ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
الافتقار إلى التوحيد القياسي لتجهيز الأنسجة موريني يقلل نوعية التحليل نسيجية موريني مقارنة بالعينات البشرية. نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ دراسة نسيجية مورين الأنسجة colonic ملتهبة وأونينفلاميد لإظهار جدوى نظم الروبوتية المستخدمة بصورة روتينية لتجهيز وتضمينها العينات البشرية.
Abstract
فهم الأمراض البشرية قد اتسع إلى حد كبير بفضل دراسة نماذج حيوانية. ومع ذلك، يلزم نسيجية تقييم نماذج تجريبية دقيق الذي طبق للعينات البشرية. في الواقع، استخلاص نتائج موثوق بها ودقيقة حاسمة تتأثر بنوعية إعداد قسم الأنسجة. هنا، نحن وصف بروتوكول نسيجية تحليل الأنسجة موريني الذي يقوم بتنفيذ عدة خطوات الآلي أثناء الإجراء، من إعداد أولية لتضمين البارافين العينات موريني. يسهم في الحد المتغيرات المنهجية من خلال توحيد بروتوكول صارم من إجراءات التشغيل الآلي إلى زيادة الموثوقية العام للتحليل الباثولوجي مورين. على وجه التحديد، يصف استخدام التجهيز الآلي لهذا البروتوكول وتضمين أنظمة روبوتية، المستخدمة بشكل روتيني لمعالجة الأنسجة وتضمين البارافين العينات البشرية، لمعالجة العينات مورين من التهاب الأمعاء. نخلص إلى أن موثوقية نسيجية فحص الأنسجة مورين هو زيادة كبيرة عند إدخال تقنيات موحدة ومؤتمته.
Introduction
في العقود الأخيرة، وضعت عدة نماذج تجريبية لتشريح الآليات المسببة للأمراض المؤدية إلى الأمراض البشرية1،2. من أجل تقييم مدى خطورة المرض، يجب تقييم تأثير العلاج الباحثين ودراسة الاختلافات المعمارية الخلوية وغذائها أو مقدار التهاب3. هناك حاجة لتنفيذ تلك النماذج التجريبية، تحليلاً مفصلاً نسيجية، غالباً ما مقارنة العينات مورين والبشرية4،5.
بالإضافة إلى ذلك، عادة تجهيز العينات البشرية وسجل بالمرافق الأساسية التشريح المرضى والباثولوجيا البشرية ذوي الخبرة من خلال معايير نسيجية وأساليب موحدة. على العكس من ذلك، الأنسجة موريني هي عادة ثابتة والمضمنة وتحليلها من قبل الباحثين ذوي الخبرة المحدودة للبروتوكولات نسيجية. نوعية وموثوقية لدراسة نسيجية يبدأ بإعداد أقسام الأنسجة عالية الجودة. هناك عدة عوامل تساهم حاسمة في زيادة أو انخفاض نوعية التحليل النهائي، بما في ذلك التثبيت، العيانية تمزيقها، والتجهيز، البارافين التضمين، والتضمين من عينات6،7.
وتخضع جميع هذه المقاطع التي تنطوي على التلاعب بالعينة الأخطاء اليدوية، بما في ذلك الدمج اليدوي للعينات، وإلى حد أقل، مبضع اليدوي تمزيقها وتلطيخ. في الوقت الحاضر، تعتمد العملية برمتها من إعداد الأنسجة مورين للتقييم النسيجي على البروتوكولات التي تختلف من مختبر إلى مختبر والبروتوكولات اليدوي. والهدف من هذه الدراسة لتنفيذ بروتوكولات موحدة الآلي لتقليل الأخطاء وتقلبه في دراسة نسيجية موريني.
على حد علمنا، يصف لنا هنا البروتوكولات الأولى للأنسجة مؤتمتة بالكامل تجهيز وتضمينها للتقييم النسيجي للأنسجة مورين؛ هذه تستخدم بشكل روتيني في وحدات علم الأمراض لتحليل العينات البشرية. كمثال عملي لجدوى هذه الطريقة، نموذج موريني من التهاب الأمعاء قد تم تحليلها، أي,، النموذجي التهاب القولون المزمن الناجم عن الإدارة المتكررة من كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) في مياه الشرب8 ،9. هذا الإعداد التجريبية عن كثب يشبه التهاب الأمعاء البشرية من الأمراض (بنك التنمية بين الأمريكتين)10 منذ DSS معاملة الحيوانات يحمل علامات التهاب الأمعاء، مثلاً، فقدان الوزن، البراز فضفاضة أو الإسهال، وتقصير القولون وكذلك التليف 89،،11. كما لاحظ للبشرية بنك التنمية بين الأمريكتين المرضى، يولد العلاج مفاجآت دورة مرض معقدة. في هذا السياق، يلزم وضع تقييمات النسيجي فهم التغيير العميق لهندسة الأنسجة. وبالتالي، تنفيذ البروتوكولات وصف لزيادة جودة إعداد عينة قد تفيد الباحثين الاعتماد على تفسير النسيجي والمناعي ويحلل لإعدادات التجريبية موريني. مورين نماذج تجريبية من الأمراض البشرية التي تنطوي على التعديلات لهندسة الأنسجة، وجود ارتشاح النسيج الخلوي أو التهاب في مختلف الأنسجة والأعضاء (الأمعاء، المخ، الكبد، الجلد) يمكن استخدام زيادة نوعية إعداد نموذج لدراسة نسيجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إجراءات الحيوان كانت وافقت عليها وزارة الصحة (المصادقة 127/15، 27/13) الإيطالية واتبعت المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان للمعهد الأوروبي لعلم الأورام إياكوك (لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان مؤسسية)
1. المزمن التهاب القولون التعريفي بالإدارة المتكررة مفاجآت صيف دبي
- العمر منفصلة والجنس مطابقة الفئران في المجموعات 2 (العلاج DSS مقابل السيطرة ح2س، ليتيرماتيس الفئران على الأقل 5 كل مجموعة تجريبية).
- إدارة 2.5% DSS (كاتشين 40) في مياه الشرب 7 أيام لمجموعة العلاج والمياه للسيطرة على المجموعة.
ملاحظة: يدفع هذا النموذج التهاب الأمعاء مزمن ترانسمورال9. - بعد 7 أيام، وقف العلاج DSS وإعطاء المياه لكلا الفريقين لمدة 14 يوما. كرر هذه العملية 3 مرات.
ملاحظة: الإدارة المتكررة من مفاجآت الحث على التعديلات في الغشاء المخاطي colonic تشبه البشرية بنك التنمية بين الأمريكتين، أي، التليف9. - التضحية الفئران وفقا للإجراءات التي إذن بها IACUC المؤسسية، أي، باستنشاق أول أكسيد الكربون2 .
- فتح البطن الماوس والغشاء البريتوني مع مشرط.
ملاحظة: أوصى بالعقم ولكن لا يتطلبه. - فصل القولون من الأمعاء بالملقط وملاقط. المكوس القولون بملاقط والملقط.
ملاحظة: قياس طول القولون (الشكل 1A) أسلوب لتحديد إذا حدث التهاب القولون في الفئران المعالجة بمفاجآت صيف دبي. - شطف القولون في طبق بتري مع 10 مل من البرد 1 × الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS)، واضغط برفق لإزالة المواد البرازية.
2-مورين الأنسجة التثبيت
- تزج كل عينة القولون مورين في 10 مل من 10% محايدة مخزنة الفورمالين (NBF) في الرايت (درجة حرارة الغرفة).
ملاحظة: أوصى بالعقم ولكن لا يتطلبه. - إصلاح الأنسجة ح 18 – 24 في الرايت
3-القولون تمزيقها وإعداد الأنسجة
- إزالة الأنسجة الثابتة من الحاوية NBF بملاقط صغيرة، ووضعها في طبق بتري. وضع النقطتين على لوحة عمل تقطيع بملاقط صغيرة.
- قص نقطتين في الأجزاء (سم 0.2 إلى 0.3 سم أطوال) مع مشرط معقم. طول هذا الجزء الأمثل كي لا يتجاوز سمك الكاسيت.
- التقاط قطعة واحدة القولون بملاقط صغيرة (الشكل 2A). إدراج مقطع واحد القولون في واحدة من البلاستيك جاحظ نصائح البارافين الموجه التضمين كاسيت بملاقط صغيرة (الشكل 2).
- كرر العملية (3.2-3.3) مع أجزاء القولون 3 إضافية كل كاسيت. تجنب إدراج الشرائح في نصائح بارزة المتاخمة، للتقليل من التداخل في الأنسجة
- أحكام إغلاق الكاسيت عن طريق دفع بعناية الحواف الأربع (الشكل 2). تجنب الضغط على الأنسجة لمنع تلف الأنسجة.
- إدراج الشبكة في إطار دعم بلاستيك. قم بتسمية الإطار الداعم لتحديد العينة. كرر لكل عينة بيولوجية.
4-الأنسجة المعالجة
- قم بتشغيل المعالج التلقائي بالضغط على زر الطاقة (الشكل 3 أ، 3).
- الحارة ح 1 لضمان ذوبان شمع البارافين. الانتظار حتى يؤكد الصك ذاب تماما البارافين، ملاحظاً وجود رمز مخصص (الشكل 3).
- إدراج كل توجه كاسيت (التي تحتوي على عينات الأنسجة) يدوياً في سلة معدنية يقدمها المعالج الآلي (3D الشكل). ضع أشرطة الكاسيت عمودياً ببطانة لهم قريبة من واحدة إلى أخرى لتحسين شغل سلة.
- إغلاق سلة معدنية (3E الشكل).
- افتح غطاء المعوجة (3F الشكل). المعوجة هو المكان حيث يتم إدراج السلة في الجهاز. إدراج السلة في مساكن مخصصة للمعالج (الشكل 3). أغلق غطاء المعوجة (الشكل 3 ح).
- استخدام شاشة تعمل باللمس على الكمبيوتر أداة لتعريف البروتوكول العامل (الرقم 3I). اختر التسلسل للحلول وتوقيت ودرجة الحرارة التي ستنفذ وفقا للنظام المنصوص عليه في الجدول 1.
- تعيين البروتوكول ليتم تشغيلها في المعوجة التي تحتوي على السلة بالنقر على أيقونة كمبيوتر مخصص (3J الشكل). بدء تشغيل البروتوكول بالنقر فوق الزر ابدأ (الشكل 3 لتر).
- الانتظار حتى الصك يؤكد نهاية البروتوكول، ملاحظاً وجود رمز مخصص وسماع نغمة إنذار قادمة من الجهاز.
- قم بفتح الغطاء معوجة. إزالة السلة من المعالج (الشكل 3 م).
5-الأنسجة التضمين
- قم بتشغيل امبيدير الآلي بالضغط على زر الطاقة (الشكل 4 أ).
- الحارة ح 1 لضمان ذوبان شمع البارافين. الانتظار حتى يؤكد هذا الصك البارافين ذاب تماما بمراقبة درجة حرارة حمام البارافين يتبين من الحرارة الداخلية للصك.
- نقل جميع أشرطة الكاسيت المجهزة يدوياً من سلة المعالج إلى رف امبيدير. يمكن أن تحتوي كل حامل الأشرطة يصل إلى 32. (الشكل 4 باء، ج 4).
- افتح غطاء امبيدير الرئيسي (الشكل 4، 4 د، 4E).
- استخدام شاشة تعمل باللمس على الكمبيوتر أداة للإشارة إلى الآلية للنظام الذي رف يتم إدراجها (4F الشكل).
- افتح غطاء مدخل السكن (الشكل 4). إدراج الرف في مدخل السكن. يمكن أن تحتوي كل امبيدير على رفوف تصل إلى 4 في وقت واحد (الشكل 4 ح، 4I). أغلق الغطاء الإسكان مدخل (الرقم 4J).
- استخدام شاشة تعمل باللمس على الكمبيوتر أداة لبدء إجراء الدمج، وفقا الجدول 2 (الشكل 4 ك).
ملاحظة: يأخذ كل حامل الأشرطة 32 45 دقيقة تكون مضمنة. - الانتظار حتى الصك يؤكد نهاية البروتوكول، ملاحظاً وجود رمز مخصص (الشكل 4 لتر).
- قم بإزالة الحامل منفذ (الشكل 4 م). أغلق الغطاء امبيدير الرئيسي.
- إزالة كتل مضمن (التي تحتوي على خطوط الاتجاه) من على الرف. نقل كتل المضمنة في صندوق من الورق المقوى تخزين.
6-ميكرومتر تمزيقها
- قم بتشغيل لوحة التبريد مبضع. ضبط درجة حرارة بين-8 و-10 درجة مئوية.
- قم بتشغيل حوض ماء ترموستاتي مبضع، الذي يحتوي على 2 لتر ماء المقطر. تعيين درجة حرارة الحمام المياه بين 42-45 درجة مئوية.
- مكان البارافين تضمين كتل على لوحة التبريد. انتظر على الأقل 5 دقائق للسماح للكتل لتبرد.
- تأخذ كتلة واحدة من لوحة التبريد ووضعه داخل حامل كتلة مبضع.
- تعيين مبضع قطع سمك إلى 10 ميكرون. تقليم الكتلة بقطع عليه 6 مرات في 10 ميكرون سمك.
- تغيير إعداد سمك مبضع من 10 ميكرون إلى 3 ميكرومتر. قطع واحد 3 ميكرومتر قسم لتوضع وويوزين تلطيخ (H & E).
-
جمع القسم 3 ميكرومتر مع فرشاة صغيرة. وضع القسم 3 ميكرومتر في حوض ماء، زرعها بعناية على سطح الماء لتقليل التجاعيد الأنسجة. جمع قسم الأنسجة من حمام المياه التي تسيطر عليها حرارياً على شريحة زجاجية واحدة.
- إذا لزم الأمر، قص مقاطع إضافية.
- تسمية الشريحة الزجاجية بكتابة تحديد العينة.
- وضع الشرائح في فرن 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل.
- وضع الشرائح الزجاجية في رفوف للتحليلات الفورية أو في صناديق تخزين.
7-توضع وتلطيخ ويوزين (H & E)
- التبديل الملطخ الآلي بالضغط على زر الطاقة. السماح التهيئة للذراع الروبوتية، وعن طريق مراقبة التغيير لتحميل شريط على الشاشة أداة.
- إدراج الشرائح الزجاجية في الرف الملطخ، عمودياً إدراج شرائح يصل إلى 30.
- قم بتسمية الحامل مع علامة تعريف (RFID) تردد الراديو المناسبة البلاستيك. ونظام تحديد البروتوكول المصبوغة الصحيح تحميله إلى الكمبيوتر الملطخ علامات RFID.
- إدراج الملطخ الرف. السماح للكمبيوتر بتحميل وبدء تشغيل البروتوكول المصبوغة وفقا للاعتراف بالعلامة تتفاعل تلقائياً.
ملاحظة: البروتوكول لتلطيخ ح & ه يرد في الجدول 3-
8-المناعي تلطيخ
- أداء المناعي و Mallory trichrome تلطيخ كما هو موضح سابقا7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التجريبية التهاب القولون المزمن الناجم عن الإدارة المتكررة لإدارة السلامة والأمن في مياه الشرب نموذج موريني من التهاب الأمعاء تشبه8،بنك التنمية بين الأمريكتين البشرية9. ويصف الشكل 1 آثار العلاج إدارة السلامة والأمن، بما في ذلك القولون تقصير (الشكل 1A)، معلمة تستخدم على نطاق واسع لنقاط وجود التهاب المستحثة بمفاجآت صيف دبي، والتعبير colonic برو التحريضية الجينات بما في ذلك CXCL10 ، تنف و العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 (الشكل 1B). تسلل الخلايا التحريضية تعززت كثيرا بالعلاج مفاجآت صيف دبي، عرض توظيف للاستجابة المناعية في بروبريا الصفيحة المعوية بتحليلها من قبل سيتوفلوريميتري (الشكل 1).
ويبين الشكل 2 الأنسجة كيف colonic مقطوع وإدراجها في أشرطة الكاسيت المنحى. صممت هذه الأشرطة تحتوي على شبكة مع مقذوف نصائح، السماح إدراج الأنسجة وعمودياً مع التوجه السليم، أي، مع التجويف في الجزء الداخلي والجدار اكستيريورلي (الشكل 2 أ، 2، ج 2 ). حالما يتم إغلاق الأشرطة، يتم الاحتفاظ باتجاه الأنسجة بالشبكات، وخلافا لما يحدث مع أشرطة نسيجية التقليدية (الشكل 2).
يتم تجهيز الأنسجة مع معالج الآلي (الشكل 3 ألف-3 م و الجدول 1)، في حين التضمين هو تنفيذ الإجراء مع امبيدير الآلي (الشكل 4A-4 م و الجدول 2). في هذا الصك الأخير، روبوت يجمع أشرطة الكاسيت، ويوزع المبلغ الصحيح من البارافين. وأخيراً، باستخدام مبضع، يتم قطع المقاطع من كل كتلة البارافين. ثم يتم إعداد الشرائح لمزيد من التحليل.
يوضح الشكل 5 الممرات الرئيسية للألى ح & ه تلطيخ (الشكل 5A-5E و الجدول 3) وكيف تظهر الشرائح بعد ح & ه تلطيخ (الرقم 5F). الرقم 6 و 7 إظهار كيفية تنفيذ التجهيز الآلي وتضمين البروتوكولات بشدة زيادة نوعية تحليلات مورين colonic عينات نسيجية. ستينينجس ح & ه العينات أعد مع البروتوكولات الآلي المستمدة من الفئران غير المعالجة (الشكل 6A) قورنت تلك الفئران DSS تعامل (الشكل 6B). قيمت عشرات نسيجية بتقييم التعديلات المدخلة على المعلمات المختلفة التي تحدث في الغشاء المخاطي المعوي، بما في ذلك التهابات الخلايا التسلل وطلائي التعديلات والتغييرات في بنية الأغشية المخاطية كما هو موضح في الجدول 4. ويصور الشكل 6 ممثل ح & ه تلطيخ من الأنسجة colonic معالجتها يدوياً، وشملت في الأشرطة التقليدية. وفي الشكل 7، بالإضافة إلى ذلك أكدت جودة إعداد الأنسجة مورين والتضمين تتم من خلال الصكوك الآلي المدينة تلطيخ CD20 و Mallory trichrome المصبوغة8،9 colonic المقاطع غير المعالجة (الشكل 7 ألف، جيم 7) وتعامل DSS (7B الرقم، 7 د) الفئران.
الشكل 8 يوضح الأهمية العملية لهذا الأسلوب. تم تجهيز عينات القولون نفس وجزءاً لا يتجزأ أما يدوياً أو من خلال أساليب التلقائية. كل عينة (أما عنصر التحكم أو تعامل DSS) كان يقتطع أجزاء متساوية 2 والمجهزة بالتوازي مع الدليل أو أساليب التلقائية. ح & ه تلطيخ كان ثم تنفيذها وتقييم كامل تقنيين بشأن كافة المعلمات المرضية معالجة التغييرات في بنية الأغشية المخاطية، الحبوبية، والخلايا المناعية التسلل، سمك الأغشية المخاطية، المطروح غدي عادة لاحظت أثناء التهاب الأمعاء، وجرى تقييم لكل عينة، سواء بالنسبة للدليل والآلي البروتوكول (الشكل 8 أ والجدول 4). إعداد العينات مع البروتوكول الآلي يسمح باستمرار تقييم نسبة أعلى من غذائها معلمات الأسلوب اليدوي. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل مستقل لمعلمات نسيجية مختلفة (8B الشكل). الهندسة المعمارية والتقييم ارتشاح القاعدية كانت تأثرا إيجابيا، خاصة في الفئران غير المعالجة، بإعداد نموذج باستخدام الأسلوب الآلي.
ويمكن تطبيق الأسلوب الآلي لنموذج تجهيز والتضمين المستخدمة حاليا للتحليلات المرضية في الأنسجة البشرية بنجاح لتحليل العينات مورين. يتم إنشاء عينات ذات جودة عالية باستخدام الأسلوب الآلي الذي يوضح التفوق على الأسلوب اليدوي في تقييم الهيكل وارتشاح مأمن القاعدية للأنسجة colonic مورين.
رقم 1: تقييم التهاب الأمعاء المزمن. (أ) قياس طول القولون. (ب) التعبير Colonic برو التحريضية الجينات (cxcl10، تنف العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1) في التعامل مع إدارة السلامة والأمن (الأسود الحانات، n = 12) ودون علاج الفئران (الأبيض أشرطة، n = 6). (ج) إيمونوفينوتيبينج من colonic الصفيحة بروبريا الخلايا في التعامل مع إدارة السلامة والأمن (إغلاق الرموز، n = 12) ودون علاج الفئران (فتح الرموز، ن = 6). CD11b + Ly6G + العَدلات، CD11b + F4/80 + الضامة (اللوحة اليمنى)، خلايا CD4 + و CD8 + تي الخلايا تسلل (اللوحة اليمنى) في عناصر التحكم (فتح الرموز، n = 10) والفئران المعالجة بمفاجآت صيف دبي (مغلقة الرموز، n = 10). تم حساب الدلالة الإحصائية باستخدام أزواج مطابقة الرتبي وقع الاختبار t رتبة. p ≤ 0.05 * * p ≤ 0.01. يعني قيمة ± SEM ترد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: وصف لإعداد عينة- (أ) الأدوات اللازمة لإعداد الأنسجة وصورة كاسيت الموجه، يتألف من قبل كاسيت خارجي (أبيض) والشبكة الداخلية مقذوف توجيه النصائح. (ب، ج) إدراج نقطتين مورين في الشبكات الداخلية للكاسيت قبل (ب) وبعد الإغلاق (ج) للشبكات. ويرد في لوحة ب كاسيت الموجه (يسار) أو في كاسيت تقليدية (على يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: وصف للتجهيز الآلي. (أ وب) الآلي المعالج. (ج) رمز وصف شمع البارافين الصحيح ذوبان درجة الحرارة. (د، ه) الإدراج الكاسيت في سلة معدنية (د) والإغلاق (ه). (و، ز، ح) الإدراج لسلة معدنية في المعوجة. (أنا، ي، ك) اختيار بروتوكول المعالجة. تشغيل (L) من البروتوكول. (م) إزالة النموذج سلة المعوجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: وصف للتضمين الآلي . (أ) صورة من امبيدير الآلي. (ب، ج) إدراج الأشرطة في الرف. (د، ه) (د) افتتاح وإغلاق الغطاء (ه). (و) الإشارات إلى الجهاز لوجود رف. (ز، ح) الإدراج من على الرف في مدخل السكن. (الأول ي) إغلاق الغطاء. (ك) بداية من تضمين البروتوكول. (ل) فتح الغطاء الإسكان منفذاً. (م) إزالة النموذج رف إسكان منفذ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: وصف الآلي الملطخ ه وح. (أ) صورة حامل الشريحة. (ب، ج) إدراج صاحب الشريحة في الجهاز. (د) إغلاق الجهاز. (ﻫ) بداية البروتوكول المصبوغة. (و) اكسيمبليفيكاتيفي صورة الشريحة بعد قطع مبضع وتلطيخ ح & ه. اللوحة اليمنى، ح & ه تلطيخ يصور التوجه عينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: نموذج ستاينينجس ح & ه من عينات colonic الفئران غير المعالجة والمعالجة بمفاجآت صيف دبي- ح & ه تلطيخ غير المعالجة (A) وعينات تعامل DSS (ب) إعداد (تجهيز، مضمن، الملون) مع الآلي (أ، ب) أو يدوي (ج) الأساليب. شريط المقياس = 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: Mallory trichrome (أ، ب) وستينينجس المدينة من التسلل إلى CD20 + الخلايا (ج، د) من دون علاج (أ-ج) وتعامل DSS (ب، د) الفئران. تلوين مالوري: الأزرق، الكولاجين، وردي داكن، نوى، الأحمر الداكن، والسيتوبلازم. شريط المقياس = 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: مقارنة بين تحليل الأنسجة مع البروتوكولات اليدوي والآلي- (أ) مجموع نسيجية معلمات قابلاً في جميع أقسام أعدت مع الدليل (أشرطة بيضاء) أو الأسلوب الآلي (قضبان الأرجواني). (ب) النسبة المئوية للمعلمات المشار إليه في العينات التي أعدت مع الدليل (أشرطة بيضاء) أو باستخدام الأسلوب الآلي (قضبان الأرجواني) في الفئران المعالجة بمفاجآت صيف دبي (أشرطة المنقط) أو غير المعالجة (القضبان عادي). تم حساب الدلالة الإحصائية باستخدام أزواج مطابقة الرتبي وقع الاختبار t رتبة. ف < 0.05؛ ف < 0.005. يعني قيمة ± SEM ترد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كاشف | الوقت (دقيقة) | درجة الحرارة (درجة مئوية) | الضغط |
| NBF | 1 | RT | المحيطة |
| إيثانول 95% | 1 | RT | المحيطة |
| إيثانول 95% | 1 | RT | المحيطة |
| إيثانول 95% | 1 | RT | المحيطة |
| إيثانول مطلقة | 1 | 45 | المحيطة |
| إيثانول مطلقة | 11 | 45 | المحيطة |
| إيثانول مطلقة | 30 | RT | المحيطة |
| زيلين نفط | 1 | RT | المحيطة |
| زيلين نفط | 1 | 45 | المحيطة |
| زيلين نفط | 28 | 45 | المحيطة |
| شمع البارافين | 5 | 65 | الفراغ |
الجدول 1: الآلي بروتوكول معالجة الأنسجة.
| Perfomed العمل بالروبوت لكل كاسيت |
| إزالة كاسيت واحد من الرف |
| تحديد الكاسيت |
| الحرارة قبل العفن |
| وضع الكاسيت على القالب قبل ساخنة |
| الاستغناء عن كمية البارافين للكاسيت |
| يبرد القالب |
| تسمح البارافين ترسيخ |
| إزالة كتلة البارافين طدت من العفن |
| الوقت الحاضر كتلة لنوعية أجهزة الاستشعار |
| وضع كتلة البارافين في باب الإخراج |
الجدول 2: الآلي تضمين البروتوكول.
| الفئة | المعيار | تعريف | قيمة نقاط |
| ارتشاح الخلايا التحريضية | خطورة (كثافة الكريات البيض من منطقة بروبريا الصفيحة تسلل في تقييم هبف) | لا ارتشاح | 0 |
| الحد الأدنى الحادة (< 10%) | 0.25 | ||
| معتدل المزمن (10-25%، العَدلات متفرقة) | 0.5 | ||
| معتدلة المزمن (26 – 50%) | 0.75 | ||
| ملحوظة (> التسلل 51%، كثيفة) | 1 | ||
| مدى (التوسع في تسلل الكريات البيض) | مخاطية | 0.5 | |
| الغشاء المخاطي وسوبموكوسال | 0.75 | ||
| التغييرات طلائي | فرط تنسج (زيادة في إعداد الخلايا الظهارية في أقبية طولية، تظهر استطالة سرداب) | لا تضخم | 0 |
| الحد الأدنى (< 25%) | 0.25 | ||
| معتدل (26 – 35%) | 0.5 | ||
| المعتدل (36 – 50%، ميتوسيس في الثلث العلوي من ظهارة سرداب) | 0.75 | ||
| ملحوظة (> 51%، ميتوسيس في سرداب ظهارة بعيدة من سرداب قاعدة) | 1 | ||
| فقدان الخلية قدح (تخفيض أرقام الخلية قدح بالنسبة إلى أرقام خط الأساس خلية قدح كل سرداب) | أي خسارة | 0 | |
| الحد الأدنى (< 25%) | 0.25 | ||
| معتدل (26 – 35%) | 0.5 | ||
| المعتدل (36 – 50%) | 0.75 | ||
| ملحوظة (> 51%) | 1 | ||
| هندسة الأغشية المخاطية | قرحة (عيب الظهارية يتجاوز ماكس موسكولاريس) | لا توجد تقرحات | 0 |
| قرحة المعدة | 0.25 | ||
| تحبيب الأنسجة (إصلاح النسيج الضام مع الشعيرات الدموية الجديدة، محاطة بالتسلل إلى الخلايا، لامداده المناطق) | لا أنسجة تحبيب | 0 | |
| تحبيب الأنسجة | 0.25 | ||
| عمق و سمك الغشاء المخاطي وسرداب | لا سماكة | 0 | |
| سماكة | 0.5 | ||
| المطروح غدي | ليس المطروح | 0 | |
| المطروح | 0.5 | ||
| خلل التنسج | لا يوجد خلل التنسج | 0 | |
| خلل التنسج | 0.5 | ||
| نقاط ماكس | 6 |
الجدول 3: الآلي تلطيخ البروتوكول.
| Perfomed العمل قبل الملطخ لكل شريحة | كاشف | الوقت (s) | درجة الحرارة (درجة مئوية) |
| إسكات | 180 | 60 | |
| إسكات | 180 | 60 | |
| ديبارافينيزي | زيلين نفط | 120 | RT |
| ديبارافينيزي | زيلين نفط | 120 | RT |
| هيدرات | إيثانول 96% | 120 | RT |
| هيدرات | إيثانول 96% | 120 | RT |
| المياه والصرف الصحي | وتر المقطر | 240 | RT |
| توضع وصمة عار | توضع على كرزي | 540 | RT |
| شطف | مياه الحنفية | 360 | RT |
| ثم وصمة عار | محلول أكويوس 1% ويوزين Y | 60 | RT |
| شطف | مياه الحنفية | 120 | RT |
| يذوي | إيثانول 96% | 20 | RT |
| يذوي | إيثانول 96% | 20 | RT |
| يذوي | إيثانول مطلقة | 15 | RT |
| يذوي | إيثانول مطلقة | 15 | RT |
| واضحة | زيلين نفط | 30 | RT |
| واضحة | زيلين نفط | 30 | RT |
الجدول 4: سجل نظام لتقييم التهاب الأمعاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فنحن نستخدم مختلف الخطوات الآلي أثناء إعداد الأنسجة مورين لتحليل الأنسجة. ويهدف هذا البروتوكول توفير تلميحات التقنية لزيادة في إمكانية تكرار نتائج والتوحيد للعملية برمتها، ومن ثم تعزيز الجودة الشاملة للتقييم النهائي نسيجية. قمنا بتنفيذ الصكوك الآلي وأساليب الإعداد والتضمين من الأنسجة، وتستخدم بشكل روتيني في علم الأمراض المرافق الأساسية لدراسة العينات البشرية.
وللتدليل على إمكانية تطبيق هذا الأسلوب، اخترنا إعداد تجريبية مورين مزمنة من التهاب الأمعاء، يسمى نموذج التهاب القولون المزمن الناجم عن مفاجآت. هذا الإعداد يشبه مسار المرض المعقدة لوحظ في المرضى بنك التنمية بين الأمريكتين, التي تتطلب وضع التقييم النسيجي للتحقيق في تعديلات عميقة لهندسة الأنسجة التي تحدث عند التهاب الأمعاء المزمن. بالإجمال، التقييم النسيجي لهذه العمليات قد تستفيد كثيرا من نوعية إعداد نموذج زيادة. ملاحظة، يمكن تطبيقها هذا البروتوكول على الأنسجة موريني الأخرى (أي، الطحال، الغدد الليمفاوية، الكبد، الدماغ)، مع الفارق الوحيد هو أن الكاسيت موجها ليست هناك حاجة للأنسجة دون تجويف.
الملاحظة الأكثر أهمية هو أن هذا انخفاض الأخطاء اليدوية، (أي، التوجه للعينة) نظراً لاستخدام أشرطة الكاسيت مع الشبكات والقضاء على إعادة فتح الكاسيت للتضمين (خطوة شيوعاً التي يتم إجراؤها أثناء دليل البروتوكولات)، عززت بشدة في إمكانية تكرار نتائج العام للتحليل. مع البروتوكول الموصوفة هنا، هو التلاعب العينة فقط في بداية الإعداد، عندما يقوم المجرب إدراج الأنسجة في أشرطة الكاسيت الموجه. مرة واحدة مغلقة، يتم ابدأ إعادة فتح، وبالتالي ضمان المحافظة على الاتجاه الصحيح والحد من الأخطاء اليدوية3،11أشرطة الكاسيت. توحيد هاتين الخطوتين الحاسمة تعزيز نوعية التحاليل اللاحقة كلها، وانخفض عدد العينات المفقودة أو لا يكون قابلاً للتقييم، والمشكلات سواء المرتبطة بإعادة فتح الكاسيت أو إلى اتجاه خاطئ من العينة3 ،11.
نجحنا أيضا في تقييم حدث بيولوجية معقدة مثل التليف (الشكل 7)، التي في كثير من الأحيان التقليل في نماذج مورين من التهاب الأمعاء التجريبية، بتنفيذ البروتوكول الآلي. أثناء إنشاء البروتوكول، نحن توحيد دقة التفاصيل التقنية مثل وقت التثبيت، الذي أدرك أننا يجب أن لا تتجاوز 24 ساعة لتجنب التغييرات الأنسجة. بالقيام بذلك، يمكن أن نحافظ على نوعية التحاليل اللاحقة المناعي.
الأسلوب الآلي تحسين تقييم تلك المعلمات المرتبطة إلى تغيير بنية الأنسجة، وبخاصة في الفئران غير المعالجة. والواقع أن المقارنة الصحيحة من الأنسجة المرضية مع نظيره صحية من الأهمية بمكان للتقييم النهائي ل نموذج تجريبي3.
وفيما يتعلق بتجهيز الأنسجة، قمنا باختبار بروتوكولات مختلفة ليتم تشغيلها في المعالج التلقائي المتوفرة في المختبر. البروتوكول هو موضح هنا أعطت نتائج سليمة ومتماسكة جداً. ونحن أيضا تنفيذ طول وقت للبروتوكول. منذ مورين العينات كانت مماثلة للبشرية العينات بيوبسيك صغيرة في الحجم، بروتوكول أقصر كان كافياً لمعالجة الفاري (الأمعاء، في هذه الحالة) الأنسجة. أخيرا، الإجراء الآلي كله تخفيض إجمالي الوقت التجريبي. ابتداء من تجهيز قطع مبضع وإعداد الشرائح، حسبنا أن إجمالي الوقت المطلوب ح 5. على العكس من ذلك، اعتماداً على القدرة التقنية للمشغل، الانتهاء من نفس بروتوكولات يدوياً يمكن أن تتطلب أكثر من ضعف مقدار الوقت، لا سيما أثناء التجهيز وتضمينها. حد واحد من هذه التقنية أنه يتطلب معالجات مؤتمتة وامبيدير التي يتعين القيام بها في المختبر.
وفي الختام، نحن نعتقد أن تنفيذ هذه البروتوكولات الآلي يمكن التخفيف إلى حد كبير عمل الباحثين متعدية الجنسيات التي تتعامل مع مورين نماذج تجريبية للأمراض التي تصيب الإنسان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر إدارة علم الأمراض من مستشفى Policlinico إيرككس وميلانو للدعم التقني ومرفق IEO الحيوان للمساعدة في تربية الحيوانات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10x | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1x | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. , New York, N.S.N.Y. (2010).
- Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
Tags
علم المناعة والعدوى، العدد 143، تحليل نسيجية، نماذج مورين، التشغيل الآلي للمكاتب، تضمين النظام، والتوحيد القياسي، مورين العينات المعويةErratum
Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. An author affiliation was updated.
The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS
