Summary
Vi beskriver upprättandet av en murin modell för Parkinsons sjukdom med MPTP och beteendemässiga bedömningar med cylinder och öppet fälttester för att mäta motorik. Vi använder sedan L-DOPA som ett exempel för att visa hur man kan tillämpa denna modell i studien av PD droger.
Abstract
Parkinsons sjukdom (PD) är en vanlig neurodegenerativ sjukdom sjukdom, orsakar fenomen av skakningar, stelhet, långsamma rörelser och demens. 1-methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) kan leda till vissa Parkinson-liknande symtom genom att förstöra dopaminerga neuron i substantia nigra i hjärnan. Det har alltså använts att upprätta PD-modeller i olika djurförsök. Här, möss få MPTP injektioner (20 mg/kg/dag) i sju dagar och beteendemässiga tester utförs på den åttonde dagen. Denna modell är anpassad effektivt i studien av PD. De beteendemässiga testerna här omfattar testet cylindern och öppen fältprovet. Cylinder experimentet används för att upptäcka djurens förmåga att lyfta sina främre tassar då satte i en annorlunda miljö. Som PD modell möss visar övergripande — musen arches ryggen — antalet tass liftings minskning. Detta test är lätt att utföra. Öppna fältet testet används för att upptäcka mängden tid mössen spenderar på löpning, promenader och återstående orörliga. Vi analyserar djurens rörelser i öppna fältet med programvara och få data. Slutligen använder vi L-DOPA, en av mest vanligaste PD droger, som ett exempel som visar hur du tillämpa denna modell för studier av PD droger. Våra resultat indikerar att MPTP neurotoxicitet inducerar motor underskott som kan mildras av L-DOPA.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD), en av de vanligaste sjukdomarna bland äldre individer, är en långsiktig neurodegenerativ sjukdom1. Patienter uppvisar alltid fenomen av skakningar, stelhet, långsamma rörelser och demens som förvärras över tid2. Andra symtom inklusive sensoriska, observeras sömn och känslomässiga problem också vanligen2. Orsaken till PD är fortfarande oklart, men det anses allmänt att involvera både genetiska och miljömässiga faktorer, som framkalla förlusten av dopaminerga neuron i substantia nigra3, och utvecklingen av Lewy organ och Lewy neuriter i olika regioner i den hjärnan4.
Bland studierna av PD anpassas 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)5 allmänt i att återskapa vissa PD symtom i experimentella modeller. 1984 fann Langston et al. först att injektioner av MPTP i dödskalleapor resulterade i Parkinsonism6. Även om MPTP gnagare modellen inte visar närvaron av Lewy organ, som är en biomarkör för PD, orsakar MPTP Parkinson-liknande symtom genom att förstöra dopaminerga neuron i substantia nigra av hjärnan7. Jämfört med andra läkemedel modell för PD som induceras av 6-hydroxydopamine (6-OHDA)8 och 1-metyl-4-phenylpyridinium (MPP +)9, injektion av MPTP är lätt att köra och den MPTP-modellen tar mindre tid. Möss få MPTP injektioner (20-30 mg/kg/dag) för sju dagar, och de beteendemässiga testerna utförs på den åttonde dag10.
Öppna fältet test11 utvecklades först av Calvin S. Hall, en amerikansk12. I olika studier, är olika typer av beteenden testade. I forskning som fokuserar på Parkinsons sjukdomar, beteenden som locomotion aktiviteter och hastigheten på locomotion testas för att se om djurets förmåga att flytta runt påverkas. Jämfört med andra metoder som används för att testa inrättandet av PD djur, öppna fältet testet är lätt att genomföra eftersom den utrustning som behövs är enkel, och prototyper och data analys programvara (t.ex., MATLAB, Excel) kan användas för att enkelt samla in och diagram den data. Variationskoefficienten är också relativt liten13, vilket innebär att resultatet av öppet fälttest är tillförlitlig. En annan fördel över andra metoder är att de beteenden som ingår i detta experiment är lätt att skilja; möss kan vara antingen löpning, promenader eller står still. Öppna fältet testet kan oftast användas på gnagare när forskaren behöver utvärdera ämnets rörlighet.
Den Cylinder testet kallas också testet av asymmetriska användning av frambenen. När detta test utformades först, användes det för att testa asymmetrisk användningen av råttans frambenen14. Här, använder vi detta test för att analysera djurets förmåga att sträcka ut och använda båda sina framben för att utforska nya omgivningar. När den substantia nigraen och corpus striatum skadas av MPTP i hjärnan, djuret tenderar att arch ryggen och blir mindre benägna att sträcka ut och utforska okända miljö. Detta test är lätt att utföra och kan ge ett preliminärt resultat. Detta test har dock hög inre variabilitet, så det är allmänt används med tillsammans med andra beteende experiment.
