射を受ける (20 mg/kg/日) 7 日間の行動テストの 8 日目で処理されます。このモデルは、PD の研究で効率的に適応されます。行動のテストここでは、シリンダー テスト オープン フィールド試験をご利用など。シリンダー実験は、動物の能力を別の環境に置くとき彼らの前部足を持ち上げを検出するために使用されます。PD モデル マウス示すアーチ-マウスは、背中を弓なり-足の持ち上げ減少数。このテストは、実行する簡単です。オープン フィールド テストを使用して、実行、ウォーク、および残りの不動のマウスに費やす時間の量を検出します。我々 はソフトウェアを使用してオープン フィールドで動物の動きを分析し、データを取得します。最後に、我々 は l ドーパを使用、最も一般的 PD 薬の研究にこのモデルを適用する方法を示す 1 つの例として PD 薬に使用されます。パーキンソン病は、l ドーパによって軽減することができます自動車の赤字を誘導することが示唆されました。
Introduction
パーキンソン病 (PD)、高齢者の間で最も一般的な病気の一つは長期的な神経変性疾患1.患者は常に揺れ、剛性、運動と2時間の経過とともに悪化痴呆の遅さの現象を表示します。他の症状は、感覚を含む、スリープ、および感情的な問題もよく、2に観察されます。PD の原因はまだ不明ですが、一般的に3中脳のドーパミン作動性ニューロンの損失とレビー小体レビー神経突起の様々 な地域での開発を誘導する遺伝子と環境要因が関与するといわれる、脳4.
PD の研究、1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)5の実験モデルでいくつかの PD の症状を再現するのに広く適応されます。1984 年、ラングストンらは最初、リスザル MPTP の注射がパーキンソン症候群6の結果を発見しました。MPTP 齧歯動物モデルは、PD のバイオ マーカーであるレビー小体の存在を示さない MPTP7脳の黒質のドーパミン作動性ニューロンを破壊することによってパーキンソン病様の症状が発生します。6-ヒドロキシドーパミン (6-OHDA)8 1-メチル-4-phenylpyridinium (MPP +)9によるものなど PD の他薬物モデルと比較して、MPTP の注入は簡単に実行、MPTP モデルより少ない時間がかかります。マウスは、MPTP 注射を受ける (20-30 mg/kg/日) の 7 日間、および行動テスト 8 日10で実行されます。
オープン フィールド テスト11はカルバン S. ホール、アメリカの12によって最初に開発されました。様々 な研究でさまざまな種類の動作がテストされます。パーキンソンの病気に焦点を当て研究では動作歩行活動のように、歩行の速度をテストして、周りを移動する動物の能力が影響を受けるかどうか。PD 動物の確立をテストするために使用する他の方法と比較して、オープン フィールド試験が必要な装置は簡単でありを簡単に収集し、グラフ、プロトタイピングとデータ解析のソフトウェア (例えばMATLAB、Excel) を使用できますので、実施しやすい、データ。また、変動係数は比較的小さい13、オープン フィールド試験の結果が信頼できることを意味します。他の方法に比べて別の利点は、この実験で含まれているビヘイビアーが簡単に区別;マウスは、まだ立って、またはランニング、ウォーキングをすることができます。通常オープン フィールド試験は、研究者が被験者の移動度を評価する必要があるときは齧歯動物に使用できます。
シリンダー テストは前肢の非対称使用のテストとも呼ばれます。このテストが最初に設計されたとき、それはラットの前肢14の非対称の使用をテストする使用されました。ここでは、伸ばしたり、その前肢の両方を使用して、新しい環境を探索するのに動物の能力を分析するのにこのテストを使用します。脳内 MPTP による黒質、線条が破損した動物背中を丸く傾向があるし、体を伸ばし、未知の環境を探索する可能性が低くなります。このテストが簡単に実行し、予備的な結果を与えることができます。ただし、このテストは、一般的に他の行動実験と共にで使用される高の内部変動です。
PD の原因の 1 つは、ドーパミンの減少は、パーキンソン病を治療する一般的な方法は、レボドパまたは L-3, 4-ジヒドロキシフェニルアラニンはまたとして知られている、l-ドーパを服用します。L-ドーパはドーパミンの前駆体です。しかし、ドーパミンとは異なり効率よく脳の部位でのドーパミンの濃度を増加させることを意味する血液-脳関門を通過できます。それは血液-脳関門を通過、L-DOPA は L-アミノ酸脱炭酸酵素15でドーパミンに変換されます。
ここで測定とシリンダー テスト14と変更されたオープン フィールド テストを用いた MPTP 誘発 PD モデル マウスの運動機能の解析について述べる。我々 は PD 薬の研究ではこのモデルを適用する方法を示す 1 つの例として L-DOPA を管理します。MPTP が l ドーパによって軽減することができます運動の障害を誘導することが示唆されました。
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Protocol
この試験は、動物実験を考慮した国際、国および教育機関の規則に従って行われました。研究プロトコルは、南開大学の動物倫理委員会で承認されました。
1. パーキンソン病と L-DOPA の管理
注: 10 週齢の雌性 balb/c マウスは、中国科学院動物研究所によって提供されました。マウスが収納された 6 12 h 明暗周期 (8:00-20:00 でのライト)、下ケージごとの 21-22 ° C の一定温度と相対湿度 55% ± 5%。同じ定式化と水広告自由のオートクレーブの標準的なマウスの食事は、すべての動物に与えられました。
- 順化の 1 週間後、動物を 6 マウスの 3 つのグループに分割します。
- グループ 1の腹腔内注射 (手順 1.5 参照) 250 μ L/マウス/日生理食塩水を 1 日目から 7 日目に管理し、胃内の管理を実行 (手順 1.6 参照) 8 日目に生理食塩水の 250 μ L/マウスの。
- グループ 2、20 mg/kg の腹腔内注射の管理/MPTP 毎日 1 日目から 7 日目の日、8 日目に生理食塩水の 250 μ L/マウスの胃内の管理を実行します。
- グループ 3、20 mg/kg の腹腔内注射の管理/日 MPTP の 1 日目から 7 日目と 8 日目に L-DOPA の 5 mg/kg の胃内投与を行います。
- 腹腔内投与をとおり実行します。
- 26 G 針で 1 mL の滅菌注射器に薬をロードします。シリンジから空気を除去します。
- 首筋そのベリーダンス直面しているマウス。おいて頭、首、マウス本体の直線も固定ヘッド。
- 腹膜を貫通する針の角度。適切な距離用の針を押して、少し抵抗があるし、薬剤を注入します。スムーズに針を抜きます。
- 胃内の管理を次のように実行します。
- 経口経口針で 1 mL の滅菌注射器で薬を準備します。シリンジから空気を除去します。
- マウスを押したまま、そのベリーダンス直面しています。頭固定で直線に頭、首とマウスの体をしてください。
- 針をマウスの体に平行に保つため、マウスの口、舌、上顎に対して内側の隅から挿入してください。
- 少しの抵抗をスムーズに食道に入っている針を示しています、適切な距離で針を慎重に押しています。針の先端では、胸の下の部分に達すると、前に薬物を注入します。
- スムーズに針を抜きます。
2 円筒試験
注: 8 日目に行動テストを行った。L-DOPA を注入したマウス行動テストの前に 40 分の 3 番目のグループ。行動テストは動物が収容されている同じ部屋で行わないと、動物はテストの前に 30-60 分のための新しい部屋に慣れる必要があります。
- MPTP の最後の投与後 24 時間のテストを実行します。
- 透明なガラスのシリンダーを配置 (高さ 19.5 cm 直径 15 cm、重量 1 kg) テーブルの中心に。環境照明の影響を軽減する黒ダン ボール 3 つの側面のシリンダーを囲みます。ビデオ録画のためのカメラに直面してシリンダーの 1 つの側面を残します。
注: 段ボールとシリンダー間の距離は約 4 〜 8 センチメートルをする必要があります。 - カメラを取り付ける (> 100 万ピクセル解像度) 40 〜 60 歳で完全な円柱が表示されていることを確認するシリンダーから cm。
注: これは遠くも近くもその動きのビデオを記録しながらマウスを邪魔しないように。 - 同時にシリンダー内に 1 つのマウスを置くし、すぐに撮影を開始します。3 分後に撮影を停止します。
注: この処理中にノイズを避けるためする試みまたはマウスの動作に影響を与える順番に光の変化を避けます。 - テスト後自宅のケージにマウスを配置します。
- 水でシリンダーをきれいにしそれをサニタイズし、マウスのにおいを削除する内部の壁を越えて 70 %v/v エタノールをスプレーします。別のマウスに入れる前にシリンダーを拭いて乾かしてください。
- 通常の速度 x 0.5 のレートでビデオを再生、各マウスの壁に足リフトの数をカウントします。
注: マウスの後肢に育てる場合、リフトの足は、両前肢肩の高さと土地の上を発生させます。1 つの前肢のリフトはカウントされません。通常、マウスはシリンダー壁に触れないようにその前肢を発生させます。マウスが発生した場合その前肢肩のレベルを超えて数回連続して着陸することなし、一度のみとしてカウントすべき。
3. オープン フィールド試験
- MPTP 投与後 24 h オープン フィールド テストを実行します。
注: それでも行えますシリンダー テストの同時に。 - 透明なオープン フィールド反応ボックスを準備 (45 cm × 45 cm W × 25 cm H) 下部に黒い布によって木製プレート カバー。カメラを固定 (> 100 万ピクセル解像度) 上 1 m の高さにあるフィールド。
注: オープン フィールド ボックス下部の色はビデオの色のコントラストを確保するためテスト マウスの色とは異なるはずです。 - オープン フィールド反応ボックスがビデオの中心で右であることを確認するためにカメラを調整します。
- ボックスに 1 つのテストのマウスを入れ、約 1 分の環境について自ら熟知マウスを聞かせてください。
- レコード 5 分ビデオ カメラを使用してコンピューターに接続します。
- 動きトレース図、静的の分布を得ること (例えばMATLAB) のソフトウェア ツールを使用してビデオを分析 (速度 < 1 cm/s)、歩行 (速度 1 20 cm/s) と実行 (速度 > 20 cm/s) 時間、旅した総距離、および平均各テストのマウスの速度です。
注: ビデオを分析する場合、私たちは、マウスの全身を追跡します。体の平均速度は、パスの長さの合計をカバー、経過時間で割った値を意味します。したがって、マウスを動かさずにゼロとしてその瞬間速度と見なされます。 - オープン フィールド反応ボックスで任意の糞便をクリーンアップします。ボックスの 70% エタノールをスプレーし、それを拭きます。
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Representative Results
1 日目から MP を投与したマウス (グループ 3) 後部の増加を認めた中日 7 と生理食塩水投与マウス (1 群) と比較して 8 日目に生理食塩水に MPTP を投与したマウス (グループ 2) で観察されたシリンダー テスト壁後部の減少7 日目に 1 日目から TP マウス (グループ 2) と比較して 8 日目に L-DOPA ように扱われ MPTP と 1 日目から 7 と生理食塩水の日日 8 (図 1)。
図 2は、歩行時間とマウスの 3 つのグループの実行時間の代表的なトレースおよび静的な時間の分布を示しています。(A) マウスが生理食塩水と扱われました。(B) マウス 7 と生理食塩水の日 8 日目に 1 日目からパーキンソン病で治療します。(C) マウス MPTP は 8 日目 7 日目、l ドーパ 1 日目から。速度とオープン フィールド アリーナでマウスを移動していたとき < 1 cm/s、1 20 cm/s、または > 20 cm/s、静的、歩いたり、それぞれを実行するいると判断しました。マウスは、MPTP による運動障害を示す生理食塩液投与のマウスより短い走行時間長い静的な時間、短い移動距離低い移動速度を示した MPTP のみで治療。MPTP と l-ドーパを投与したマウス示したより高い移動の速度、長い移動距離、短い静的な時間と実行時間の長い時間だけ MPTP (図 2図 3) 軽減 L-DOPA を示してと扱われるマウスよりも、MPTP 誘発運動障害。
図 1: 円柱試験における運動パフォーマンスに及ぼす MPTPこれは 8 日に飼育数の分析を示しています。* p を表す < 0.05 * * p を表す < 一方通行 ANOVA テストの 0.01。すべての値は、平均 ± SD を表します (n = 6)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マウスとマウス滞在、歩く、オープン フィールド試験における 5 分間実行時間の分布の移動パス。(A) 未処理のねずみ。(B) マウスは、パーキンソン病と扱われます。(C) PD モデル マウス l ドーパによって救出します。実行: マウスよりも 20 cm/s. 徒歩の速度で動いていた: マウスのオープン フィールドで、1 ~ 20 cm の速度で移動/s の静的: マウスが止まって (速度 < 1 cm/s) オープン フィールド (n = 6)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: MPTP とオープン フィールド試験における運動パフォーマンスに対する L-DOPA の治療効果によるモーターの赤字。(A) 解析、静的での歩行・走行時間。(B) 平均移動距離の分析。(C) 平均移動速度の解析。p を表す < 0.001、* * * p を表す < 0.0001 一方通行 ANOVA テストのため。すべての値は、平均 ± SD を表します (n = 6)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
脳の黒質のドーパミン作動性ニューロンの破壊、MPTP はマウス7でパーキンソン病のような症状を引き起こします。それは PD、無動と剛性の15を含むモーターの異常の効果的な抑制と患者の通常の日常活動を維持するのに役立ちますので l-ドーパ、以来、臨床応用 PD の最も好ましい薬剤です。マウスは、円筒試験とオープン フィールド試験、MPTP モデルを研究するために使用可能性がありますような行動テストで障害を示したパーキンソン病と扱われます。シリンダー テストとオープン フィールド試験は自発的な行動を測定する通常使用されます。ここでは、PD の研究でそれらを適用するこれらの 2 つの行動テストを修正しました。我々 の結果のように、L-DOPA は動物の運動能力を改善することにより動作の障害を軽減できます。
通常、マウスは、新しい環境に導入させている時、その周辺を探る。したがって、透明シリンダー内に保持、彼らはシリンダー内で動き回る彼らの前肢とシリンダー壁に触れないように自分の体を上げることにより探る。マウス、パーキンソン病などの神経毒性のエージェントに酔うは、このアクションを減らします。これは、PD におけるシリンダー テストを適用することができます。足リフト量は前肢用ボディ サポートを示し運動パフォーマンス16新しい化学実体の効果の評価に使用される従っています。シリンダー テストは、筋萎縮性側索硬化症や脊髄小脳萎縮症18などの大脳皮質病変を含む多くの神経変性疾患における前肢運動機能17の尺度も提供します。
オープン フィールド試験は、従来一般的な運動レベル、およびボックスの中心で彼らの滞在時間の面で齧歯動物の意思を測定するために使用実験です。運動経路、速度と時間マウス滞在、歩く、オープン フィールドの特定の領域は、PD19の運動機能を評価できるのではなく、フィールド全体でそれぞれ実行します。シンプルですぐに利用できるソフトウェアのコーディングを活用 (材料表参照)、入手でき、効率的に運動機能に関連するデータを分析します。
シリンダー テストとオープン フィールド試験は、次の理由により PD モデル マウスの自発の機関車関数を測定するため選ばれました。マウスの行動テストの前に訓練を受ける必要はありません。数分だけが効率を保証する応答を必要です。テストを実行するために必要な機器のコストは低いです。しかし、この法案の主要な不利な点は動物の活動レベルが環境の変化や個人差により大きく異なることが。結果データの変化の量を減らすためには、注意が必要です。まず、同じ年齢、性別、遺伝的背景20,21,22の動物を同時に評価されなければなりません。第二に、装置、シリンダー、オープン フィールド、洗浄前に、と後それぞれのマウスをテストする必要があります。最後に、環境を保つ、静かで、邪魔されず、テスト中に。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
私たちの仕事は、技術革新と起業家精神 (許可番号 63183004) 天津全学教育訓練によって資金を供給します。このプロジェクトは、状態キー研究所の医薬化学生物学の南開大学で開始されました。著者は、利害の衝突がないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Ruiboxing Company | RBX-64175 | |
| Camera | BASLER | acA645-100gm | |
| Cylinder test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Levodopa | Sigma-Aldrich | 72816 | |
| Matalb 2017a | Mathworks | N/A | |
| Mice | Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences | Balb/c | Adult female mice(10 weeks) |
| MPTP | Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai | S31504-500mg | |
| Open field test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Syringe | Solelybio | S-xsgwz-w | Irrigation |
| Syringe | Jiangxi Fenglin Medical Application Co. | hc3824 | Intraperitoneal injection |
References
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