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Immunology and Infection

ロボット システムを使用して処理し、組織学的解析のため大腸マウス サンプルを埋め込む

doi: 10.3791/58654 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

マウスのティッシュの処理の標準化の欠如は、人体標本と比較するとマウスの病理組織学的解析の画質を低下させます。ここでは、炎症や uninflamed での処理とひと試料を埋め込むのため日常的にロボット システムの可能性を示すため大腸組織をマウスの病理組織学的検査を行うためのプロトコルを提案する.

Abstract

人間の病気の理解は、動物モデルの研究のおかげで大幅に拡張されています。それにもかかわらず、実験モデルの病理組織学的評価は厳格ひと試料に適用する必要があります。確かに、信頼性と正確な結論を導き出す、ティッシュ セクションの準備の質によって影響批判的に。ここでは、マウスのサンプルのパラフィン包埋する初期の準備から、手順の中にいくつかの自動化された手順を実装するマウス組織の病理組織学的解析のためのプロトコルについて述べる。自動化された手順から厳格なプロトコルの標準化、方法論的変数の削減は、マウスの病態解析の全体的な信頼性の向上に貢献します。具体的には、このプロトコル処理の自動化の使用率について説明します、ロボット システムを埋め込む日常的に使用ティッシュの処理、パラフィン包埋ひと試料の腸管炎症のマウス試験片を処理します。マウス組織の病理組織学的検査の信頼性が標準化と自動化技術の導入時に著しく増加することが分かった。

Introduction

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最後の十年では、人間の病気1,2につながる病原性のメカニズムを解剖するいくつか実験的なモデルが開発されています。疾患の重症度を評価するために研究者は治療の効果の評価、細胞学的・組織学的アーキテクチャのバリエーションや炎症3の量を研究する必要があります。それらの実験モデルに実行するには、多くの場合マウスと人間のサンプル4,5を比較詳細な病理組織学的解析が必要です。

また、ひと試料は一般的処理および病理コア施設で得点、を通して経験豊富な人間の病理病理組織学的基準・方法の標準化します。逆に、マウス組織は通常固定、埋め込まれ、病理組織学的プロトコルの限られた経験を持つ研究者によって分析しました。病理組織学的検査の信頼性と品質高品質ティッシュ セクションの準備から始まります。いくつかの要因は、固定、マクロを含む、最終的な分析の品質区分、処理、パラフィンの埋め込みと埋め込みサンプル67の増減に批判的に貢献します。

サンプルの操作を含むすべてのこれらの通路は、マニュアル サンプルの埋め込みなど、手作業によるエラーより少ない程度に、手動ミクロトーム切片および汚損にさらされます。現時点では、組織学的評価のためのマウスのティッシュの準備のプロセス全体は、マニュアルや研究室から研究室を異なるプロトコルに依存します。本研究の目的は、マウスの病理組織学的検査の変動とエラーを減らすために標準化された自動化されたプロトコルを実装することです。

我々 の知識を述べるここで完全に自動化された組織処理およびマウスの組織の組織学的評価のための埋め込みの最初のプロトコルこれらは日常的に病理単位で人体標本の分析に使用されます。メソッドの実行可能性の実用的な例として腸炎のマウスモデルが分析されて、すなわち, , 慢性大腸炎モデルによる飲料水8 デキストラン ナトリウム硫酸塩 (DSS) の反復投与、9。DSS 投与動物は、体重減少、軟便または下痢、そして線維症と同様、大腸の短縮など腸の炎症の兆候を示すので人間の炎症性腸疾患 (IBD)10のような密接にこの実験的設定8,9,11。人間の IBD 患者の観察、DSS 治療は複雑な病気のコースを生成します。この文脈では、精巧な組織学的評価は、組織アーキテクチャの深遠な変更を理解する必要があります。したがって、サンプル準備の質を高めるための説明のプロトコルの実装が組織学的の解釈に依存する研究者を受けることが、マウス実験的設定の免疫組織化学的解析。実験モデルマウスの組織構造変化を伴う疾患の細胞組織潜入やさまざまな組織、臓器 (腸、脳、肝臓、皮膚) の炎症の存在使用の品質が向上した、病理組織学的検査のための試料調製。