Tar L-DOPA, som är också känd som levodopa eller L-3,4-dihydroxifenylalanin, är ett vanligt sätt att behandla Parkinsons sjukdom eftersom en orsak till PD är minskningen av dopamin i den. L-DOPA är en förelöpare till dopamin. Men till skillnad från dopamin, det kan passera blod - hjärnbarriären, vilket innebär att det blir effektivare för att öka koncentrationen av dopamin i hjärnan området. Efter det passerar på blod - hjärnbarriären, omvandlas L-DOPA till dopamin av L-amino acid decarboxylase15.
Här beskriver vi mätning och analys av motorisk funktion i MPTP-inducerad-PD modell möss med en cylinder test14 och en modifierad öppet fälttest. Vi administrerar L-DOPA som ett exempel som visar hur du tillämpa denna modell i studien av PD droger. Våra resultat indikerar att MPTP inducerar motor underskott som kan mildras av L-DOPA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie utfördes enligt internationella, nationella och institutionella regler med tanke på djurförsök. Studieprotokollet godkändes av utskottet djuretik Nankai University.
1. MPTP och L-DOPA administration
Obs: Tio veckor gamla honmöss BALB/c tillhandahölls av det Institutet Zoologiska institutionen, kinesiska vetenskapsakademin. Möss var inhysta sex per bur under en 12 h ljus/mörk cykel (lamporna på kl 08:00-20:00), en konstant temperatur på 21-22 ° C och en relativ luftfuktighet på 55% ± 5%. Ånghärdad standardmöss chow av den samma formulering och vatten ad libitum gavs till alla djur.
- Efter en veckas acklimatisering, dela in djur i tre grupper av sex möss varje.
- Grupp 1, administrera intraperitoneal injektion (se steg 1,5) 250 µL/mus/dag saltlösning från dag 1 till dag 7 och sedan utföra intragastrisk administration (se steg 1,6) av 250 µL/mus koksaltlösning på dag 8.
- Till grupp 2, administrera intraperitoneal injektioner av 20 mg/kg/dag av MPTP varje dag från dag 1 till dag 7 och sedan utföra intragastrisk tillförsel av 250 µL/mus koksaltlösning på dag 8.
- Grupp 3, administrera intraperitoneal injektioner av 20 mg/kg/dag av MPTP från dag 1 till dag 7 och sedan utföra intragastrisk administrering av 5 mg/kg av L-DOPA på dag 8.
- Så här gör du en intraperitoneal injektion.
- Läsa in läkemedlet i en steril 1 mL spruta med 26 G nål. Eliminera luft ur sprutan.
- Kragen musen med mage vänd uppåt. Hålla huvudet, halsen och kroppen av en mus i en rak linje samt med huvudet fast.
- Angle nålen att tränga igenom bukhinnan. Tryck nålen för ett korrekt avstånd tills det är lite motstånd och sedan injicera drogen. Dra ut injektionsnålen smidigt.
- Utföra intragastrisk administrationen enligt följande.
- Förbereda medicineringen i en steril 1 mL spruta med en oral-sondmatning nål. Eliminera luft ur sprutan.
- Håll musen med dess mage vänd uppåt. Hålla huvudet, halsen och kroppen av en mus i en rak linje med huvudet fast.
- Håll nålen parallellt med kroppen av musen och för in den från hörnet av musens mun, att trycka på tungan och trycka inåt mot överkäken.
- Med lite motstånd, som visar nålen går in matstrupen smidigt, tryck försiktigt in nålen i ett korrekt avstånd. Innan spetsen på nålen når den nedre delen av bröstet, injicera läkemedlet.
- Dra ut injektionsnålen smidigt.
2. cylinder test
Obs: De beteendemässiga testerna utfördes på dag 8. L-DOPA injicerades till den tredje gruppen av möss 40 min innan de beteendemässiga testerna. Om beteendemässiga testning inte görs i samma rum där djuren hålls, måste djuren vara acklimatiserad till det nya rummen för 30-60 min innan testet.
- Utför testet 24 h efter sista dosen av MPTP.
- Placera en genomskinligt glas cylinder (höjd = 19,5 cm, diameter = 15 cm, vikt ≥1 kg) i mitten av en tabell. Omge cylindern på tre sidor med svart kartong för att minska effekten av miljömässiga belysning. Lämna en sida av cylindern inför kameran för videoinspelning.
Obs: Avståndet mellan kartong och cylinder bör vara ca 4 till 8 cm. - Bifoga en kamera (> 1 miljon-pixel beslutsamhet) på ~ 40-60 cm från cylindern ska säkerställa att full cylindern är synlig.
Obs: Detta är varken för nära eller för långt för att inte störa musen medan du spelar in video av dess rörelse. - Placera en mus i cylindern i taget och starta inspelningen på en gång. Stoppa inspelningen efter 3 min.
Obs: Under denna process, försök att undvika buller eller ljus förändringar för undvika att påverka musens beteende. - Placera musen tillbaka i buren efter provning.
- Rengöra cylindern med vatten och sedan spraya 70% v/v etanol över den inre väggen att sanera det och ta bort musen dofter. Torka cylindern innan en annan mus placeras i.
- Spela upp videon med en hastighet av 0,5 x ordinarie hastighet och räkna antalet tass hissar mot väggen av varje mus.
Obs: Tass liftar inträffar när musen sticker upp upp på dess bakbenen, höjer båda frambenen ovan axelhöjd och landar. En forelimb hiss räknas inte. Vanligtvis, väcker en mus dess frambenen för att röra på cylinderväggarna. Om musen höjer dess framben ovanför axelhöjd flera gånger kontinuerligt utan landning, bör det räknas endast en gång.
3. öppna fälttest
- Utför testet öppet fält 24 h efter MPTP dosering.
Obs: Det kan utföras samtidigt testets cylinder. - Förbereda en transparent öppna fältet reaktion låda (45 cm L x 45 cm W x 25 cm H) med en träplatta i botten av en svart trasa. Fixa en kamera (> 1 miljon-pixel beslutsamhet) över fältet på en höjd av 1 m.
Obs: Färgen på öppna fältet rutan längst ner bör vara annorlunda från testade mus färgen att säkerställa kontrasten i videon. - Justera kameran för att kontrollera att rutan Öppna fältet reaktion är rätt i mitten av videon.
- Sätta en test mus i rutan och låt musen bekanta sig med miljön i ca 1 min.
- Spela in en 5 min video med kameran ansluten till datorn.
- Analysera videon med programvaruverktyg (t.ex. MATLAB) för att få figuren spår rörelse, distribution av statiska (velocity < 1 cm/s), promenader (hastighet 1-20 cm/s) och kör (velocity > 20 cm/s) gången, den totala reste sträcka, och hastigheten för varje testad mus.
Obs: När analysera videon, vi spårar hela kroppen av musen. Den genomsnittliga hastigheten för en kropp betyder den totala längden på sökvägen omfattas, dividerat med den totala träningstiden. Därför, om en mus inte går, dess momentana hastighet skulle anses vara noll. - Städa upp någon avföring i rutan Öppna fältet reaktion. Spray 70% etanol på rutan och torka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I cylindern test observerades minskningen av föder upp mot väggen hos möss (grupp 2) behandlades med MPTP från dag 1 till dag 7 och saltlösning på dag 8 jämfört med saltlösning-behandlade möss (grupp 1), medan en ökning av föder upp observerades hos möss (grupp 3) behandlade med MP TP från dag 1 till dag 7 och L-DOPA på dag 8 jämfört med möss (grupp 2) behandlades med MPTP från dag 1 till dag 7 och saltlösning på dag 8 (figur 1).
Figur 2 visar representativa spår och distribution av statiska tid, gångtid och rinnande tid av de tre grupperna av möss. (A) behandlades möss med koksaltlösning. I (B) möss behandlades med MPTP från dag 1 till dag 7 och saltlösning vid dag 8. I (C) möss behandlades med MPTP från dag 1 till dag 7 och L-DOPA vid dag 8. När en mus rörde sig i arenan öppet fält med hastighet < 1 cm/s, 1-20 cm/s, eller > 20 cm/s, bedömdes det som statisk, går eller springer respektive. Möss som behandlats med endast MPTP visade en lägre rörelsehastighet, en kortare rörelse sträcka, statisk längre och en kortare speltid än saltlösning-behandlade möss, som indikerade motor underskottet induceras av MPTP. Möss som behandlats med både MPTP och L-DOPA visade en högre rörelsehastighet, en längre rörelse sträcka, kortare statisk tid och en längre drifttid än mössen behandlades med bara MPTP (figur 2, figur 3), som visade att L-DOPA mildrat den MPTP-inducerad motor underskott.
Figur 1: effekter av MPTP på motorprestanda i cylinder test. Detta visar analysen av numrerar av uppfödning den 8: e dagen. * representerar p < 0,05, ** representerar p < 0,01 för en envägs ANOVA-test. Alla värden representerar medelvärdet ± SD (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: rörelse sökvägen till möss och fördelningen av tid som möss bo, gå och springa under 5 min i det öppna fält testet. (A) obehandlade möss. (B) möss behandlades med MPTP. (C), PD modell möss räddas av L-DOPA. Kör: musen rörde sig med en hastighet av mer än 20 cm/s. promenad: musen var flytta i det öppna fältet och med en hastighet av 1-20 cm/s. Static: musen var stillastående (hastighet < 1 cm/s) i fältet öppna (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: motor underskottet induceras av MPTP och den terapeutiska effekten av L-DOPA på motorprestanda i öppet fälttest. (A) analys av statisk, promenader och löpning tid. (B) analys av genomsnittliga rörelse avstånd. (C) analys av genomsnittliga rörelsehastighet. representerar p < 0,001, *** representerar p < 0,0001 för en envägs ANOVA-test. Alla värden representerar medelvärdet ± SD (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av förstörelsen av dopaminerga neuron i substantia nigra av hjärnan orsakar MPTP Parkinson-liknande symtom i möss7. L-DOPA är den mest föredragna drogen för PD någonsin sedan dess kliniska användning, eftersom det hjälper till att upprätthålla normala dagliga aktiviteter hos patienter med PD, med effektiv suppression av motoriska avvikelser inklusive akinesi och rigiditet15. Mössen behandlades med MPTP visade nedskrivningar i de beteendemässiga testerna som cylinder test och öppna fälttest, som kan användas för att studera MPTP modellen. Cylinder och öppna fältet-proven används vanligen att mäta spontan handling. Här, ändrade vi dessa två beteendemässiga tester för att tillämpa dem i studien av PD. I våra resultat visas L-DOPA kan mildra försämringar i beteende genom att förbättra djurens motoriska förmågor.
Normalt, utforska möss sin omgivning när de höll introducerade till en ny miljö. Således, när den förvaras i en genomskinlig cylinder, utforska de inom cylindern genom att flytta runt och höja deras kroppar att röra cylinder väggar med sina framben. Möss berusade med neurotoxiska ämnen såsom MPTP, minska denna åtgärd. Detta tillåter oss att tillämpa testet cylinder i PD-studien. Tass hissar kvantiteter indikerar forelimb användning för kroppsstöd och används således för att utvärdera effekten av nya kemiska entiteter på motorprestanda16. Cylinder testet ger också ett mått för forelimb motorik17 i många neurodegenerativa sjukdomar som innefattar motoriska cortex lesioner, såsom amyotrofisk lateral skleros och Spinocerebellär atrofi18.
Öppna fältet testet är en experimentell test som konventionellt används till assay allmänna rörelseaktivitet nivåer och viljan hos gnagare när det gäller den tid som de bo på mitten av rutan. Mätning av rörlighet sökväg, hastighet och tid mössen bo, promenad och köra respektive i hela fältet i stället för att specifikt område i öppet fält kan utvärdera motorik i PD19. Att utnyttja enkel och lättillgänglig kodning programvara (se Tabell för material), vi kan hämta och analysera data relaterade till rörelseapparaten funktionen effektivt.
Testet cylindern och öppen fältprovet valdes att mäta spontana lokomotivet funktion i PD modell möss av följande skäl. Mössen behöver inte utbildas innan de beteendemässiga testerna. Bara flera minuter krävs för svar, vilket säkerställer effektiviteten. Kostnaden för den utrustning som behövs för att utföra testerna är låg. En stor nackdel med denna åtgärd är dock att djurens aktivitetsnivåer kan variera kraftigt på grund av miljön förändras och individuella skillnader. För att minska mängden variation i utfallsdata, bör försiktighet iakttas. För det första bör djur av samma ålder, kön och genetiska bakgrunden20,21,22 bedömas på samma gång. För det andra, utrustning, cylinder och öppna fältet, måste rengöras före och efter testning varje mus. Slutligen hålla miljön lugnt och ostört under provningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vårt arbete finansieras av Tianjin grundutbildning träningsprogram för Innovation och entreprenörskap (Grant nr 63183004). Projektet inleddes i staten nyckel laboratorium av läkemedel kemisk biologi vid Nankai University. Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Ruiboxing Company | RBX-64175 | |
| Camera | BASLER | acA645-100gm | |
| Cylinder test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Levodopa | Sigma-Aldrich | 72816 | |
| Matalb 2017a | Mathworks | N/A | |
| Mice | Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences | Balb/c | Adult female mice(10 weeks) |
| MPTP | Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai | S31504-500mg | |
| Open field test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Syringe | Solelybio | S-xsgwz-w | Irrigation |
| Syringe | Jiangxi Fenglin Medical Application Co. | hc3824 | Intraperitoneal injection |
References
- Dehay, B., Bourdenx, M., Gorry, P., Przedborski, S., Vila, M., Hunot, S., Singleton, A., Olanow, C. W., Merchant, K. M., Bezard, E. Targeting -synuclein for treatment of Parkinson's disease: mechanistic and therapeutic considerations. Lancet Neurology. 14, 855-866 (2015).
- Weintraub, D., Comella, C., Horn, L., S, Parkinson's disease - Part 1: Pathophysiology, symptoms, burden, diagnosis, and assessment. American Journal of Managed Care. 14, 40-48 (2008).
- Ismaiel, A. A., et al. Metformin, besides exhibiting strong in vivo anti-inflammatory properties, increases mptp-induced damage to the nigrostriatal dopaminergic system. Toxicology and Applied Pharmacology. , 19-30 (2016).
- Bayliss, J. A., et al. Ghrelin-AMPK signaling mediates the neuroprotective effects of calorie restriction in Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 36, 3049-3063 (2016).
- Olanow, C. W., Stern, M. B., Sethi, K. The scientific and clinical basis for the treatment of Parkinson disease. Neurology. 72 (21 Supplement 4), (2009).
- Chiba, K., Trevor, A., Castagnoli, N. Metabolism of the neurotoxic tertiary amine, MPTP, by brain monoamine oxidase. Biochemical & Biophysical Research Communications. 120 (2), 574-578 (1984).
- Bakay, R. A., et al. Biochemical and behavioral correction of MPTP parkinson-like syndrome by fetal cell transplantation. Annals of the New York Academy of Sciences. 495 (1), 623-638 (2010).
- Kelly, P. H., Seviour, P. W., Iversen, S. D. Amphetamine and apomorphine responses in the rat following 6-OHDA lesions of the nucleus accumbenssepti and corpus striatum. Brain Research. 94 (3), 507-522 (1975).
- Langston, J. W., Irwin, I., Langston, E. B., Forno, L. S. 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+): identification of a metabolite of MPTP, a toxin selective to the substantia nigra. Neuroscience Letters. 48 (1), 87-92 (1984).
- Katila, N., et al. Metformin lowers α-synuclein phosphorylation and upregulates neurotrophic factor in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 125, (2017).
- Goldberg, N. R. S., Haack, A. K., Lim, N. S., Janson, O. K., Meshul, C. K. Dopaminergic and behavioral correlates of progressive lesioning of the nigrostriatal pathway with MPTP. Neuroscience. 180, 256-271 (2011).
- Schwarting, R. K., Sedelis, M., Hofele, K., Auburger, G. W., Huston, J. P. Strain-dependent recovery of open-field behavior and striatal dopamine deficiency in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Neurotoxicity Research. 1 (1), 41 (1999).
- Shiguang, S., et al. The open field test as a method for ethology in Kunming mice: test-retest reliability. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science. 19 (12), 1093-1095 (2010).
- Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-Dragging: a Novel, Sensitive Analysis of the Mouse Cylinder Test. Journal of Visualized Experiments. (98), e52701 (2015).
- Cotzias, G. C., Van Woert, M. H., Schiffer, L. M. Aromatic amino acids and modification of Parkinsonism. New England Journal of Medicine. 282, 31-33 (1967).
- Cassady, J. C., Johnson, R. E. Cognitive test anxiety and academic performance. Contemporary Educational Psychology. 27 (2), 270-295 (2002).
- Rogalewski, A., et al. Semaphorin 6A improves functional recovery in conjunction with motor training after cerebral ischemia. Plos One. 5 (5), 0010737 (2010).
- Chen, W., Qiao, D., Liu, X., Shi, K. Treadmill exercise improves motor dysfunction and hyperactivity of the corticostriatal glutamatergic pathway in rats with 6-ohda-induced parkinson's disease. Neural Plasticity. 2017, 2583910 (2018).
- Colas-Zelin, D., et al. The imposition of, but not the propensity for, social subordination impairs exploratory behaviors and general cognitive abilities. Behavioural Brain Research. 232 (1), 294-305 (2012).
- Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
- Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. American Journal of Psychology. 83, 103-111 (1970).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and Locomotor Measurements Using an Open Field Activity Monitoring System for Skeletal Muscle Diseases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51785 (2014).
