ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Brist på standardisering för murina vävnad behandling minskar kvaliteten på murina histopatologisk analys jämfört med mänskliga prover. Här presenterar vi ett protokoll för att utföra histopatologisk undersökning av murina inflammerad och uninflamed colonic vävnader att Visa genomförbarheten av robotsystem som rutinmässigt används för bearbetning och inbäddning mänskliga prover.
Abstract
Förståelsen av mänskliga sjukdomar har kraftigt utökats tack vare studien av djurmodeller. Histopatologisk bedömning av experimentella modeller behöver dock vara lika rigorös som tillämpas för mänskliga prover. Tillförlitliga och korrekta slutsatser påverkas faktiskt kritiskt av kvaliteten på vävnaden avsnittet förberedelser. Här beskriver vi ett protokoll för histopatologisk analys av murina vävnader som implementerar flera automatiserade steg under förfarandet, från inledande förberedelserna till för paraffin inbäddning av murina proverna. Minskning av metodologiska variabler genom rigorösa protokoll standardisering från automatiserade procedurer bidrar till ökad övergripande tillförlitlighet av murina patologiska analys. Bestämt detta protokoll beskriver användningen av automatiserad behandling och inbäddning robotsystem, rutinmässigt används för vävnad behandling och paraffin inbäddning av mänskliga prover, för att bearbeta murina exemplar av tarminflammation. Vi dra slutsatsen att tillförlitligheten av histopatologisk undersökning av murina vävnader ökas betydligt vid införandet av standardiserade och automatiserade tekniker.
Introduction
I de sista årtiondena, har flera experimentella modeller utvecklats för att dissekera de patogena mekanismerna leder till mänskliga sjukdomar1,2. För att bedöma svårighetsgraden av en sjukdom, måste forskarna utvärdera effekten av en behandling och studera de cytologiska och histologiska arkitektoniska variationerna eller mängden inflammation3. Om du vill utföra dessa experimentella modeller, behövs detaljerade histopatologiska analyser ofta jämföra murina och mänskliga prover4,5.
Dessutom mänskliga prover vanligen behandlas och poängsätts av histopatologi corefaciliteter och erfarna mänskliga patologer genom standardiserade histopatologiska kriterier och metoder. Murina vävnader är däremot oftast fast, inbäddade och analyseras av forskare med begränsad erfarenhet av histopatologiska protokoll. Kvaliteten och tillförlitligheten av histopatologiska undersökningen börjar med utarbetandet av högkvalitativa vävnadssnitt. Flera faktorer bidrar kritiskt till öka eller minska kvaliteten på den slutliga analysen, inklusive fixering, makroskopiska snittning, bearbetning, paraffin inbäddning och inbäddning av prover6,7.
Alla dessa passager som involverar manipulering av provet utsätts för manuella fel, inklusive manuell inbäddning av proverna och, i mindre utsträckning, manuell mikrotomen snittning och färgning. För närvarande bygger hela processen av murina vävnad förberedelse för Histologisk undersökning på att variera från laboratorium till laboratorium och manuell protokoll. Målet med denna studie är att genomföra automatiserade standardprotokoll för att minska fel och variabilitet i murina histopatologisk undersökning.
Till vår kunskap beskriver vi här de första protokollen för helautomatiska vävnad behandling och inbäddning för histologisk utvärdering av murina vävnader; dessa används rutinmässigt i patologi enheter för analyser av mänskliga prover. Som ett praktiskt exempel genomförbarheten av metoden har en murin modell av tarminflammation analyserats, dvs, kronisk kolit modellen orsakas av upprepad administrering av dextran natriumsulfat (DSS) i dricksvatten8 ,9. Denna experimentella inställning nära liknar mänskliga inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) sjukdomar10 eftersom DSS-behandlade djur uppvisar tecken på tarminflammation, t.ex., viktminskning, lös avföring eller diarré och förkortning av den kolon samt fibros 8,9,11. Som observerats för mänskliga IBD patienter, genererar DSS behandling en komplex sjukdom kurs. I detta sammanhang krävs genomarbetade histologiska utvärderingar att förstå djupgående förändring av vävnad arkitekturen. Således, genomförandet av de beskrivna protokoll för att öka prov förberedelse kvalitet kan gynna forskare förlitar sig på tolkningen av histologiska och immunhistokemiska analyser för murina experimentella inställningarna. Murina experimentella modeller av mänskliga sjukdomar som involverar förändringar av vävnad arkitektur, förekomsten av cellvävnad infiltrera eller inflammation i olika vävnader och organ (tarmen, hjärnan, levern, huden) kunde använda den ökade kvaliteten på den provberedning för histopatologisk undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur förfaranden godkändes av det italienska hälsoministeriet (Auth. 127/15, 27/13) och följde djurvård riktlinjerna för Europeiska institutet för onkologi IACUC (institutionella djur vård och användning kommittén)
1. kronisk kolit induktion av repetitiva DSS Administration
- Separat ålder och kön matchade möss i 2 grupper (behandling DSS vs. kontroll H2O, minst 5 möss littermates per experimentella gruppen).