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Protocol

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動物の手続き健康 (認証 127/15、27/13) イタリア省によって承認され、腫瘍 IACUC (制度的ケアおよび使用委員会) の欧州研究所の動物のケアのガイドライン

1. 慢性大腸炎反復的な DSS 投与による誘導

  1. 別年齢とセックス (H2O 対 DSS 処理, 実験群あたり少なくとも 5 マウス同腹子) 2 つのグループのマウスに一致。
  2. 2.5% を管理 DSS (40 kDa) 治療グループに 7 日とコントロール グループに水を飲料水に。
    注:このモデルでは、慢性的な貫壁性腸炎9を誘導します。
  3. 7 日後 DSS 治療を中止し、14 日間の両群れに水を与えます。このプロセスを 3 回繰り返します。
    注: DSS の反復的な管理は、密接に人間の IBD、すなわち、線維症9に似た大腸粘膜の変化を誘導します。
  4. CO2吸入によってすなわち制度 IACUC によって承認の手順に従ってマウスを犠牲に。
  5. メスのマウスの腹腔と腹膜を開きます。
    注:不妊が推奨されますが、必須ではありませんが。
  6. 鉗子、ピンセット、小腸からコロンで区切ります。ピンセットや鉗子で大腸を切除します。
    注:大腸の長さの測定 (図 1 a) は、DSS 投与マウスで大腸炎が発生したかを判断する方法です。
  7. リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 冷 1 の 10 mL をシャーレにコロンをすすいで軽く押して糞便材料を削除します。

2. マウス組織固定

  1. 10 mL の 10% に各マウスの結腸標本を浸す常温 (室温) 中性緩衝ホルマリン (NBF)。
    注:不妊が推奨されますが、必須ではありませんが。
  2. 室温 18-24 h のための組織を修正します。

3. 大腸の区分およびティッシュの準備

  1. 小さなピンセットで NBF コンテナーから固定組織を削除し、シャーレに入れてください。小さなピンセットでセクショニング作業プレートにコロンを置きます。
  2. 生殖不能のメスとフラグメント (0.3 cm 長さに 0.2 cm) にコロンをカットします。このフラグメントの長さは、カセットの厚さを超えないに最適です。
  3. 小さなピンセット (図 2 a) で 1 つのコロンのセグメントを拾います。突き出た小さなピンセット (図 2 b) でカセットを埋め込み志向のパラフィンのヒント プラスチックの 1 つに 1 つのコロンのセグメントを挿入します。
  4. カセットごと追加 3 コロン セグメント操作 (3.2-3.3) を繰り返します。隣接する突出のヒントは、組織の重複を最小限に抑えるために、セグメントを挿入するを避けるため
  5. (図 2) の 4 つの端を慎重に押してカセットをしっかりと閉じます。組織の損傷を防ぐためにティッシュを絞るしないでください。
  6. プラスチック サポート フレーム グリッドに挿入します。サンプルを識別するサポート フレームにラベルを付けます。生物学的サンプルごとに繰り返します。

4. ティッシュの処理

  1. (図 3 a, 3 b) の電源ボタンを押すことで自動プロセッサを入れます。
  2. ウォーム アップに、パラフィン ワックスを溶融して 1 h。計測器は、専用のアイコン (図 3) の存在を観察することによって、パラフィンが完全に溶融を確認するまでを待ちます。
  3. 自動化されたプロセッサ (図 3 D) によって提供される金属のバスケットに方向づけられたカセットの各 (組織標本を含む) 手動でを挿入します。バスケットの占有率を最適化するために他に 1 つの近くにそれらを並べることによってカセットを垂直方向に配置します。
  4. 金属のバスケット (図 3E) を閉じます。
  5. レトルト (図 3 f) のカバーを開きます。レトルトはマシンにバスケットが挿入される場所です。バスケットをプロセッサ (図 3) の専用ハウジングに挿入します。レトルト (図 3 H) の蓋を閉じます。
  6. 器コンピューターのタッチ スクリーンを使用すると、作業プロトコル (図 3 i) を定義できます。ソリューション、タイミングおよび表 1に提供スキームに従って実装する温度のシーケンスを選択します。
  7. (図 3J) 専用のコンピューター アイコンをクリックして、バスケットを含むレトルトで実行するプロトコルを割り当てます。[スタート] ボタン(図 3 L) をクリックしてプロトコルを起動します。
  8. 楽器専用のアイコンの存在を観察することによって、マシンからアラーム音を聞くことによって、プロトコルの最後を確認するまでを待ちます。
  9. レトルトのカバーを開きます。プロセッサ (図 3 M) からバスケットを削除します。

5. 組織の埋め込み

  1. 電源ボタン (図 4 a) を押すことで自動埋め込みソフトを入れます。
  2. ウォーム アップに、パラフィン ワックスを溶融して 1 h。楽器は、パラフィンが楽器の内部温度計によって示されるパラフィン浴の温度を観察することによって完全に溶融を確認するまでを待ちます。
  3. Embedder ラックにプロセッサ バスケットからすべての処理されたカセットを手動で転送します。各ラックは、最大 32 のカセットを含めることができます。(図 4 b 4 C)。
  4. 主な端末カバー (図 44 D、4 e) を開きます。
  5. ロボットに信号器コンピューターのタッチ スクリーンを使用システム ラックがされている挿入 (図 4 階)。
  6. 入口住宅ふた (図 4) を開きます。入口ハウジング ラックに挿入します。各端末は、同時に最大 4 ラックを含めることができます (図 4 H4 i)。入口住宅ふた (図 4 j) を閉じます。
  7. 表 2 (図 4 K) によると埋め込み手順を開始するのに器コンピューターのタッチ スクリーンを使用します。
    注: 32 カセットの各ラックは、埋め込まれる 45 分かかります。
  8. 楽器専用のアイコン (図 4 L) の存在を観察することによって、プロトコルの最後を確認するまで待機します。
  9. アウトレット ラック (図 4 M) を削除します。主な端末カバーを閉じます。
  10. ラックから (方向グリッドを含む) 埋め込みのブロックを削除します。ストレージの段ボール箱で埋め込まれたブロックを転送します。

6 マイクロメートルの断面

  1. ミクロトームの冷却板を入れます。-8 間温度設定、-10 ° C
  2. 蒸留水 2 L を含む、ミクロトームの恒温水槽を入れます。42-45 ° c の水浴の温度を設定します。
  3. パラフィンの場所には、冷却プレート上のブロックが埋め込まれています。クールなブロックを許可するように少なくとも 5 分を待ちます。
  4. 冷却板から 1 ブロックを取り出してミクロトーム ブロック ホルダーにします。
  5. 10 μ m の厚みで 6 回を切断することによって膜厚を 10 μ m トリム ブロックをカット ミクロトームを設定します。
  6. 10 μ m から 3 μ m カット 1 つ 3 μ m については、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色するミクロトームの太さの設定を変更します。
  7. 小さなブラシで 3 μ m のセクションを収集します。慎重に組織のしわを減らすために水の表面上に敷設、風呂の水で 3 μ m のセクションを置きます。風呂のサーモスタットに制御された水から単一のガラス スライドに組織切片を収集します。
    1. 必要な場合は、追加のセクションをカットします。
  8. サンプル id を書き込むことによってガラス スライドにラベルを付けます。
  9. 少なくとも 10 分の 37 ° C のオーブンでスライドを置きます。
  10. ラック収納ボックス、即時解析のためにスライド ガラスを置きます。

7. ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色

  1. 電源ボタンを押すことで自動着色剤に切り替えます。楽器のモニターに読み込んでバーの変化を観察することによってロボットのアームの初期化を許可します。
  2. 垂直方向に最大 30 スライドの挿入、テナー ラックにガラス スライドを挿入します。
  3. 適切な無線周波数識別 (RFID) のプラスチック ・ タグとラックのラベルを付けます。RFID タグは、テナーのコンピューターに読み込まれる正しいの汚損のプロトコルを識別するシステムです。
  4. ラックをテナーに挿入します。自動的に読み込んで、RFID タグの認識によると汚損のプロトコルを起動するコンピューターを許可します。
    注:H & E 染色プロトコルに記載されてテーブル 3.

8. 免疫組織化学的染色

  1. 免疫組織化学的および Mallory ヒアリン前述7染色法を実行します。

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Representative Results

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飲料水の DSS の反復投与による実験的慢性大腸炎は、密接に人間の IBD8,9に似た腸内の炎症のマウス モデルです。図 1大腸の短縮の (図 1 a)、DSS 誘発炎症の有無、大腸CXCL10 を含むプロ炎症性の遺伝子発現を獲得する広く使用されるパラメーターを含む DSS 治療の効果を説明します。tnfmcp 1 (図 1 b)。炎症性細胞の浸潤は、DSS 治療、cytofluorimetry (図 1) を用いて、腸管粘膜の免疫応答の募集を表示によって大幅に強化されました。

図 2を示していますどのように大腸組織断面、指向のカセットに挿入されます。これらのカセット内方押し出しのヒント、すなわち上下正しい方向の組織の挿入を許可,内側の部分と壁に内腔を持つグリッドが含まれています (図 2 a2 b2 C ).カセットを閉じたら、従来組織カセット (図 2 b) に何が起こるかに反して、グリッドによって組織の方向は保持されます。

埋め込みながら自動プロセッサを搭載し (図 3 a-3 M表 1)、ティッシュの処理を実行 (図 4 a~4 M表 2) 自動化された埋め込みソフトと手順を実行します。後者の楽器でロボットはカセットを収集し、パラフィン系材料の正しい量を分配します。最後に、ミクロトームを使用して、セクションは各パラフィン ブロックからカットされます。スライドはさらなる分析のためにそれから準備されます。

図 5について説明して、自動化された H & E 染色 (図 5 a-5Eおよび表 3) のメイン通路とスライドが H & E 染色 (図 5 階) 後どのように見えます。図 6および7は、自動処理と埋め込みのプロトコルの実装が強くマウス結腸標本の病理組織学的解析の品質を向上する方法を表示します。未処理のねずみ (図 6 a) から派生した自動プロトコルを使用したサンプルの H & E 染色は、(図 6 b) DSS 処理マウスのそれらと比較されました。病理組織学的スコアを含む炎症性細胞の浸潤、上皮の変化に従って粘膜のアーキテクチャの変更腸の粘膜で発生するさまざまなパラメーターの変更を評価することによって評価されました。表 4図 6は、代表 H & E 染色手動で処理され、伝統的なカセットに含まれる大腸組織を示しています。図 7マウス ティッシュの準備と自動機器を介して実行される埋め込みの品質はさらに IHC によって確認された CD20 とマロリー ヒアリン染色8,9大腸での染色未処理 (図 7 a 7 C) の DSS 扱われます (図 7 b7 D) セクション マウス。

図 8では、このメソッドの実用的な関連性について説明します。同じコロン サンプルは処理され、手動または自動の方法で埋め込まれています。各サンプル (どちらかコントロールまたは DSS 処理) 2 等分にカットされ、手動または自動の方法で並列で処理します。粘膜のアーキテクチャ、粒度、免疫細胞の変化に侵入、粘膜の厚さ、腺の膨張通常実行し、アドレスすべての病理学的パラメーターに関する完全な顕微鏡的評価にあった H & E 染色腸の炎症の時に観測された、マニュアルの各サンプルは、評価された、自動プロトコル (図 8 a および表 4)。自動化されたプロトコルと試料の調製は、一貫して手動メソッドよりも組織学的パラメーターの高い割合の評価を許可しました。さらに、さまざまな組織学的パラメーターの個別分析を行った (図 8 b)。アーキテクチャと基底潜入評価積極的に影響を受けた、未処理のねずみで特に自動化された方法での試料調製によって。

自動サンプル処理および人間の病理組織学的解析の現在使用されている埋め込み法は、マウス試験片の分析を正常に適用できます。高品質の標本は、アーキテクチャの評価とマウスの大腸組織の基底免疫潜入の手動の方法上の優位性を示す自動化された方法で生成されます。

Figure 1
図 1: 慢性の腸管炎症評価します。(A) コロンの長さ測定。(B) 大腸のプロ炎症性遺伝子発現 (cxcl10、tnf、mcp 1) DSS 処理 (黒いバー、n = 12) 未処理のマウスと (ホワイト ・ バー、n = 6)。(C) 診療大腸粘膜の細胞の DSS 処理 (シンボル、n を閉じた = 12) 未処理のマウスと (記号、n を開く = 6)。CD11b + Ly6G + 好中球、CD11b + F4 80 + マクロファージ (左のパネル)、cd 4 + および cd 8 + の T 細胞のコントロール (右側のパネル) 浸潤/(n の記号を開く = 10) と DSS 投与マウス (閉じ記号、n = 10)。ランク t 検定ウィルコクソンの一致するペアを使用して署名された統計的有意性を計算しました。p ≦ 0.05 * * p ≤ 0.01。SEM を報告値 ± を意味します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: サンプル準備の説明。(A) ティッシュの準備と志向のカセットの画像に必要な計測器外部カセット (白) で構成され、内部グリッド押し出し方向のヒント。(B、C)(B) 前にカセットの内部のグリッド内のコロンをマウスのカーソルとグリッドの (C) 閉鎖後。B パネルに描かれている (左) 志向のカセットまたは伝統的なカセット (右)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 自動処理の説明。(A, B) は、プロセッサを自動化しました。(C) アイコンが正しいパラフィン溶融温度を記述します。(D, E)金属のバスケット (D) および (E) の閉鎖にカセットを挿入します。(F, G, H)レトルトの金属のバスケットを挿入します。(I, J, K)処理プロトコルの選択。(L) プロトコルの実行。バスケット フォーム レトルトの (M) の除去。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 自動埋め込みの説明. 自動化された組み込みの (A) の画像。(B、C)ラックにカセットを挿入します。(D, E)(D) (E) の開閉蓋。ラックの存在のマシンに (F) シグナリング。(G, H)入口の住宅にラックを挿入します。(I, J) 蓋を閉じる。プロトコルを埋め込む (K) 開始。(L) アウトレット住宅蓋の開口部。ラック フォーム コンセント住宅の (M) の除去。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 自動化された H & E テナーの説明。(A) 画像のスライド ホルダー。(B、C)マシンでスライド ホルダーを挿入します。マシンの (D) 閉鎖。汚損のプロトコルの (E) スタート。(F) ミクロトーム切断、H & E 染色後のスライドの Exemplificative 画像。右側のパネルは、H & E 染色サンプルの向きを描いたします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 大腸のサンプルの H & E 染色未処理と DSS 投与マウスを形成します。準備 H & E 染色未処理 (A) および DSS 投与 (B) サンプル (処理、埋め込まれた、ステンド グラス) と (A, B) を自動または手動 (C) メソッド。スケールバー = 100 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: マロリー ヒアリン (a, B) と CD20 陽性細胞 (C, D) の浸潤の IHC 染色 (A ~ C) の未処理し、DSS 処理 (B, D) マウスします。マロリー染色: 青、コラーゲン、濃いピンク、核、ダークレッド、細胞質。スケールバー = 100 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8: 手動および自動プロトコルと病理組織学的解析の比較。(A) 合計病理組織学的パラメーター評価準備マニュアル (白棒) または自動化されたメソッド (紫のバー) のすべてのセクションで。準備マニュアル (白いバー) や未処理 (平野バー) または DSS 投与マウス (点線のバー) の自動化されたメソッド (紫のバー) のサンプルで示されているパラメーターの (B) の割合。ランク t 検定ウィルコクソンの一致するペアを使用して署名された統計的有意性を計算しました。p < 0.05;p < 0.005。SEM を報告値 ± を意味します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

試薬 時間 (分) 温度 (° C) 圧力
NBF 1 RT アンビエント
エタノール 95年 % 1 RT アンビエント
エタノール 95年 % 1 RT アンビエント
エタノール 95年 % 1 RT アンビエント
絶対エタノール 1 45 アンビエント
絶対エタノール 11 45 アンビエント
絶対エタノール 30 RT アンビエント
キシレン 1 RT アンビエント
キシレン 1 45 アンビエント
キシレン 28 45 アンビエント
パラフィン ワックス 5 65 真空

表 1: 自動組織処理プロトコルです。

各カセットのロボットによるアクションの実行
1 カセットをラックから取り外してください。
カセットを識別します。
金型予熱
事前に加熱された金型にカセットを配置します。
カセットのパラフィンの量を分配します。
金型を冷却します。
固めるにパラフィンを許可します。
金型から凝固したパラフィン ブロックを削除します。
現在品質センサー ブロック
出力ドアにパラフィン ブロックを配置します。

表 2: 自動プロトコルを埋め込みます。

カテゴリ 基準 定義 スコアの値
炎症性細胞浸潤 重症度(粘膜部に浸潤した白血球密度評価 hpf) ない潜入 0
最低限急性 (< 10%) 0.25
軽度慢性 (10-25%、散乱好中球) 0.5
中程度の慢性 (26-50%) 0.75
マーク (> 51%、高密度に潜入) 1
範囲(白血球浸潤の拡大) 粘膜 0.5
粘膜及び粘膜下 0.75
膜上皮の変化 過形成(縦陰窩、crypt 伸長として表示の上皮細胞数が増加) ない過形成 0
最小限 (< 25%) 0.25
軽度 (26-35%) 0.5
中程度 (36-50%、對窩上皮の上から 3 番目) 0.75
マーク (> 51%、地下基地から遠い窩上皮の有糸分裂) 1
杯細胞の損失(地下室あたり基準杯細胞数を基準にして炎のゴブレット細胞数の減少) 損失なし 0
最小限 (< 25%) 0.25
軽度 (26-35%) 0.5
中程度 (36-50%) 0.75
マーク (> 51%) 1
粘膜のアーキテクチャ 潰瘍(上皮欠損 muscolaris 粘膜を超えて到達) ない潰瘍 0
潰瘍 0.25
肉芽組織(浸潤細胞に囲まれて、新しい毛細血管の結合組織修復肥大エリア) ない肉芽組織 0
肉芽組織 0.25
粘膜の厚さと地下室の深さ ない肥厚 0
肥厚 0.5
腺の膨張 ない希薄 0
真空 0.5
異形成 異型 0
異形成 0.5
最大のスコア 6

表 3: 自動化プロトコルを汚します。

スライドごとに着色してアクション実行 試薬 時間 (秒) 温度 (° C)
Essicate 180 60
Essicate 180 60
Deparaffinize キシレン 120 RT
Deparaffinize キシレン 120 RT
メタンハイド レートします。 エタノール 96年 % 120 RT
メタンハイド レートします。 エタノール 96年 % 120 RT
洗浄 蒸留 wtaer 240 RT
ヘマトキシリンを染色します。 Carazzi のヘマトキシリン 540 RT
リンス 水道水 360 RT
エオシンを染色します。 エオシン Y 1 %aqueos 溶液 60 RT
リンス 水道水 120 RT
脱水 エタノール 96年 % 20 RT
脱水 エタノール 96年 % 20 RT
脱水 絶対エタノール 15 RT
脱水 絶対エタノール 15 RT
明確な キシレン 30 RT
明確な キシレン 30 RT

表 4: 腸管炎症の評価方式の得点。

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Discussion

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マウス組織の病理組織学的解析のための準備の間に別の自動化された手順を利用します。このプロトコルは、最終的な病理組織学的評価の全体的な品質を高め、全体のプロセスの標準化し、再現性を高めるための技術的なヒントを提供することを目指しています。自動化された器械と準備をし、組織、人間標本の調査のため病理コア施設で日常的に使用の埋め込み法を実施しています。

このメソッドの潜在的な適用を示すためには、DSS 誘発大腸炎モデルと呼ばれる腸の炎症の慢性のマウス実験の設定をしました。この設定には、慢性の腸管炎症時に発生した組織アーキテクチャの深遠な変更を調査するための精巧な組織学的評価を必要とする、IBD 患者にみられる複雑な疾患の経過が似ています。完全に、これらのプロセスの組織学的評価が大幅増加し、サンプル準備品質ご利用。注意してこのプロトコルに適用できる他のマウスの組織 (すなわち、脾臓、リンパ節、肝臓、脳)、唯一の違いという指向のカセットは、内腔のない組織には必要ありません。

最も重要な観察だった手作業によるエラーの減少 (すなわち,サンプルの向き) グリッドとカセットの使用とカセットが埋め込み (ステップ マニュアル中に実行される通常の再オープンの除去プロトコル) は強く、分析の全体的な再現性を強化しました。ここで説明したプロトコル、サンプル、実験者は志向のカセットで組織を挿入するときに準備の初めにだけ操作します。閉じたら、カセットが再度開かれ、従って正しい向きの維持を確保する、手作業によるエラーの3,11を減らすことはありません。これらの 2 つの重要な手順の標準化以降の解析の全体の質の向上し、紛失しない課税サンプル、カセットの再オープンまたはサンプル3 の間違った方向にリンク両方の問題の数を減少 ,11

また、複雑な生物学的イベントは頻繁に自動化されたプロトコルの実装によって実験腸炎のマウスモデルで過小評価する線維症 (図 7) などの評価に成功しました。プロトコルの設定時に厳密に組織変更を避けるために 24 時間を超えないようにする必要があります実現した固定時間などの技術的な詳細を標準化しました。これにより後続の免疫組織化学的解析の品質を維持可能性があります我々。

自動化されたメソッドは、未処理のねずみで特に組織アーキテクチャの変更に関連付けられているパラメーターの評価を高めた。確かに、健康的な相手と病理組織の正しい比較が実験モデル3の最終的な評価のため重要です。

ティッシュの処理に関する実験室で利用できる自動化されたプロセッサで実行するさまざまなプロトコルをテストしました。ここで説明されているプロトコルは、音と非常に一貫した結果を与えた。プロトコルの時間を実施します。マウス サンプル biopsic 人間小さな標本サイズに匹敵する、短いプロトコルだった (この場合、腸) マウスを処理するのに十分な組織。最後に、全自動化されたプロシージャは合計実験時間を短縮しました。ミクロトーム切断及びスライス準備処理の初めから必要な合計時間が 5 時間を計算しました。どころか、オペレーターの技能に応じて同じプロトコルの完了手動で要求できます時間、量を 2 倍以上処理と埋め込み、特に中。手法の一つの限界は、自動化されたプロセッサと研究室で実行される埋め込みソフトを必要とすることです。

結論としては、これらの自動化されたプロトコルの実装が人間の病気のマウス実験モデルを扱うトランスレーショナル研究者の仕事を改善して大きく考えています。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

我々 は動物飼育で IEO 動物施設支援のため、テクニカル サポートのためのミラノ IRCCS ポリクリニコ病院の病理を感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10x SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1x Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

ロボット システムを使用して処理し、組織学的解析のため大腸マウス サンプルを埋め込む
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Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).More

Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

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