- Administrera 2,5% DSS (40 kDa) i dricksvattnet för 7 dagar till behandlingsgruppen och vatten till kontrollgruppen.
Obs: Denna modell inducerar en kronisk transmural tarminflammation9. - Efter 7 dagar, stoppa DSS behandling och ge vatten till båda grupperna i 14 dagar. Upprepa detta 3 gånger.
Obs: Upprepad administrering av DSS inducerar förändringar av kolon slemhinnan lufttrafiktjänsten mänskliga IBD, dvs fibros9. - Offra möss enligt de förfaranden som godkänts av den institutionella IACUC, dvs, av CO2 inandning.
- Öppna mus buken och peritoneum med en skalpell.
Obs: Sterilitet rekommenderas men är inte strikt krav. - Separata kolon från tunntarmen med pincett och pincett. Punktskatt tjocktarmen med pincett och pincett.
Obs: Kolon längdmätning (figur 1A) är en metod för att bestämma om kolit inträffat i DSS-behandlade möss. - Skölj kolon i en petriskål med 10 mL kallt 1 x fosfat buffert saltlösning (PBS) och tryck försiktigt ta bort fekalt material.
2. murina vävnader fixering
- Doppa varje murina kolon prov i 10 mL 10% Neutral buffrad Formalin (NBF) på RT (rumstemperatur).
Obs: Sterilitet rekommenderas men är inte strikt krav. - Fixera vävnaden för 18 – 24 h på RT.
3. kolon snittning och vävnad förberedelse
- Ta bort fasta vävnader från behållaren NBF med liten pincett och sätta dem i en petriskål. Pålagt en snittningen arbete tallrik tjocktarmen med liten pincett.
- Skär kolon i fragment (0.2 cm till 0,3 cm längder) med en steril skalpell. Detta fragment längd är optimal för att inte överstiga tjockleken på kassetten.
- Plocka upp en kolon segmentet med små pincett (figur 2A). Infoga en kolon segment i en av plast utskjutande tips av orienterad paraffinet inbäddning kassett med liten pincett (figur 2B).
- Upprepa åtgärden (3.2 – 3.3) med en ytterligare 3 kolon segment per kassett. Undvika att infoga segment i intilliggande utskjutande tips, att minimera överlappning av vävnader
- Tätt nära kassetten genom att försiktigt trycka fyra kanterna (figur 2 c). Undvik att klämma vävnaden för att förhindra vävnadsskada.
- Sätt in rutnätet i en stödjande plastram. Etikett på stödjande ramen för att identifiera provet. Upprepa för varje biologiska prov.
4. vävnad behandling
- Slå på automatiska processorn genom att trycka på strömbrytaren (figur 3A, 3B).
- Varm upp för 1 h att säkerställa paraffin vax smälter. Vänta tills instrumentet bekräftar paraffinet är helt smält, genom att observera förekomsten av ikonen dedikerad (figur 3 c).
- Sätt varje orienterade kassett (innehållande vävnadsprover) manuellt i metall korgen tillhandahållits automatiserade (figur 3D). Placera korgarna vertikalt genom att rada dem nära ena till den andra att optimera korg beläggningen.
- Stäng en lastkorg i metall (figur 3E).
- Öppna locket till retorten (figur 3F). Retorten är den plats där korgen sätts in i maskinen. Sätt in korgen i dedikerad inhysa av processorn (figur 3 g). Stäng locket av retorten (figur 3 H).
- Använda pekskärmen på instrumentet dator för att definiera arbetande protokollet (figur 3I). Välj sekvensen av lösningar, timing och temperatur skall genomföras enligt det system som avses i tabell 1.
- Tilldela protokollet som ska köras på retorten innehållande korgen genom att klicka på ikonen dedikerad dator (figur 3J). Starta protokollet genom att klicka på Start-knappen (figur 3 L).
- Vänta tills instrumentet bekräftar i slutet av protokollet, genom att observera förekomsten av ikonen dedikerad och genom att höra en alarmsignal som kommer från maskinen.
- Öppna retortens lock. Ta bort korgen från processorn (figur 3 M).
5. vävnad inbäddning
- Slå på den automatiska embedder genom att trycka på strömbrytaren (figur 4A).
- Varm upp för 1 h att säkerställa paraffin vax smälter. Vänta tills instrumentet bekräftar paraffinet är helt smält genom att observera temperaturen av paraffin bad indikeras av inre termometern av instrumentet.
- Manuellt överföra alla bearbetade kassetter från processor korgen embedder rack. Varje rack kan innehålla upp till 32 kassetter. (Figur 4B, 4 C).
- Öppna huvudsakliga embedder locket (figur 4 c, 4 D, 4E).
- Använda pekskärmen på instrumentet dator för att signalera att den robotic system som ett rack är att införas (figur 4F).
- Öppna inlopp inhysa locket (figur 4 g). Infoga racket i inlopp bostäder. Varje embedder kan innehålla upp till 4 rack samtidigt (figur 4 H, 4I). Stäng locket för inlopp bostäder (figur 4J).
- Använda pekskärmen på instrumentet datorn för att starta inbäddning förfarandet, enligt tabell 2 (figur 4 K).
Obs: Varje rack 32 kassetter tar 45 min att bäddas in. - Vänta tills instrumentet bekräftar i slutet av protokollet, genom att observera förekomsten av ikonen dedikerad (figur 4 L).
- Ta bort outlet racket (figur 4 M). Stäng locket för huvudsakliga embedder.
- Ta bort inbäddade block (innehållande orientering rutnäten) från racket. Överföra de inbäddade block i en kartong för lagring.
6. mikrometer snittning
- Slå på kyla plattan mikrotomen. Ställa in temperaturen mellan -8 och -10 ° C.
- Slå på Termostatstyrt vattenbad av mikrotom, som innehåller 2 L destillerat vatten. Ställa in temperaturen i vattenbadet mellan 42 – 45 ° C.
- Plats paraffinet inbäddade block på kyla plattan. Vänta minst 5 minuter så att blocken svalna.
- Ta ett kvarter från kyla plattan och placera den i mikrotomen block hållaren.
- Ställ in mikrotomen skär tjocklek till 10 µm. Trim blocket genom att klippa det 6 gånger på 10 µm tjocklek.
- Ändra inställningen tjocklek av mikrotomen från 10 µm 3 µm. Klipp ut en 3 µm avsnitt för Hematoxylin och Eosin (H & E) färgning.
-
Samla in avsnittet 3 µm med en liten borste. Sätta avsnittet 3 µm i vattenbad, om det noga på vattenytan att minska vävnad rynkor. Samla in avsnittet vävnad från Termostatstyrt vattenbad på en enda glasskiva.
- Om det behövs, skär ytterligare sektioner.
- Etikett i glas-bilden genom att skriva provet identifiering.
- Placera bilder i en 37 ° C ugn i minst 10 min.
- Sätta glasskivor i rack för omedelbara analyser eller i förvaringslådor.
7. hematoxylin och Eosin (H & E) färgning
- Slå på automatiska Infärgaren genom att trycka på strömbrytaren. Möjliggöra initieringen av robotarmen, genom att Observera ändringen av lastning baren på instrumentet monitorn.
- Infoga glas bilderna i Infärgaren rack, vertikalt infoga upp till 30 bilder.
- Etikett i racket med taggen lämplig radiofrekvens identifiering (RFID) plast. RFID-märkning är ett system för att identifiera rätt färgning protokollet lästs in stainer datorn.
- Infoga racket i Infärgaren. Tillåt att datorn automatiskt ladda och starta protokollet färgning enligt erkännande av RFID-taggen.
Obs: Protokollet för H & E färgning är beskrivna i tabell 3.
8. immunhistokemisk färgning
- Utföra immunhistokemiska och Mallory trikrom färgning som tidigare beskrivna7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimentell kronisk kolit framkallas genom upprepad administrering av DSS i dricksvattnet är en murin modell av tarminflammation som liknar mänskliga IBD8,9. Figur 1 beskriver effekterna av DSS behandling, inklusive kolon förkortning (figur 1A), utbredda parameter till Poäng närvaron av DSS-inducerad inflammation och colonic uttryck av pro-inflammatoriska gener inklusive CXCL10 , tnf och mcp-1 (figur 1B). Infiltration av inflammatoriska celler har ökat avsevärt genom DSS behandling, visar en rekrytering av immunsvaret i intestinal lamina propria som analyseras av cytofluorimetry (figur 1 c).
Figur 2 visar hur kolon vävnader är sektioneras och infogas i de orienterade kassetterna. Dessa kassetter är utformade för att innehålla ett rutnät med extruderad tips, att tillåta införandet av vävnaden vertikalt och med rätt orientering, dvs, med lumen i innerdelen och väggen utvärtes (figur 2A, 2B, 2 C ). När korgarna är stängda, bevaras vävnad orientering genom gallren, tvärtemot vad som händer med konventionella histologiska kassetter (figur 2B).
På vävnad behandling utförs med en automatiserad processor (figur 3A-3 M och tabell 1), medan för inbäddning ingreppet görs med ett automatiserat embedder (figur 4A-4 M och tabell 2). I det senare instrumentet, en robot samlar korgarna och doserar den rätta mängden av paraffin. Slutligen, med hjälp av en mikrotom, sektioner skärs ut från varje paraffin-block. Bilderna är då förberedda för ytterligare analys.
Figur 5 beskriver de viktigaste passagerna av de automatiserade H & E färgning (figur 5A-5E och tabell 3) och hur bilderna visas efter H & E färgning (figur 5F). Figur 6 och 7 visar hur genomförandet av automatiserad behandling och inbäddning protokoll starkt öka kvaliteten på de histopatologiska analyserna av murina colonic exemplar. De H & E infärgning av prover som tillagas med de automatisera protokoll som härrör från obehandlade möss (figur 6A) jämfördes med de av DSS behandlade möss (figur 6B). Histopatologiska noter bedömdes genom att utvärdera ändringarna av olika parametrar som förekommer i tarmslemhinnan, inklusive inflammatoriska celler infiltration, epitelial ombyggnader och förändringar av slemhinnor arkitektur som beskrivs i Tabell 4. Figur 6 c skildrar en representant H & E färgning av en colonic vävnad bearbetas manuellt och ingår i traditionella kassetter. I figur 7, bekräftades dessutom kvaliteten av murina vävnad preparatet och inbäddning utförs genom automatiserade instrument av IHC färgning av CD20 och Mallory trikrom färgning8,9 i kolon delar av obehandlad (figur 7A, 7 C) och DSS-behandlade (figur 7B, 7 D) möss.
Figur 8 beskriver den praktiska relevansen av denna metod. Samma kolon proverna var bearbetas och inbäddade antingen manuellt eller genom automatiska metoder. Varje prov (antingen kontroll eller DSS-behandlade) var skuren i 2 lika delar och bearbetas parallellt med manuellt eller automatiska metoder. H & E färgning var då utförs och en komplett mikroskopiska bedömningen att alla patologiska parametrar att ta itu med förändringar i slemhinnor arkitektur, granularitet, immunceller infiltrera, mucosal tjocklek, glandular förtunning normalt observerats under tarminflammation, bedömdes för varje prov, både för manuell och automatiserad protokoll (figur 8A och tabell 4). Beredning av proverna med automatiserade protokollet får konsekvent utvärdering av en högre andel av histologiska parametrar än den manuella metoden. Dessutom utfördes en separat analys av olika histologiska parametrar (figur 8B). Arkitekturen och basala infiltrera utvärdering påverkades positivt, särskilt i obehandlade möss, provpreparering med den automatiserade metoden.
Den automatiserade metoden för provet bearbetning och inbäddning för närvarande används för mänskliga histopatologiska analyser kan användas framgångsrikt för analys av murina exemplar. Hög kvalitet exemplar genereras med den automatiserade metoden som visar överlägsenhet över den manuella metoden i bedömningen av arkitekturen och de basala immun infiltrera av murina colonic vävnader.
Figur 1: kronisk tarminflammation utvärdering. (A) kolon längdmätning. (B) kolon uttrycket av pro-inflammatoriska gener (cxcl10, tnf, mcp-1) i DSS-behandlade (svart barer, n = 12) och obehandlade möss (vit barer, n = 6). (C) Immunophenotyping av kolon lamina propria celler i DSS-behandlade (stängd symboler, n = 12) och obehandlade möss (öppna symboler, n = 6). CD11b + Ly6G + neutrofiler, CD11b + F4 / 80 + makrofager (till vänster), CD4 + och CD8 + T celler (höger panel) infiltration i kontroller (öppna symboler, n = 10) och DSS-behandlade möss (stängd symboler, n = 10). Statistisk signifikans beräknades med hjälp av Wilcoxon matchas-par undertecknat rang t test. p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01. Menar värde ± SEM redovisas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Beskrivning av provberedning. (A) instrument krävs för vävnad förberedelse och bild av orienterad kassett, består av en yttre kassett (vit) och interna rutnät med extruderade orientering tips. (B, C) Införande av murina kolon i de interna nät av kassetten innan (B) och efter (C) nedläggning av rutnäten. I panelen B avbildas orienterad kassetten (vänster) eller i en traditionell kassett (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Beskrivning av automatiserad behandling. (A, B) automatiserad processor. (C) ikon som beskriver rätt paraffin vax smälttemperaturen. (D, E) Införande av kassetten i en lastkorg i metall (D) och dess nedläggning (E). (F, G, H) Införande av metall korg i retorten. (I, J, K) Urval av protokollet bearbetning. (L) körs i protokollet. (M) avlägsnande av formuläret korg retorten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Beskrivning av inbäddning av automatiserade . (A) bild av den automatiserade embedder. (B, C) Införande av kassetter i rack. (D, E) Öppning (D) och (E) stängning av locket. (F) signalering till maskinen av förekomsten av ett rack. (G, H) Införande av racket i inlopp höljet. (I, J) stängning av locket. (K) Start av protokollet inbäddning. (L) öppnandet av utlopp inhysa locket. (M) avlägsnande av formuläret rack outlet bostäder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Beskrivning av automatiserade H & E stainer. (A) bild av innehavaren bild. (B, C) Införande av innehavaren bild i maskinen. (D) avslutande av maskinen. (E) Start av protokollet färgning. (F) varigenom bild av en bild efter mikrotomen styckning och H & E färgning. Högra panelen, H & E färgning föreställande prov orientering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: H & E infärgning av kolon prover bilda obehandlade och DSS-behandlade möss. H & E färgning av obehandlade (A) och DSS-behandlade (B) prover beredd (bearbetade, inbäddade, målat) med automatiserad (A, B) eller manuella (C) metoder. Skalstapeln = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Mallory trikrom (A, B) och IHC infärgning av infiltrera CD20 +-celler (C, D) av obehandlade (A-C) och DSS behandlas (B, D) möss. Mallory färgning: blå, kollagen, mörkrosa, kärnor, mörkröd, cytoplasman. Skalstapeln = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: jämförelse mellan histopatologiska analyser med manuell och automatiserad protokoll. (A) totala histopatologiska parametrar taxeras i alla avsnitten beredd med manualen (vita staplar) eller med den automatiserade metoden (lila staplar). (B) andelen angivna parametrarna i de prover som framställts med manuellt (vita staplar) eller med den automatiserade metoden (lila staplar) i obehandlad (vanligt barer) eller DSS-behandlade möss (prickade staplar). Statistisk signifikans beräknades med hjälp av Wilcoxon matchas-par undertecknat rang t test. p < 0,05; p < 0,005. Menar värde ± SEM redovisas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | tid (min) | temperatur (° C) | Tryck |
| NBF | 1 | RT | omgivande |
| Etanol 95% | 1 | RT | omgivande |
| Etanol 95% | 1 | RT | omgivande |
| Etanol 95% | 1 | RT | omgivande |
| Absolut etanol | 1 | 45 | omgivande |
| Absolut etanol | 11 | 45 | omgivande |
| Absolut etanol | 30 | RT | omgivande |
| Xylen | 1 | RT | omgivande |
| Xylen | 1 | 45 | omgivande |
| Xylen | 28 | 45 | omgivande |
| Paraffinvax | 5 | 65 | vakuum |
Tabell 1: Automatiserad vävnad behandling protokoll.
| Åtgärd uppträtt av roboten för varje kassett |
| Ta bort en kassett från rack |
| Identifiera kassett |
| Pre-Värm mögel |
| Placera kassetten på förvärmda mögel |
| Dosera mängden paraffin för kassett |
| Kyla ner mögel |
| Tillåta paraffinet att stelna |
| Bort det stelnad paraffin-blocket från mögel |
| Presentera blocket att kvalitet sensorer |
| Placera det paraffin-blocket i utmatningsluckan |
Tabell 2: Automatiserad inbäddning protokoll.
| Kategori | Kriterium | Definition | Poäng värde |
| Inflammatoriska celler infiltrerar | Svårighetsgrad (leukocyt täthet av lamina propria området infiltrerat i utvärderas hpf) | Ingen infiltrera | 0 |
| Minimal akut (< 10%) | 0,25 | ||
| Mild kronisk (10-25%, utspridda neutrofiler) | 0,5 | ||
| Måttlig kronisk (26 – 50%) | 0,75 | ||
| Märkt (> 51%, tät infiltrera) | 1 | ||
| Utsträckning (utbyggnad av leukocytinfiltration) | Slemhinnor | 0,5 | |
| Slemhinnor och submukosala | 0,75 | ||
| Epitelceller förändringar | Hyperplasi (ökning i epitelial cell nummer i längsgående kryptor, synlig som crypt töjning) | Ingen hyperplasi | 0 |
| Minimal (< 25%) | 0,25 | ||
| Mild (26 – 35%) | 0,5 | ||
| Måttlig (36 – 50%, mitoser i den övre tredjedelen av kryptan epitel) | 0,75 | ||
| Märkt (> 51%, mitoser i kryptan epitel avlägsen från crypt bas) | 1 | ||
| Goblet cell förlust (minskning av goblet cell nummer i förhållande till baslinjen goblet cell nummer per kryptan) | Ingen förlust | 0 | |
| Minimal (< 25%) | 0,25 | ||
| Mild (26 – 35%) | 0,5 | ||
| Måttlig (36 – 50%) | 0,75 | ||
| Märkt (> 51%) | 1 | ||
| Slemhinnor arkitektur | Ulceration (epitelial defekt når bortom muscolaris slemhinnor) | Inga sår | 0 |
| Magsår | 0,25 | ||
| Granulationsvävnad (bindväv reparation med nya kapillärer, omgiven av infiltrera celler, hypertrophied områden) | Ingen granulationsvävnad | 0 | |
| Granulationsvävnad | 0,25 | ||
| Mucosal tjocklek och crypt djup | Ingen förtjockning | 0 | |
| Förtjockning | 0,5 | ||
| Glandular förtunning | Ingen förtunning | 0 | |
| Förtunning | 0,5 | ||
| Dysplasi | Ingen dysplasi | 0 | |
| Dysplasi | 0,5 | ||
| MAX POÄNG | 6 |
Tabell 3: Automatiserad färgning protokoll.
| Åtgärd uppträtt av Infärgaren för varje bild | Reagens | tid (s) | temperatur (° C) |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Deparaffinize | Xylen | 120 | RT |
| Deparaffinize | Xylen | 120 | RT |
| Återfukta | Etanol 96% | 120 | RT |
| Återfukta | Etanol 96% | 120 | RT |
| Tvätta | Destillerat wtaer | 240 | RT |
| Fläcken Hematoxylin | Carazzi's Hematoxylin | 540 | RT |
| Skölj | Kranvatten | 360 | RT |
| Fläcken Eosin | Eosin Y 1% aqueos lösning | 60 | RT |
| Skölj | Kranvatten | 120 | RT |
| Torka | Etanol 96% | 20 | RT |
| Torka | Etanol 96% | 20 | RT |
| Torka | Absolut etanol | 15 | RT |
| Torka | Absolut etanol | 15 | RT |
| Klart | Xylen | 30 | RT |
| Klart | Xylen | 30 | RT |
Tabell 4: Scoring system för utvärdering av tarminflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi använder olika automatiserade steg under utarbetandet av murina vävnader för histopatologisk analys. Detta protokoll syftar till att ge tekniska tips för att öka reproducerbarhet och standardisering av hela processen, vilket ökar den övergripande kvaliteten på den slutliga histopatologiska utvärderingen. Vi genomfört automatiserade instrument och metoder för beredning och inbäddning av vävnader, rutinmässigt används i patologi corefaciliteter för studiet av mänskliga prover.
För att visa de eventuella tillämpligheten av denna metod, valde vi en kronisk murina experimentella inställning av tarminflammation, kallas DSS-inducerad kronisk kolit-modell. Den här inställningen liknar komplexa sjukdomsförloppet IBD patienter, som kräver genomarbetade Histologisk undersökning att undersöka de djupgående förändringarna av vävnad arkitektur som inträffar vid kronisk tarminflammation. Histologisk utvärdering av dessa processer kan sammantaget stor nytta ökad prov förberedelse kvalitet. Observera kan detta protokoll tillämpas på andra murina vävnader (dvs, mjälte, lymfkörtlar, lever, hjärna), med den enda skillnaden är att orienterade kassetten inte behövs för vävnader utan en lumen.
Viktigaste observationen var att minskningen av manuella fel, (dvs., orientering på provet) med tanke på användningen av kassetter med galler och eliminering av kassett återöppnande för bädda in (ett steg som ofta utförs under manuell protokoll), förbättrad starkt övergripande reproducerbarheten av analysen. Med protokollet som beskrivs här, är provet manipulerad endast i början av preparatet, när experimenter infogar vävnaden i orienterad kassetter. När stängt, är kassetterna aldrig öppnas igen, vilket garanterar att rätt orientering och minska manuella fel3,11. Standardisering av dessa två kritiska steg förbättrade hela kvaliteten på de efterföljande analyserna och minskade antalet förlorade eller inte taxeras prover, problem som båda kopplade till ren-opening av kassett eller fel orientering av provet3 ,11.
Vi lyckades också utvärdera en komplexa biologiska händelse såsom fibros (figur 7), som är ofta underskattat i murina modeller av experimentella tarminflammation, genomförandet av automatiserade protokollet. Under installationen av protokollet standardiserade vi strikt tekniska detaljer såsom fixering tiden, vilket vi insåg inte överstiga 24 h för att undvika vävnad förändringar. På så sätt kan vi bevara kvaliteten på efterföljande immunhistokemiska analyser.
Den automatiserade metoden förbättrad utvärdering av de parametrar som är associerade till förändringen av vävnad arkitekturen, särskilt i obehandlade möss. Rätt jämförelse av en patologisk vävnad med en hälsosam motsvarighet är faktiskt kritiskt viktigt för den slutliga bedömningen av experimentell modell3.
Om vävnad bearbetning testade vi olika protokoll som ska köras i den automatisera processorn som är tillgängliga i laboratoriet. Protokollet beskrivs här gav ljud och mycket konsekvent resultat. Vi har också genomfört en tidslängd för protokollet. Eftersom murina prover var jämförbara med mänskliga små biopsic exemplar i storlek, ett kortare protokoll var tillräcklig för att bearbeta murin (intestinal, i detta fall) vävnader. Slutligen minskat hela automatiserade förfarandet den totala experimentella tid. Från början av behandlingen till mikrotomen styckning och skivor förberedelse beräknade vi att den totala tid som krävs är 5 h. Tvärtom, beroende på den tekniska förmågan hos operatören, kan slutförandet av de samma protokoll manuellt kräva mer än dubbelt så mycket tid, speciellt under behandling och bädda in. En gräns av tekniken är att den kräver automatiserad processorer och embedder ska utföras för att vara i laboratoriet.
Sammanfattningsvis anser vi att genomförandet av dessa automatiserade protokoll kraftigt kunde lindra translationell forskare behandlar murina experimentella modeller av mänskliga sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Institutionen för patologi IRCCS Policlinico sjukhuset, Milano för teknisk support och IEO djur anläggningen för bistånd i djurhållning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10x | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1x | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. , New York, N.S.N.Y. (2010).
- Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
Tags
Immunologi och infektion fråga 143 histopatologisk analys murina modeller automation inbäddning system standardisering murina intestinal exemplarErratum
Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. An author affiliation was updated.
The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS
